劉媛，陳潔，孫輝，許苑南，馬志強(qiáng)，劉向芳，劉夢(mèng)醒，劉幸*

(1.昆明市第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650041;2普洱學(xué)院，云南 普洱 665000)

貓爪草系毛茛科植物小毛茛(RanunculusternatusThunb.)的干燥塊根，其性溫、味甘、辛，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止咳去痰之功效[1]。臨床應(yīng)用貓爪草治療肺結(jié)核和淋巴結(jié)核有較好的療效，具有廣闊的應(yīng)用前景[2-3]。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2019年全球結(jié)核病報(bào)告》顯示全球新增結(jié)核病(tuberculosis，TB)患者為1000萬人，死亡率達(dá)到25%，處于所有傳染性疾病首位[4-5]。隨著近年來耐藥TB的感染率逐步上升及一線新的抗TB藥物的匱乏，導(dǎo)致TB的防治任務(wù)變得越來越艱巨。因此，發(fā)掘和充分利用中草藥治療TB，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)發(fā)展的迫切需求。Feng等[6]從貓爪草根中提取了5種新的雜環(huán)化合物，這些化合物的結(jié)構(gòu)與一些抗結(jié)核藥物的結(jié)構(gòu)相似。周勇等[7]研究發(fā)現(xiàn)，貓爪草可能通過提高顆粒裂解肽的表達(dá)，進(jìn)而提高患者抗結(jié)核桿菌的能力，達(dá)到治療效果。楊牧之等[8]通過體外實(shí)驗(yàn)表明，貓爪草多糖可通過激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活力和吞噬功能，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。以上研究表明，貓爪草及其有效成分具有抑菌、調(diào)節(jié)免疫力等作用，治療TB療效確切。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特征，通過調(diào)控多通路發(fā)揮其療效，但目前對(duì)貓爪草治療TB的機(jī)制多從單一成分或單一靶點(diǎn)進(jìn)行研究。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過建立成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路多層次網(wǎng)絡(luò)模型，分析貓爪草治療TB的成分、作用靶點(diǎn)及調(diào)控通路的信息，從整體角度研究貓爪草治療TB的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為臨床用藥提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 貓爪草的活性化合物及相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[9]，以“貓爪草”為關(guān)鍵詞檢索貓爪草的化學(xué)成分。根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18 的2個(gè)ADME屬性值作為篩選貓爪草潛在活性化合物及其作用靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。由于檢索到的藥物靶點(diǎn)存在命名不規(guī)范等問題，本研究利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫輸入蛋白名稱并限定“Specie”為“Homo Sapiens”，校正靶點(diǎn)蛋白為規(guī)范的基因名稱。

1.2 TB相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“tuberculosis”為關(guān)鍵詞，挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中治療TB的潛在靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，評(píng)分(Score值)越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系密切。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明晰貓爪草相關(guān)靶點(diǎn)與TB靶點(diǎn)間的相互作用，利用VENNY2.1軟件將二者靶點(diǎn)取交集并繪制維恩圖[12]。進(jìn)而將交集靶點(diǎn)傳至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型[13]，選擇“multiple proteins”，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”進(jìn)行檢索，設(shè)置為評(píng)分≥0.9，以提高生物信息的可信度，通過以上信息的處理導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。下載tsv文件，保留節(jié)點(diǎn)(node1，node2)和結(jié)合率評(píng)分信息，并導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.0軟件，分析靶點(diǎn)相關(guān)的拓?fù)鋮?shù)。

1.4 GO和KEGG通路富集分析

運(yùn)用DAVID(the database for annotation,visualization and integrated discovery)6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)對(duì)貓爪草和TB共同作用得到的交集基因進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)分析。將所涉及潛在靶點(diǎn)基因參與的生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、細(xì)胞成分(cellular component, CC)三方面進(jìn)行GO(gene ontology)分析[14]。以P<0.05 為閾值，將其按P值升序進(jìn)行排序，并將結(jié)果以氣泡圖形式輸出。交集基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，根據(jù)P值篩選顯著性高的通路，設(shè)置P<0.05，選取最顯著的10個(gè)通路。

1.5 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路構(gòu)建

基于藥物-成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路，運(yùn)用Cytoscape構(gòu)建藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)KEGG通路富集分析結(jié)果所選取的主要信號(hào)通路，同時(shí)與參與相關(guān)通路的靶點(diǎn)建立聯(lián)系，并與成分-靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系整合并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中，從而得到成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

通過PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載貓爪草的活性成分分子結(jié)構(gòu)SDF格式文件，并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB文件。通過從Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)中檢索獲得靶蛋白BAX(PDBID: 4BD6)、BCL2(PDBID: 5JSN)、CASP3(PDBID: 2J32)、CASP8(PDBID: 4PS1)、CASP9(PDBID: 3V3K)。運(yùn)用AutoDock 軟件研究活性成分與靶點(diǎn)之間的分子對(duì)接可能，結(jié)果以親和能的形式輸出，通過計(jì)算受體(靶點(diǎn))-配體復(fù)合物(活性成分)的空間效果、排斥作用、氫鍵、疏水相互作用以及分子的靈活性等值綜合打分，評(píng)估其親和力，最終得出親和能打分。親和能是衡量配體是否能與受體分子有效結(jié)合的重要指標(biāo)，能值越低，表明二者的結(jié)合效果越好。

2 結(jié)果

2.1 貓爪草的活性化合物及相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP共檢索到貓爪草中有效化合物79種。經(jīng)ADME篩選出活性化合物12種，相關(guān)信息見表1。通過UniProt數(shù)據(jù)庫找出化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶基因名稱，物種限定為“Homo sapiens”，去除重復(fù)的基因，共獲得40個(gè)靶點(diǎn)基因，相關(guān)信息見表2。

表1 貓爪草化合物信息特征表

表2 貓爪草潛在靶點(diǎn)

2.2 TB相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索“tuberculosis”，獲得TB靶點(diǎn)2378個(gè)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定評(píng)分大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為TB的潛在靶點(diǎn)，評(píng)分最大值為48.97，最小值為0.14，中位數(shù)為1.15，故設(shè)定評(píng)分大于1.15的靶點(diǎn)為TB的潛在靶點(diǎn)，最終得到1187個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選的貓爪草活性成分靶點(diǎn)與TB靶點(diǎn)取交集，并通過VENNY 2.1軟件繪制維恩圖，得到貓爪草成分-TB共同靶點(diǎn)10個(gè)，分別為：ADRB2、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、LTA4H、NR3C2，見圖1。進(jìn)而將靶點(diǎn)提交至STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，構(gòu)建貓爪草-TB靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。有4個(gè)靶點(diǎn)因?yàn)闆]有與網(wǎng)絡(luò)相聯(lián)系，故剔除，分別為ADRB2、OPRM1、LTA4H、NR3C2。該網(wǎng)絡(luò)包括6個(gè)節(jié)點(diǎn)，14條邊。圖中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)內(nèi)部的螺旋結(jié)構(gòu)表示該基因的三圍結(jié)構(gòu)，邊表示靶點(diǎn)間的互作關(guān)系。度值越大則節(jié)點(diǎn)越大，平均度值為4.67。圖表顯示貓爪草治療TB的靶點(diǎn)中度值排名前6的為CASP3、CASP8、CASP9、BAX、BCL2、JUN，說明這些基因在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了相對(duì)重要的作用，成為網(wǎng)絡(luò)中聯(lián)通其他節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，見表3。

注：紫色代表TB靶點(diǎn)；黃色代表貓爪草靶點(diǎn)；深黃色部分為共同靶點(diǎn)。圖1 貓爪草-TB共同基因靶點(diǎn)數(shù)Fig.1 Number of overlapping target genes between Ranunculi Ternati Radix and TB

圖2 貓爪草-TB靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network of Ranunculi Ternati Radix-TB targets

表3 貓爪草與TB共有靶點(diǎn)的分析

2.4 GO和KEGG通路富集結(jié)果與分析

運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)貓爪草治療TB的靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析(P<0.5)，分別從BP、MF、CC這三個(gè)方面進(jìn)行。貓爪草治療TB的GO基因富集分析根據(jù)校正后P值進(jìn)行排序，共得到GO條目8個(gè)。以BP結(jié)果較多，BP主要與凋亡過程的調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)紫外線的應(yīng)答等有關(guān)，將結(jié)果進(jìn)行氣泡圖展示，見圖3。

圖3 貓爪草潛在靶點(diǎn)GO富集分析Fig.3 Analysis of GO enrichment of potential targets of Ranunculi Ternati Radix

為進(jìn)一步探究貓爪草的作用靶點(diǎn)在生物信號(hào)通路層面的機(jī)制，將交集靶點(diǎn)基因與KEGG 通路進(jìn)行映射，根據(jù)校正后P值篩選前10條通路，見表4。結(jié)果表明貓爪草的信號(hào)通路包括癌癥通路、凋亡、HIV-1病毒感染、EB病毒感染、乙肝、麻疹、結(jié)核病、p53信號(hào)通路、單純皰疹病毒感染、沙門氏菌感染。由上述KEGG富集結(jié)果分析可知，貓爪草與TB、凋亡等相關(guān)信號(hào)通路有較密切聯(lián)系，其中主要的活性靶點(diǎn)為CASP8、BAX、BCL2、CASP9、CASP3，這表明貓爪草可能通過影響細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮治療TB的作用[15]，見圖4。

表4 KEGG富集分析結(jié)果

注：粉紅色代表貓爪草活性靶點(diǎn)圖4 TB信號(hào)通路Fig.4 Signaling pathway involving TB development

注：藍(lán)色代表貓爪草活性成分；粉紅色代表潛在靶點(diǎn)；綠色代表信號(hào)通路圖5 貓爪草治療TB成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路Fig.5 Ranunculi Ternati Radix in the treatment of TB: components-target-signaling pathway

2.5 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建貓爪草活性成分-作用靶點(diǎn)-代謝通路網(wǎng)絡(luò)。圖中包括貓爪草活性成分12種，TB與貓爪草交集靶點(diǎn)10 個(gè)，信號(hào)通路10條。篩選出的貓爪草候選活性成分的作用靶點(diǎn)分布在不同的信號(hào)通路，相互協(xié)調(diào)，通過調(diào)控不同的信號(hào)通路發(fā)揮治療TB的作用，結(jié)果見圖5。成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)顯示，預(yù)測(cè)出貓爪草治療TB的12種潛在活性成分與BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3及CASP8等靶點(diǎn)存在較強(qiáng)的相互作用，通過KEGG富集分析顯示這些靶點(diǎn)主要集中在TB、凋亡、癌癥、p53 等相關(guān)信號(hào)通路。該成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路圖體現(xiàn)了貓爪草多成分-多靶點(diǎn)-多途徑調(diào)節(jié)TB的特點(diǎn)，這一特點(diǎn)與中藥治療疾病的系統(tǒng)性與整體性相統(tǒng)一。

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

12種活性化合物與5個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果見表5，親和能能值越低表示配體與受體結(jié)合更好。從各成分的親和能來看，Stigmasta-4,6,8、vittadinoside_qt、Stigmasterol、poriferasterol monoglucoside_qt、Sitosteryl acetate、 bate-sitosterol的分值較低，可能是影響細(xì)胞凋亡的重要成分，從而發(fā)揮抗結(jié)核作用。從各靶點(diǎn)的親和能來看，BAX、CASP3和CASP9是這些成分共同發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)。另外，Truflex OBP和 Mandenol在對(duì)接中分值較高，表明其與TB相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合較低，可能影響細(xì)胞凋亡的作用較弱。

表5 貓爪草活性成分與5個(gè)靶點(diǎn)作用情況(親和能)

選取與每個(gè)靶點(diǎn)蛋白親和力最強(qiáng)的化合物，做出化合物與蛋白結(jié)合圖，可直觀觀察活性化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合模式以及與周圍氨基酸殘基的相互作用，結(jié)果見圖6。

受體蛋白BAX與Stigmasta-4,6,8配體小分子之間的結(jié)合模式見圖6(a)，氨基酸殘基Leu70、Leu76、Met79、Ile80、Val83、Val91、Arg94、Val95、Asp98、Met99、Phe116、Ala112、Tyr115與Stigmasta-4,6,8配體小分子形成疏水相互作用。

受體蛋白BCL2與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子之間的結(jié)合模式見圖6(b)，氨基酸殘基Leu137、Glu136、Arg146與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Arg139、Asp140、Asn143、Ala149、Gly145、Val148、Phe198、Leu201、Tyr202、Ala100、Arg107、Tyr108、Phe104與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子形成疏水相互作用。

受體蛋白CASP3與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子之間的結(jié)合模式見圖6(c)，氨基酸殘基Asp211、Asn208、Trp214、Phe250、Glu248與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Ser209、Arg207、Thr62、Cys163、Phe256、Trp206、Ser249與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子形成疏水相互作用。

受體蛋白CASP8與Stigmasterol配體小分子之間的結(jié)合模式見圖6(d)，氨基酸殘基Gln358與Stigmasterol配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Asp266、Leu270、Thr273、Leu277、Phe274、Ile311、Cys309、Val354、Phe356與Stigmasterol配體小分子形成疏水相互作用。

受體蛋白CASP9與Stigmasterol配體小分子之間的結(jié)合模式見圖6(e)，氨基酸殘基Val379、Ser378、Met386、Phe334、Phe337、Asp291、Gly293、Phe294、Lys384、Val296、Ser298與Stigmasterol配體小分子形成疏水相互作用。

注：粉紅色分子為配體化合物(活性化合物)圖6 貓爪草成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接Fig.6 Molecular docking between components of Ranunculi Ternati Radix and the targets

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步探討了貓爪草治療TB的作用機(jī)制，篩選其活性成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)生物學(xué)通路。貓爪草活性成分Stigmasta-4,6,8、vittadinoside_qt、Stigmasterol、poriferasterol monoglucoside_qt、Sitosteryl acetate、bate-sitosterol等可能通過TB、凋亡、p53信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路作用于CASP3、CASP8、CASP9、BAX、BCL2等靶點(diǎn)而起到抗結(jié)核作用。TB是一種嚴(yán)重的慢性傳染病，主要由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起[16]。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體時(shí)就是巨噬細(xì)胞殺菌和MTB逃逸的斗爭過程[17-18]。巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡后可殺死MTB，阻止MTB在體內(nèi)增殖，但MTB也可通過一系列機(jī)制有效阻斷巨噬細(xì)胞的凋亡，以逃逸巨噬細(xì)胞的殺傷而在體內(nèi)長期存活。因此，巨噬細(xì)胞的凋亡在抗MTB的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，抑制巨噬細(xì)胞的凋亡是MTB逃逸的重要途徑[19]。目前研究表明，MTB影響巨噬細(xì)胞凋亡的途徑有Caspase酶系列途徑、BCL2途徑、NF-κB途徑等，主要與CASP3、CASP8、CASP9、BAX、BCL2等相關(guān)。王健宏等[20]研究結(jié)果表明，MTB的重要毒力因子ESAT6可激活Caspase通路中的CASP1、CASP3、CASP5、CASP7、CASP8，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡，這個(gè)過程往往與MTB的毒力密切相關(guān)。BCL2是一種具有延長細(xì)胞生存時(shí)間和抗細(xì)胞凋亡的蛋白，當(dāng)MTB感染巨噬細(xì)胞后，可促進(jìn)RIPK3和BCL2轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，抑制CASP8的活化和細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)細(xì)胞壞死而讓自身存活[21]。Zhang等[22]認(rèn)為MTB毒力因子Rv3033能通過抑制線粒體凋亡相關(guān)蛋白BAX進(jìn)入線粒體，從而阻止巨噬細(xì)胞內(nèi)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在凋亡。因此，MTB可通過多條途徑對(duì)巨噬細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控，以逃逸免疫系統(tǒng)的清除作用。

同時(shí)，F(xiàn)ang等[23]的研究表明，貓爪草的提取物可以激活在細(xì)胞凋亡執(zhí)行過程中起至關(guān)重要作用的CASP7、CASP8和CASP9。周玲玉[24]的研究結(jié)果顯示貓爪草活性成分β-谷甾醇可以上調(diào)BAX表達(dá)和下調(diào)BCL2表達(dá)而引起細(xì)胞的凋亡。結(jié)合本研究通過PPI、GO及KEGG分析得到的結(jié)果，可初步認(rèn)為貓爪草活性化合物可能通過調(diào)控CASP3、CASP8、CASP9、BAX和BCL2等，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡，起到抗結(jié)核的作用。在分子對(duì)接中，本研究發(fā)現(xiàn)Stigmasta-4,6,8、vittadinoside_qt、Stigmasterol、poriferasterol monoglucoside_qt、Sitosteryl acetate、 bate-sitosterol具有較好的親和力，這些主要成分對(duì)應(yīng)的重要靶點(diǎn)CASP3、CASP9、BAX是細(xì)胞凋亡過程的重要環(huán)節(jié)。由此，推測(cè)貓爪草可能作用于細(xì)胞凋亡通路發(fā)揮抗結(jié)核作用。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度出發(fā)，初步闡述了中藥貓爪草治療TB的潛在活性成分、可能作用的靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的關(guān)鍵信號(hào)通路。目前貓爪草治療TB的作用機(jī)制鮮少報(bào)道，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法對(duì)貓爪草治療TB的藥效機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，可為深入研究其作用機(jī)制和臨床應(yīng)用提供方向與思路。