左文明，李錦萍，李彩明，王虹雨，劉力寬*，曾 陽,2*

1青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810008；2高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，西寧 810008

橢圓葉花錨(HaleniaellipticaD.Don)為龍膽科(Gentianaceae)花錨屬(Halenia)植物，性味苦寒，全草入藥，藏醫(yī)藥系統(tǒng)常用于治療肝膽系統(tǒng)疾病[1]。臨床用于治療肝炎等“協(xié)日”和“熱”過剩所致疾病。橢圓葉花錨雖然在臨床已得到使用，并且橢圓葉花錨對治療肝炎、實(shí)驗(yàn)性肝損傷確有療效已被證實(shí)[2]。但關(guān)于其抗肝炎的文獻(xiàn)報(bào)道卻不多，作用機(jī)制更尚不清楚，因此需要進(jìn)一步研究，明確其作用機(jī)制，為藏藥的發(fā)展及利用提供理論依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興的藥理學(xué)分支學(xué)科，以系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)基本理論為基礎(chǔ)，通過利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫和算法進(jìn)行深度挖掘、分析和整理匯總，從而構(gòu)建藥物作用于疾病的靶點(diǎn)及機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，因此，特別適合于中藏藥這種組分多、作用靶點(diǎn)多及作用途徑復(fù)雜的藥物作用機(jī)制研究[3-5]。本研究擬利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，探究橢圓葉花錨抗肝炎的潛在作用機(jī)制，并篩選出其活性成分及其作用靶點(diǎn)，以期為橢圓葉花錨抗肝炎藥理作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Xevo G2-XS QTof液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS T3(100×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱(美國Waters公司)；Secura513-1CN精密天平(德國賽利多斯)；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)；N1200BV-W小型濃縮系統(tǒng)(日本東京理化器械株式會社)；Eyela CA-1115B冷卻水循環(huán)裝置(日本東京理化器械株式會社)；Eyela FDU-2110冷凍干燥機(jī)(日本東京理化器械株式會社)；Milli-Q超純水儀(美國密理博)，5810R臺式高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德)。

甲醇、乙腈、甲酸為質(zhì)譜級(美國Fisher公司)；氫氧化鈉(ACS級)(美國Sigma公司)；亮氨酸腦啡肽(StandardsKit for TOF G2-S)(美國Waters公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；超純水(Milli-Q超純水儀制備)；其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 橢圓葉花錨化學(xué)成分分析

橢圓葉花錨樣品采集于青海地區(qū)，由青海師范大學(xué)曾陽教授鑒定為橢圓葉花錨(HaleniaellipticaD.Don)。取樣品20 g，粉碎，過80目篩，得樣品粉末。精密稱取粉末0.5 g，置50 mL錐形瓶，加入7.5 mL甲醇浸沒，50 ℃水浴，超聲提取1 h，取粗提液100 μL于1.5 mL離心管內(nèi)，加入75%乙腈500 μL稀釋，混勻靜置2 min，冷凍離心15 min(12 000 rpm，10 ℃)。取上清液過0.2 μm微孔濾膜至進(jìn)樣瓶，4 ℃保存，備用。

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，體積流量0.3 mL/min,進(jìn)樣量1 μL，柱溫40 ℃；流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)-0.01%甲酸乙腈溶液(B)；梯度洗脫條件：0～1 min，99%→90%A；1～10 min，90%→74%A；10～14 min，74%→34%A；14～16 min，34%→1%A；16～19 min，1%A；19～20 min，1%→99%A；20～23 min，99%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正/負(fù)離子模式(ESI+/ESI-)，Continuum模式采集MSE數(shù)據(jù)：校正液為200 pg/μL亮氨酸腦啡肽(leucine-enkephalin)，0.5 mM甲酸鈉(sodium-formate)。掃描范圍m/z50～1 200，掃描時(shí)間0.2 s，檢測時(shí)間20 min。低能量碰撞電壓(CE)6 V，高能量碰撞電壓為20～60 V；正/負(fù)離子模式毛細(xì)管電壓均為2 kV，錐孔電壓為45 V，離子源溫度為100 °C，輔助噴霧電離與去溶劑氣體為高純度N2，去溶劑化溫度350 °C，錐孔氣體流量50 L/h，去溶劑化氣體流量600 L/h。

利用UNIFI數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Masslynx V4.1軟件及文獻(xiàn)比對，完成色譜峰對應(yīng)化合物的定性分析，篩選確定橢圓葉花錨的化學(xué)成分。

2.2 橢圓葉花錨作用靶點(diǎn)預(yù)測

通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)對鑒定的化合物檢索查詢Canonical SMILES號，未檢索到的化合物利用ChemDraw將化合物結(jié)構(gòu)式保存為SDF格式，將SDF格式文件導(dǎo)入OpenBabel獲得Canonical SMILES號；將獲得的Canonical SMILES號上傳Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://swisstargetprediction.ch/)，點(diǎn)擊Predict targets進(jìn)行預(yù)測分析，輸出化合物靶點(diǎn)信息[6]。將獲得的化合物靶點(diǎn)信息導(dǎo)入U(xiǎn)niport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，物種選擇“Homo Sapiens”，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，下載結(jié)果。以關(guān)鍵詞“hepatitis”在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中檢索疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將橢圓葉花錨活性成分的靶點(diǎn)信息與肝炎疾病相關(guān)的靶點(diǎn)信息構(gòu)建韋恩圖，得到橢圓葉花錨治療肝炎疾病的潛在靶點(diǎn)。

2.3 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)

將“2.2”獲取的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，選擇“Multiple protein”，物種選擇“Homo Sapiens”，下載蛋白相互作用結(jié)果，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4 GO功能與模塊分析、KEGG 富集通路分析

將篩選出的橢圓葉花錨治療肝炎的潛在靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)生物學(xué)過程分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P<0.05為篩選條件，得到相關(guān)分析結(jié)果。

2.5 橢圓葉花錨化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建橢圓葉花錨化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。其中，節(jié)點(diǎn)代表化學(xué)成分、靶點(diǎn)和信號通路，邊用來連接化學(xué)成分、靶點(diǎn)和信號通路。

2.6 主要活性成分-靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證

對篩選的橢圓葉花錨主要活性成分及核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，并用治療乙型肝炎藥物Entecavir做對照分析。首先通過Chem 3D 19.0對主要活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，然后用AutoDock 4.2.6確定配體可旋轉(zhuǎn)鍵等，之后從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，運(yùn)用PyMOL 2.3.4軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、去配體等操作，使用 AutoDock 4.2.6軟件對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行加氫和計(jì)算電荷等處理，最后利用AutoDock Vina 1.1.2軟件進(jìn)行對接，并用PyMOL 2.3.4軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

3 結(jié)果

3.1 橢圓葉花錨主要化學(xué)成分

通過UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析得到橢圓葉花錨總離子流圖(見圖1)。利用UNIFI數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Masslynx V4.1軟件及文獻(xiàn)比對，完成色譜峰對應(yīng)化合物的定性分析，得到40個(gè)化合物，主要包括獐牙菜苷、車葉草苷酸、馬錢苷酸、β-天麻素、京尼平苷酸及口山酮類等(見表1)。

圖1 橢圓葉花錨樣品TIC圖Fig.1 TIC diagram of positive and negative ion patterns of Halenia elliptica D.Don

表1 橢圓葉花錨中主要化學(xué)成分Table 1 Identification of chemical constituents in Halenia elliptica D.Don

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測

按照方法“2.2”，利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對40個(gè)化合物進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測，其中ascorbylglucoside化合物靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果中probability>0的結(jié)果為0個(gè)。將審核過的462個(gè)靶點(diǎn)與604個(gè)DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索與肝炎相關(guān)的靶點(diǎn)和9 631個(gè)GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建韋恩圖(圖2)，得到33個(gè)橢圓葉花錨治療肝炎的潛在作用靶點(diǎn)，靶點(diǎn)信息見表2。

表2 橢圓葉花錨抗肝炎潛在靶點(diǎn)Table 2 Potential target of anti-hepatitis in the Halenia elliptica D.Don

圖2 橢圓葉花錨抗肝炎靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of anti-hepatitis target of Halenia elliptica D.Don

3.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

按照方法“2.3”，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示，節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)間關(guān)聯(lián)，靶點(diǎn)大小和顏色與degree值成正相關(guān)。該網(wǎng)絡(luò)共有33個(gè)靶點(diǎn)、348條邊，平均節(jié)點(diǎn)度21.1。其中具有較大度值(degree值>25)的蛋白質(zhì)有VEGFA、TNF、IL6、MAPK1、CASP3、STAT3、PTGS2、MAPK8、JUN等。通過網(wǎng)絡(luò)圖，能直觀看出靶點(diǎn)之間復(fù)雜的互作關(guān)系，進(jìn)一步表征了橢圓葉花錨通過多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同調(diào)控治療肝炎的作用特點(diǎn)。

圖3 靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Interaction network among targets

3.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將“2.2”篩選出的橢圓葉花錨治療肝炎的潛在靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。從生物過程(biologicalprocess，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)3個(gè)水平對33個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，按照P<0.05的閾值過濾，3個(gè)水平分別得到28、16、4條生物功能。按照富集的顯著程度取排名靠前的條目繪制可視化條形圖，見圖4。KEGG通路富集分析，按照P<0.05的閾值過濾，得到53條通路，選取排名靠前的通路繪制氣泡圖，見圖5。

圖4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

GO 分析顯示，在生物學(xué)過程方面，主要包括白細(xì)胞遷移(leukocyte migration)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、血小板活化(platelet activation)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白酶ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)、細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)(response to glucocorticoid)、FcεRI受體信號通路(Fc-epsilon receptor signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控(regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling)、白細(xì)胞與細(xì)胞的粘附(leukocyte cell-cell adhesion)、蛋白質(zhì)磷酸化(protein phosphorylation)、肽絲氨酸磷酸化(peptidyl-serine phosphorylation)、細(xì)胞形狀的調(diào)節(jié)(regulation of cell shape)、肽基蘇氨酸磷酸化(peptidyl-threonine phosphorylation)、磷脂酰肌醇-3-磷酸酯的生物合成過程、(phosphatidylinositol-3-phosphate biosynthetic process)等生物過程。細(xì)胞組分方面，靶點(diǎn)涉及膜(membrane)、質(zhì)膜的外側(cè)(external side of plasma membrane)、膜筏(membrane raft)、細(xì)胞表面(cell surface)、質(zhì)膜的組成部分(integral component of plasma membrane)等組分。分子生物學(xué)功能方面涉及DNA結(jié)合(DNA binding)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)、轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合(transcription factor activity,sequence-specific DNA binding)、ATP結(jié)合(ATP binding)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、激酶活性(kinase activity)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合(transcription regulatory region DNA binding)、染色質(zhì)結(jié)合(chromatin binding)、RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性DNA結(jié)合(RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific DNA binding)、轉(zhuǎn)錄激活子活性，RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合(transcriptional activator activity,RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific binding)等分子生物功能。

KEGG 通路富集結(jié)果(圖5)顯示橢圓葉花錨抗肝炎的靶點(diǎn)主要涉及TNF信號通路(14個(gè)靶點(diǎn)，42%)、乙型肝炎(11個(gè)靶點(diǎn)，33%)、Toll樣受體信號通路(9個(gè)靶點(diǎn)，27%)、甲型流感(10個(gè)靶點(diǎn)，30%)、T細(xì)胞受體信號通路(8個(gè)靶點(diǎn)，24%)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(9個(gè)靶點(diǎn)，27%)、胰島素抵抗(8個(gè)靶點(diǎn)，24%)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路(8個(gè)靶點(diǎn)，24%)、EB病毒感染(8個(gè)靶點(diǎn)，24%)、HTLV-I感染(10個(gè)靶點(diǎn)，30%)、破骨細(xì)胞分化(8個(gè)靶點(diǎn)，24%)、丙型肝炎(8個(gè)靶點(diǎn)，24%)、FoxO信號通路(8個(gè)靶點(diǎn)，24%)等信號通路。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

3.5 橢圓葉花錨主要成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

按照“2.5”項(xiàng)中方法構(gòu)建橢圓葉花錨主要成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，其中“菱形”表示化學(xué)成分，“圓形”表示抗肝炎作用靶點(diǎn)，“V形”表示通路，由圖6可知該網(wǎng)絡(luò)由92個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括種39種成分、33個(gè)靶點(diǎn)、20條通路和307條邊，其中化學(xué)成分J24、J34、J35、J39、J38、J17、J36、J27、J25、J40等節(jié)點(diǎn)較大，表明與其相連的節(jié)點(diǎn)較多，可能是橢圓葉花錨治療肝炎疾病的重要活性成分，另外PIK3CA、TNF、PIK3R1、MAPK8、LGALS3、PTGS2、MAPK1、MAPK14、APP、STAT3、IL6等靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)較大，可能是橢圓葉花錨治療肝炎疾病的重要作用靶點(diǎn)，其中TNF、Toll-like receptor、FoxO、HIF-1、VEGF、Fc epsilon RI等通路可能是橢圓葉花錨治療肝炎疾病的重要通路。

圖6 成分-靶點(diǎn)-通路圖Fig.6 Compound-target-pathway network

3.6 主要活性成分-靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證

主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果結(jié)合能見表3。一般認(rèn)為，對接能量值小于-4.25 kcal/mol表示兩者間有一定的結(jié)合活性，小于-5.0 kcal/mol表示有較好的結(jié)合活性，小于-7.0 kcal/mol表示有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[7]?；衔锱c靶點(diǎn)對接結(jié)果在PyMOL軟件中進(jìn)行可視化處理(見圖7)。分子對接結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所預(yù)測的核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均可自發(fā)結(jié)合，證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的可靠性。

表3 橢圓葉花錨抗肝炎核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of core anti-hepatitis components of Halenia elliptica D.Don with key targets

圖7 關(guān)鍵化合物與靶點(diǎn)的分子對接示意圖Fig.7 Molecular docking diagram of key compounds and core targets注：A～H分別為：J24與PIK3CA、J24與TNF、J24與PIK3R1、J24與MAPK8、J24與LGALS3、J35與PIK3CA、J35與PIK3R1、J35與LGALS3。Note:A～H are as follows:J24 and PIK3CA,J24 and TNF,J24 and PIK3R1,J24 and MAPK8,J24 and LGALS3,J35 and PIK3CA,J35 and PIK3R1,J35 and LGALS3.

4 討論

本研究通過UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析了橢圓葉花錨40種化學(xué)成分，主要為以口山酮及其苷為主的黃酮類、裂環(huán)烯醚萜、三萜和生物堿類成分。其中J34、J39、J35、J24、J38等度值較大，且度值排名前十化合物中4個(gè)為口山酮類成分，表明口山酮類成分可能是橢圓葉花錨抗肝炎的主要活性成分，且Zhang等[8]研究表明花錨及其所含的口山酮苷為抗肝炎主要成分，是通過增加蛋白質(zhì)的合成和肝細(xì)胞內(nèi)的糖元和核糖核酸，促進(jìn)肝細(xì)胞合成來實(shí)現(xiàn)保肝作用。Wang等[9]探究了2種口山酮單體對肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用及其具體機(jī)制，發(fā)現(xiàn)2種口山酮化合物均能有效抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬實(shí)現(xiàn)。Zhang等[10]研究了山奈酚(kaempfer1)對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝損傷的作用，發(fā)現(xiàn)山奈酚通過抑制JNK通路來保護(hù)肝細(xì)胞啟動(dòng)壞死模式，啟動(dòng)線粒體功能，且山奈酚能上調(diào)肝細(xì)胞中的GSH，從而達(dá)到保肝作用。Shakya等[11]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚通過抑制過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等抗氧化酶的表達(dá)，從而降低由酒精和多不飽和脂肪酸引起的小鼠肝組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而對由此引發(fā)的肝損傷起到一定的保護(hù)作用。其余幾種度值較大的重要成分文獻(xiàn)報(bào)道較少，其藥效學(xué)及作用機(jī)制需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

由KEGG通路富集及成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖可知，PIK3CA、TNF、PIK3R1、MAPK8、LGALS3、MAPK1、MAPK14、STAT3、IL6、PTGS2等靶點(diǎn)和TNF、Toll-like receptor、FoxO 、HIF-1、VEGF、Fc epsilon RI等信號通路degree值較大，與其相連的成分較多，可能是橢圓葉花錨抗肝炎的主要潛在靶點(diǎn)與通路。

PI3K信號通路是細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞的增殖、凋亡和代謝的關(guān)鍵性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[12-14]，且PIK3CA和PIK3R1在肝癌、腦癌、乳腺癌、胃癌和結(jié)腸癌里突變率較高[15,16]。Griffith等[17]通過研究人類乳腺癌中PIK3CA和PIK3R1基因表達(dá)情況，從而創(chuàng)建了PIK3CA和PIK3R1影響突變的腫瘤基因型譜，為基因治療癌癥開辟了新途徑。Xiao等[18]研究發(fā)現(xiàn)亞低溫預(yù)處理能夠通過PI3K/AKT/FOXO3a通路抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放和凋亡，對缺血再灌注肝損傷具有保護(hù)作用。Jiang等[19]研究發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯能顯著改善膽道梗阻大鼠肝損傷及病理形態(tài)，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)PI3K、AKT的磷酸化，抑制肝細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。PIK3CA和PIK3R1均屬于PI3K信號通路，PI3K/Akt通路可通過激活肝星狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞促進(jìn)肝纖維化[20]，橢圓葉花錨中口山酮類成分可能是通過介導(dǎo)PI3K信號通路，抑制肝細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)抗肝炎的作用。

MAPKs是眾多信號蛋白的一種，其激活調(diào)控一系列細(xì)胞活動(dòng)?；罨慕z裂原活化蛋白激酶(MAPK)通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白及酶類等參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[21]。Roman等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在RAW264.7巨噬細(xì)胞中，sPGN強(qiáng)度將會激活MAPK1/ERK2通路，中度激活MAPK8/JNK通路，輕度激活P38通路，其中ERK通路主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，P38通路在炎癥條件下的激活具有多種特性[23]。其中MAPK8基因在肝癌，胃癌，胰腺癌等人體的多個(gè)部位的腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)，致癌機(jī)制均是MAPK8通路先被外界刺激因素激活，轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)提高轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)一步使癌細(xì)胞增殖和分化[24,25]。

TNF作為一種重要的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，包括增殖、凋亡、炎癥、免疫等。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎患者TNF水平較正常健康人明顯偏高。Tilg等[27]研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者血清致炎因子TNF-α、IL-6水平的高低能夠反映肝細(xì)胞損害的程度。TNF-α、IL-6作為重要的致炎因子，對乙肝的發(fā)生、發(fā)展起到了重要的作用，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，因此，目前研究認(rèn)為中醫(yī)藥可以通過降低血清中TNF-α、IL-6水平而起到保肝作用[27]。

綜上，本研究在橢圓葉花錨化學(xué)成分的測定分析基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，分析了橢圓葉花錨40種化學(xué)成分33個(gè)抗肝炎的潛在作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)橢圓葉花錨可能通過白細(xì)胞遷移、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、血小板活化、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白酶ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、磷脂酰肌醇3-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控等生物過程，以及TNF、PI3K、Toll-like receptor、FoxO、HIF-1、VEGF、Fc epsilon RI等關(guān)鍵信號通路，發(fā)揮抗肝炎的作用。分子對接結(jié)果驗(yàn)證了預(yù)測的主要化學(xué)成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)有較好結(jié)合活性，表明本研究的預(yù)測較為準(zhǔn)確可靠，當(dāng)然，本研究也具有一定局限性，如數(shù)據(jù)庫不完善等，因此后續(xù)還需對相關(guān)靶點(diǎn)通路進(jìn)行驗(yàn)證。