梅明，周進(jìn)，張毅，馬良鵬，楊明，胡松*

(1.武漢市第一醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 武漢 430030；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004)

菝葜為百合科植物菝葜的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹與解毒散瘀的功效[1-2]，始載于《名醫(yī)別錄》，現(xiàn)收載于《中國藥典》2015版一部[3]。實(shí)驗(yàn)研究表明，菝葜有效成分為皂苷、黃酮、有機(jī)酸及多糖等，其總提取物有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗感染、降血糖及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，臨床上廣泛用于婦科慢性疾病的治療，如慢性盆腔炎、附件炎等[4]。目前關(guān)于菝葜有效成分的研究主要集中在皂苷類與黃酮類成分，然而近年來多糖類成分越來越被人們所重視，且有報(bào)道表明菝葜多糖具有明顯的免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]，這為開展菝葜多糖類成分的研究提供了依據(jù)。本文對菝葜多糖進(jìn)行了醇沉工藝與大孔吸附樹脂純化工藝研究，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

FA1104型萬分之一電子天平(上海天平儀器廠)；Mettler AE240型十萬分之一電子天平(德國Mettler公司)；UV-1700型紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)； KQ3200型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SZ93型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；DZF6020型減壓干燥箱(上海喬躍電子有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

無水葡萄糖對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110833-201205，純度≥99%)；菝葜(批號121028)購于四川新荷花飲片有限公司，由成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為百合科植物菝葜的干燥根莖；HPD-100型、D101型大孔吸附樹脂(成都市科龍化工試劑廠，批號分別為20130305、20120305)，AB-8型大孔吸附樹脂(南開大學(xué)化工廠，批號030605)；甲醇、濃硫酸、苯酚等均為分析純(成都市科龍化工試劑廠)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 菝葜多糖的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取已在105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品10.3 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加純水定容，制成含無水葡萄糖0.103 mg/ mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

稱取菝葜藥材適量，加入10倍量的體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，水浴回流3次，每次1.5 h，濾過，殘?jiān)谒∩蠐]干，然后加12倍量的純水，提取3次，每次提取2 h，提取溫度為80 ℃，定容，即得提取液，備用。

2.1.3 線性關(guān)系考察

以空白溶劑為隨行對照，精密量取2.1.1項(xiàng)下對照品溶液適量，在波長200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在490 nm處有特征吸收峰，確定檢測波長為490 nm。分別精密吸取0.50、0.60、0.70、0.80、0.90與1.00 mL對照品溶液，分別置于10 mL具塞試管中，精密加水分別補(bǔ)至2.00 mL，各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸7 mL，搖勻，放置10 min，置40 ℃水浴中保溫15 min，取出，冰浴5 min，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑作為空白，在490 nm波長處測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程，回歸方程為：y=14.89x-0.029(r=0.999)，結(jié)果表明，無水葡萄糖在0.026～0.052 mg/mL范圍內(nèi)樣品質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 醇沉工藝研究

2.2.1 醇沉靜置溫度考察

取菝葜多糖水提液適量，減壓濃縮至每毫升水提液含生藥1.0 g，備用。量取3份濃縮液，加入乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，分別于25、8與2 ℃ 條件下，靜置12 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，分別得多糖粗品，計(jì)算多糖出膏率并測定多糖純度[7-9]，結(jié)果見表1。

表1 靜置溫度考察

結(jié)果表明，25、8和2 ℃靜置效果沒有較大差異，故采用室溫25 ℃靜置醇沉即可。

2.2.2 醇沉靜置時(shí)間考察

精密量取4份濃縮液，各50 mL，加入乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，于室溫25 ℃條件下，分別靜置6、12、24與48 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，分別得多糖粗品，計(jì)算多糖出膏率并測定多糖純度，結(jié)果見表2。

表2 靜置時(shí)間考察

結(jié)果表明，隨著靜置時(shí)間的延長，多糖純度與多糖出膏率逐漸增加，靜置12 h即可達(dá)到較理想效果，結(jié)合工業(yè)擴(kuò)大生產(chǎn)實(shí)際考慮，確定醇沉靜置時(shí)間為12 h。

2.2.3 藥液質(zhì)量濃度考察

取4份菝葜多糖水提液，分別稀釋或濃縮至每毫升水提液含生藥0.5、0.8、1.0、1.2 g的藥液，加入乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，室溫靜置12 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，分別得多糖粗品，計(jì)算多糖出膏率并測定多糖純度，結(jié)果見表3。

表3 提取液生藥質(zhì)量濃度考察

結(jié)果表明，當(dāng)生藥質(zhì)量濃度為1.0 g/mL時(shí)，醇沉效果較好。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察

精密量取4份濃縮液各50 mL，加入乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到60%、70%、80%、90%，室溫靜置12 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，分別得多糖粗品，計(jì)算多糖出膏率并測定多糖純度，結(jié)果見表4。

表4 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察

結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，多糖純度與多糖出膏率均較為理想，因此，確定菝葜多糖的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.2.5 醇沉次數(shù)考察

精密量取3份濃縮液各50 mL，加入乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到80%，分別醇沉1、2、3次，室溫靜置12 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，分別得多糖粗品，計(jì)算多糖出膏率并測定多糖純度，結(jié)果見表5。

表5 醇沉次數(shù)考察

結(jié)果表明，隨著醇沉次數(shù)的增加，多糖純度略有升高，但多糖出膏率呈下降趨勢，綜合考慮多糖純度、多糖得率等，確定最佳醇沉次數(shù)為1次。

2.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

綜合前述實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果，確定最佳醇沉工藝為將提取液濃縮至每毫升含生藥1.0 g，加入乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，醇沉1次，室溫25 ℃靜置12 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，即得，3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，多糖醇沉后平均純度為51.77%，平均出膏率為2.12%，結(jié)果較為穩(wěn)定，說明該醇沉工藝穩(wěn)定可行。

2.3 大孔吸附樹脂純化工藝研究

2.3.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理

2.3.2 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附與解吸考察

準(zhǔn)確稱取已被預(yù)處理過的AB-8型、HPD100型、D101型大孔吸附樹脂各2 g，置錐形瓶中，分別加入2.0 mg/mL的菝葜粗多糖溶液50 mL，于20 ℃恒溫條件下，置磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?4 h，充分吸附后，測定殘液中多糖質(zhì)量濃度，并計(jì)算吸附量與吸附率。再將上述經(jīng)過靜態(tài)吸附的大孔吸附樹脂，置于具塞的錐形瓶中，各加入50 mL蒸餾水，20 ℃恒溫條件下，置磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?4 h，過濾，測定解吸殘液中多糖質(zhì)量濃度，并計(jì)算解吸率。計(jì)算公式如下：吸附率=(C0-C1)/C0×100%，解吸率=C2V2/(C0-C1)V1×100%，式中，C0為吸附液初始質(zhì)量濃度，C1為吸附后質(zhì)量濃度，C2為解吸殘液質(zhì)量濃度，V1為加入粗多糖溶液體積，V2為加入蒸餾水體積，結(jié)果見表7。

表7 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附率及解吸率結(jié)果

結(jié)果表明，相比HPD100型與D101型大孔吸附樹脂，AB-8型對菝葜多糖的吸附率與解吸率均較高，故選擇AB-8型對菝葜多糖進(jìn)行純化。

2.3.3 上樣液質(zhì)量濃度考察

準(zhǔn)確稱取3份已被預(yù)處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱，配制1.0、2.0與4.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液，按2 BV/h的流速，上樣1 BV，以2 BV/h的流速用純水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度并計(jì)算吸附率，結(jié)果表明上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，多糖吸附率較大，因此確定上樣質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，見圖1。

圖1 上樣質(zhì)量濃度考察結(jié)果Fig.1 Investigation result of sample concentration

2.3.4 上樣流速考察

準(zhǔn)確稱取5份已被預(yù)處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液1 BV，分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進(jìn)行上樣，以2 BV/h的流速用純水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度并計(jì)算吸附率。結(jié)果多糖吸附率分別為65.3%、70.2%、67.1%、61.3%與55.2%，表明過大或過小的上樣流速都不利于多糖吸附，綜合考慮確定以2 BV/h的流速進(jìn)行上樣。

2.3.5 上樣量考察

準(zhǔn)確稱取5份已被預(yù)處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液，以2 BV/h的流速進(jìn)行上樣，分別上樣1、2、3、4、5 BV，再用純水以2 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度并計(jì)算吸附率，結(jié)果見表8。

表8 上樣量考察結(jié)果

結(jié)果表明，上樣量為1 BV時(shí)，多糖吸附率較大，因此確定上樣量為1 BV。

2.3.6 洗脫溶劑考察

準(zhǔn)確稱取5份已被預(yù)處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液，按2 BV/h的流速，上樣1 BV，再分別用純水、10%乙醇、15%乙醇、30%乙醇與40%乙醇以2 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定吸光度值，結(jié)果見表9。

表9 洗脫溶劑考察結(jié)果

結(jié)果表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，洗脫效率反而降低，因此，確定洗脫溶劑為純水。

2.3.7 洗脫速率考察

準(zhǔn)確稱取5份已被預(yù)處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液，按2 BV/h的流速，上樣1 BV，再分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速，用純水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度并計(jì)算解吸率，結(jié)果表明洗脫速率對多糖解吸率有一定影響，當(dāng)洗脫速率為3 BV/h時(shí)，解吸率大，因此，確定洗脫速率為3 BV/h，見圖2。

圖2 洗脫速率考察結(jié)果Fig.2 Investigation result of elution rate

2.3.8 洗脫溶劑用量考察

準(zhǔn)確稱取5份已被預(yù)處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液，按2 BV/h的流速，上樣1 BV，以3 BV/h的流速用純水進(jìn)行洗脫，每1 BV收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度并計(jì)算解吸率，結(jié)果表明洗脫劑用量為3 BV時(shí)，多糖已能充分洗脫，因此綜合考慮時(shí)間等因素，確定洗脫劑用量為3 BV，見圖3。

圖3 洗脫溶劑用量考察結(jié)果Fig.3 Investigation result of elution amount

2.3.9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取3份已被預(yù)處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液，按2 BV/h的流速，上樣1 BV，以3 BV/h的流速用3 BV的純水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度。再精密吸取一定體積的洗脫液置恒重后的蒸發(fā)皿中，減壓濃縮至一定體積，70 ℃干燥，在干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱重，計(jì)算多糖純度，結(jié)果見表10。

表10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，大孔吸附樹脂純化后，多糖平均純度為60.48%，平均得率為1.03%，工藝穩(wěn)定可行，可用于菝葜多糖的分離純化。

3 討論與結(jié)論

大孔吸附樹脂分離技術(shù)能從中藥及其復(fù)方提取液中通過物理吸附有選擇性地吸附有效成分，從而對中藥中有效部位或有效成分實(shí)現(xiàn)分離、純化和富集[17-18]。多糖作為菝葜中的主要活性成分之一，對其分離純化工藝的研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)通過對菝葜多糖醇沉工藝與大孔吸附樹脂純化工藝的研究，確定了菝葜多糖的最佳純化工藝。通過對醇沉靜置溫度、醇沉靜置時(shí)間與藥液質(zhì)量濃度等因素的考察，優(yōu)化醇沉工藝，使菝葜多糖的純度達(dá)到了51.77%；通過大孔吸樹脂種類、上樣液濃度與洗脫溶劑等因素的考察，優(yōu)化大孔樹脂純化工藝，將菝葜多糖的純度提高到了60.48%。以上研究使純化后的菝葜多糖符合《藥品注冊管理辦法》[19]中關(guān)于中藥注冊申報(bào)的相關(guān)要求，為菝葜藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。