王慶華，付學(xué)松，田葉韓，高克祥，申洋，呂新民，李洋

（1.泰安市徂徠山林場，山東 泰安 271000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東 泰安 271018；3.山東農(nóng)大肥業(yè)科技有限公司，山東 泰安 271000）

尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）廣泛存在于世界各地的原生土壤中，從植物根部和非生物體有機(jī)質(zhì)中均能夠發(fā)現(xiàn)尖鐮孢菌，這表明其為尖鐮孢菌生長和繁殖提供了生態(tài)位點(diǎn)和資源［1，2］。土壤中的尖鐮孢菌一般不會(huì)引起土著植物群落病害的發(fā)生。尖鐮孢菌是一種腐生能力非常強(qiáng)的絲狀真菌，一旦成功在土壤中定殖幾乎不可能消除［3，4］。

土壤微生物區(qū)系如微生物生物量、群落、多樣性和特定微生物群的豐富性被認(rèn)為對(duì)維持土壤健康、質(zhì)量、酶活性和疾病抑制至關(guān)重要［5，6］。土壤微生物多樣性高和微生物區(qū)系保持動(dòng)態(tài)平衡是抑制病原菌入侵的重要基礎(chǔ)，長期連作會(huì)導(dǎo)致土壤中病原微生物積聚，成為優(yōu)勢(shì)種群，最終導(dǎo)致土壤微生物區(qū)系失衡。同時(shí)，土壤對(duì)病原微生物的抵御能力與很多農(nóng)業(yè)管理措施密不可分，輪作可增強(qiáng)土壤微生物區(qū)系的多樣性，增強(qiáng)土壤微生物群落對(duì)病原菌侵入的抵抗力［7］。研究表明，青枯病菌（Ralstonia solanacearum）和枯萎病菌（F.oxysporum）等病原菌在入侵過程中會(huì)引起土壤原著微生物群落劇烈變化，表現(xiàn)為植物病原微生物增加以及微生物多樣性和群落功能改變［8］。土壤真菌豐度和多樣性與枯萎病的發(fā)生呈顯著正相關(guān)，常年集約化單作栽培，導(dǎo)致土壤真菌的豐度和多樣性上升，細(xì)菌的豐度和多樣性降低，土壤微生物區(qū)系抵御鐮孢菌侵入的能力降低，最終導(dǎo)致鐮孢菌在土壤中成功定殖和積累［9］。在枯萎病高發(fā)區(qū)的土壤中鐮孢菌豐度高于非致病性土壤，同時(shí)，真菌或細(xì)菌豐度和多樣性也高于非致病性土壤［8］。但是，到目前為止，關(guān)于尖鐮孢菌在其介導(dǎo)的微生物群落組成和多樣性變化以及土壤質(zhì)量下降中的作用還不是很清楚。本試驗(yàn)擬研究致病性鐮孢菌入侵土壤后對(duì)土壤微生物群落和功能的影響，以期為作物枯萎病的生物防治策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

尖鐮孢菌苦瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.momordicae，ACCC 39204）SG-15菌株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 尖鐮孢菌入侵模型制備 本研究通過人工向土壤中添加尖鐮孢菌制備其入侵模型：（1）用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁高致病性SG-15菌株獲得病原菌孢子懸浮液，將孢子懸浮液用自來水稀釋100倍后按1∶1的質(zhì)量比與草炭土混勻，繼續(xù)進(jìn)行二次擴(kuò)繁，孵育30 d，將含病原菌草炭土（濃度為104cfu/g）均勻撒入病圃中（1 kg/m2），旋耕整地。（2）連作苦瓜，每年種植兩茬，連續(xù)種植5年。

1.2.2 病菌SG-15入侵對(duì)微生物群落組成和功能的影響試驗(yàn) 以未接種SG-15菌株地塊內(nèi)的苦瓜根際土壤為空白對(duì)照組（Control），人工病圃內(nèi)苦瓜根際土壤為處理組（S-FOM），每處理重復(fù)5次。通過微生物宏基因組研究尖鐮孢菌入侵對(duì)土壤微生物群落組成和功能的影響。

1.2.3 宏基因組測序 采用CTAB法提取樣本基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度，取適量樣品于離心管中，用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

基于Illumina HiSeq高通量測序平臺(tái)，采用全基因組鳥槍法（whole genome shotgun，WGS）將提取獲得的菌群宏基因組總DNA隨機(jī)打斷為短片段，并構(gòu)建合適長度的插入片段文庫，對(duì)這些文庫進(jìn)行雙端（paired-end，PE）測序。對(duì)高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭（de novo）組裝拼接，構(gòu)建Contigs和Scaffolds序列，并對(duì)生成的Contigs和Scaffolds序列進(jìn)行組裝拼接效果評(píng)價(jià)。采用MetaGeneMark數(shù)據(jù)庫預(yù)測原核微生物和宏基因組的基因序列，并識(shí)別開放閱讀框（ORF），獲得對(duì)應(yīng)的蛋白序列。使用每個(gè)樣本的Scaffolds序列與NCBI-NT數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌（bacteria）、古菌（archaea）、真菌（fungi）和病毒（viruses）序列進(jìn)行BLASTN比對(duì)（E值設(shè)定為＜0.001）。通過MEGAN軟件中“最低共同祖先（LCA）”算法將參考序列分化為不同物種分枝前的最后一級(jí)共同分類，結(jié)合Scaffolds/Scaftigs序列在各樣本中的豐度（深度）數(shù)據(jù)，獲得各樣本在各個(gè)分類等級(jí)（界、門、綱、目、科、屬、種）上的相對(duì)豐度分布表。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌SG-15對(duì)土壤微生物群落組成的影響

Control處理中細(xì)菌平均占比90.06%（放線菌占比20.34%），真菌占比0.1512%；S-FOM處理中細(xì)菌平均占比89.46%（放線菌占比19.62%），真菌占比0.1469%（圖1A）。與Control處理相比，S-FOM處理土壤中的真菌和細(xì)菌占比降低，但是除放線菌外的細(xì)菌種群的總體占比上升。

在微生物門水平，健康土壤和致病性土壤組成相似，但相對(duì)豐度存在差異。變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單 胞 菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）及擬桿菌門（Bacteroidetes）是土壤中細(xì)菌豐度最高的門，占微生物總序列的62.96%；與健康土壤（Control）相比，致病性土壤（S-FOM）中變形菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門的相對(duì)豐度上升（P＞0.05），放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和浮霉菌門的豐度顯著下降（P＜0.05）（圖1A、B）。子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是土壤中真菌豐度最高的門，占土壤微生物總序列的0.14%，占土壤真菌總序列的95.98%；與健康土壤（Control）相比，致病性土壤（S-FOM）中擔(dān)子菌門的豐度顯著下降（P＜0.05）（圖1C）。

在微生物屬水平上，主要土壤微生物的相對(duì)豐度存在顯著差異。與健康土壤（Control）相比，致病性土壤（S-FOM）中曲霉菌屬（Aspergillus）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、孢堆黑粉菌屬（Sporisorium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）、Gemmatirosa、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、溶桿菌屬（Lysobacter）、堆囊菌屬（Sorangium）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、小單孢菌屬（Micromonospora）、游動(dòng)放線菌屬（Actinoplanes）、分枝酸桿菌屬（Mycolicibacterium）、擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、弗蘭克氏菌屬（Frankia）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）和伊盧瑪托菌屬（Ilumatobacter）的相對(duì)豐度顯著下降（P＜0.05），鐮孢菌屬（Fusarium）、壤霉菌屬（Agromyces）、貪噬菌屬（Variovorax）、拉姆利菌屬（Ramlibacter）和克里布所菌屬（Kribbella）的相對(duì)豐度顯著上升（P＜0.05）（圖1D、E、F）。

圖1 病原菌SG-15對(duì)土壤主要微生物群落組成的影響

2.2 病原菌SG-15對(duì)關(guān)鍵土壤微生物群落和功能的影響

隨機(jī)森林分析（random forest）和LEfSe分析（LDA effect size）結(jié)果表明，迷蹤菌門（Elusimicrobia）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、Euglenida菌門、Candidatus Wolfebacteria菌 門、Candidatus Beckwithbacteria菌門、Candidatus Saccharibacteria菌門、子囊菌門、廣古菌門（Euryarchaeota）、軟壁菌門（Tenericutes）、變形菌門、放線菌門及變形菌門內(nèi)的塔特洛克菌屬（Tatlockia）、拉姆利菌屬（Ramlibacter）、極地單胞菌屬（Polaromonas）、塔特亞瑪利亞菌屬（Tateyamaria）、假古爾本基安菌屬（Pseudogulbenkiania）、福格斯氏菌屬（Vogesella）、脫硫橄欖狀菌屬（Desulfobacca）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和放線菌門的壤霉菌屬（Agromyces）等微生物種群對(duì)致病性土壤（S-FOM）中的微生物群落結(jié)構(gòu)差異具有關(guān)鍵的影響作用（圖2A、B）。在致病性土壤中，氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、嘧啶代謝（pyrimidine metabolism）、遺傳信息處理（genetic information processing）、丙酮酸代謝（pyruvate metabolism）、嘌呤代謝（purine metabolism）、細(xì)菌分泌系統(tǒng)（bacterial secretion system）、能量代謝（energy metabolism）、核苷酸代謝（nucleotide metabolism）和氮代謝（nitrogen metabolism）等代謝功能顯著富集，而細(xì)菌群體感應(yīng)（quorum sensing）和外源性物質(zhì)降解和代謝（xenobiotics biodegradation and metabolism）等功能顯著降低（圖2C）。

圖2 差異關(guān)鍵微生物和代謝功能分析

2.3 病原菌SG-15對(duì)氮素循環(huán)的影響

在Control與S-FOM兩組處理中共發(fā)現(xiàn)49個(gè)與氮素循環(huán)相關(guān)的土壤微生物基因，其中12個(gè)基因的相對(duì)豐度在致病性土壤中降低，涉及固氮作用、硝化作用和反硝化作用的22個(gè)基因的豐度水平在致病性土壤中顯著上升（圖3A），土壤尖鐮孢菌相對(duì)豐度與gltD、nirB、nirK、narG、narH、nasA、nosZ、CA、cynS、napA、napB、NRT、nifH、nifK、norB、NR、hao、pmoCamoC、GDH2、nrtA和nirS共21個(gè)基因呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與RocG、nirD、nirA和NIT6呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（圖3B）。另外，nirB、nasA、napB、NRT、norB和nirS基因與土壤脲酶呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05），gltD、nasB、nirB、napA、napB、NRT、nifH、norB和nirS基因與土壤有效氮含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05）（圖3C）。在S-FOM和Control中注釋到的與氮代謝相關(guān)的微生物包括10個(gè)門、164個(gè)屬和299個(gè)種，其中變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和浮霉菌門為主要微生物門，占已知微生物的60%、22%、3%、2%和2%（圖4A、B）。在種水平，未分類的放線菌（unclassified Actinobacteria）、未分類根瘤菌（unclassified Rhizobiales）和未分類的假單胞菌（unclassified Pseudomonas）的豐度水平在S-FOM處理中顯著上升（P＜0.05）（圖4C）。

圖3 菌株SG-15對(duì)氮素代謝相關(guān)基因的影響

圖4 與氮素代謝相關(guān)的微生物種群豐度

3 討論與結(jié)論

植物病原菌如青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）和尖鐮孢菌入侵土壤后，會(huì)引起土壤微生物組的劇烈變化，導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降，表現(xiàn)為植物病原菌的增加和微生物多群落功能的喪失［8］。鐮孢菌作為病原菌、內(nèi)生菌和腐生菌在土壤和植物中扮演著重要的功能角色，尖鐮孢菌在土壤中的定殖可能會(huì)降低有益細(xì)菌的數(shù)量和/或活性，最終導(dǎo)致土壤對(duì)枯萎病的抑制力下降。Shen等［9］研究表明，放線菌門和厚壁菌門的微生物相對(duì)豐度與較低的枯萎病發(fā)病率和較高的植物生物量顯著相關(guān)。在香蕉枯萎病高發(fā)土壤中，尖鐮孢菌的豐度、真菌或細(xì)菌的豐富度和多樣性均高于健康土壤［8］。本研究中，尖鐮孢菌的入侵引起了土壤微生物群落豐富度和群落結(jié)構(gòu)的劇烈變化，未引起總微生物多樣性的顯著變化，但真菌和放線菌的多樣性降低。在門水平上，尖鐮孢菌的入侵降低了放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和浮霉菌門的相對(duì)豐度，提高了變形菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門的相對(duì)豐度。在屬水平上，入侵的尖鐮孢菌與Bradyrhizobium、Streptomyces、Luteitalea、Sphingomonas、Rhodoplanes、Cordyceps、Gemmatirosa、Aspergillus、Rhodotorula、Colletotrichum、Anthracocystis、Trichoderma、Thielavia和Cladophialophora等優(yōu)勢(shì)土著微生物存在生態(tài)位點(diǎn)和資源的競爭，尖鐮孢菌的入侵顯著壓迫了優(yōu)勢(shì)微生物群落的生存空間，同時(shí)也激活了Kribbella、Streptomyces、Devosia、Burkholderia、Variovorax、Agromyces、Ramlibacter和Pseudomonas屬內(nèi)有益微生物的生長繁殖（未發(fā)表）。Chapelle等［10］研究表明，入侵的立枯絲核菌（R.solani）可直接或通過植物誘導(dǎo)根際細(xì)菌群落的脅迫反應(yīng)，導(dǎo)致土壤微生物群落組成的變化，并激活限制病原菌侵染的有益微生物種群的生長繁殖，立枯絲核菌入侵后，Oxalobacteraceae、Burkholderiaceae、Sphingobacteriaceae和Sphingomonadaceae在根際環(huán)境中的含量明顯增加。

土壤微生物通過代謝促進(jìn)土壤養(yǎng)分的形成和轉(zhuǎn)化［11，12］。土壤-微生物-土壤養(yǎng)分作為土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的統(tǒng)一體，相互影響和制約，土壤養(yǎng)分輸入的種類、數(shù)量及分解過程中物質(zhì)的變化均會(huì)影響土壤微生物群落組成和活性，而微生物群落的變化反過來又會(huì)影響土壤養(yǎng)分的分解和轉(zhuǎn)化［13-16］。本研究發(fā)現(xiàn)尖鐮孢菌入侵對(duì)土壤中氮素代謝和細(xì)菌群體感應(yīng)等功能具有顯著影響。同時(shí)，尖鐮孢菌定殖對(duì)鏈霉菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬和慢生根瘤菌屬等與氮素代謝和細(xì)菌群體感應(yīng)功能相關(guān)的微生物豐度影響較大。Stone等［17］研究表明，慢生根瘤菌、酸桿菌和鏈霉菌等在利用現(xiàn)有的土壤碳和添加到土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)方面比其它較罕見的微生物要好，當(dāng)添加碳和氮時(shí)，這些已經(jīng)占主導(dǎo)地位的細(xì)菌鞏固了其對(duì)養(yǎng)分的控制，相對(duì)于其他存在的分類群生長得更快。Zhou等［8］研究表明，發(fā)生枯萎病的土壤中總有機(jī)碳、總有機(jī)氮和速效鉀的含量顯著高于健康土壤。眾多的研究結(jié)果表明，在枯萎病致病性土壤中，尖鐮孢菌的入侵破壞了土壤的養(yǎng)分循環(huán)，其原因有可能是尖鐮孢菌抑制植物的正常生長，阻礙了土壤中養(yǎng)分的輸出。

尖鐮孢菌是一種典型的土壤習(xí)居菌。本研究表明，外源尖鐮孢菌可通過改變鏈霉菌屬和慢生根瘤菌屬等土壤優(yōu)勢(shì)微生物的群落多樣性，干擾土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，為自身創(chuàng)造更有利的生存環(huán)境。