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黃芩素對痤瘡模型大鼠局部組織IL-4、MMP-9的影響?

2021-12-10 06:13郭斐斐牛凡紅王思農(nóng)
關(guān)鍵詞:耳廓痤瘡黃芩

劉 婧,朱 鵬,鄭 婷,謝 千,郭斐斐,牛凡紅,王思農(nóng)

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州 730000)

痤瘡是一種毛囊皮脂腺的炎癥性疾病,好發(fā)于青少年,其患病率為82.9%,臨床表現(xiàn)為面頰部、胸背部的粉刺、炎性丘疹、結(jié)節(jié)、膿皰,易反復(fù)發(fā)作,遷延不愈,預(yù)后常遺留瘢痕影響患者的生活質(zhì)量[1,2]。本實驗通過外用黃芩素治療模型大鼠耳廓復(fù)合痤瘡,對局部組織進(jìn)行HE染色觀察及ELISA法檢測組織中IL-4以及MMP-9的含量,以探究黃芩素干預(yù)痤瘡發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。該研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),倫理批準(zhǔn)編號2018-116。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雌雄各半的Wistar大鼠64只,體質(zhì)量(160±20)g,7~9月齡,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研動物實驗中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘)2015-0002。飼養(yǎng)于濕度45%~55%、溫度21 ℃~25 ℃的環(huán)境中,以標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料及無菌水飼養(yǎng),動物福利按照國際相關(guān)實驗動物法規(guī)實施。

1.2 藥物

黃芩素(批號ZY20190927),由南京源植生物有限公司提供;凡士林(批號Q1402ALX172),由山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司提供;50%油酸溶液(批號H20171201),由無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司提供;0.025%維A酸乳膏(批號H37023768),由山東良福制藥有限公司;IL-4ELISA試劑盒(批號MM-0191R1),由江蘇酶免實業(yè)有限公司提供;MMP-9ELISA試劑盒(批號MM-20918R1),由江蘇酶免實業(yè)有限公司提供。

1.3 主要儀器

電子天平(蘇州坤宏電子有限公司,型號BMB124);超低溫保存箱(海爾集團(tuán),型號DW-25W518);酶標(biāo)儀(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,型號SP-Max2300A2);高速冷凍離心機(jī)(河南北弘儀器有限公司,型號TGL16 M);電動離心機(jī)(常州市光合有限公司,型號LD34);顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司,BA400Digital)。

1.4 方法

1.4.1 造模方法與分組 將64只雌雄各半的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只作為空白組,對剩余54只大鼠用kligman法建立右耳廓復(fù)合痤瘡模型[3],即在大鼠右耳內(nèi)側(cè)面耳導(dǎo)管開口處每日涂50%油酸溶液1次,每次0.5~1 mL,隔日于大鼠耳廓皮內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌菌液,連續(xù)3周。左耳不做任何處理,以作對比。待第22天時觀察大鼠耳廓皮損形態(tài),右耳造模部位出現(xiàn)紅腫,皮溫升高,肉眼可見擴(kuò)張的毛細(xì)血管、毛孔增大、脫屑及丘疹樣隆起或囊腫,觸之皮損處粗糙干燥,并參考痤瘡模型判定分級標(biāo)準(zhǔn)[4],提示復(fù)合痤瘡模型已形成。隨機(jī)抽取4只進(jìn)行病理切片觀察,病理提示造模成功后,將剩余50只大鼠隨機(jī)平均分為模型組、黃芩素高、中、低劑量組以及陽性對照組。

1.4.2 給藥治療 分組完成后開始給予造模處藥物治療,以凡士林為基質(zhì)將黃芩素混合于其中,根據(jù)人與實驗動物等效劑量換算得出:黃芩素低劑量組給予0.04 g生藥/cm2·d,中劑量組給予0.08 g生藥/cm2·d,高劑量組給予0.16 g生藥/cm2·d,陽性對照組0.025%維A酸給予5 g/cm2·d,將藥物均勻地涂抹于痤瘡模型處,范圍約1 cm×1 cm,厚度約1 mm,每日給藥1次,給藥完成后固定于鼠板20 min,連續(xù)4周??瞻捉M和模型組均不涂抹任何藥物。

1.5 形態(tài)學(xué)及組織學(xué)觀察

每日肉眼觀察并記錄大鼠耳廓造模處用藥前后皮損情況,末次用藥24 h后,大鼠經(jīng)3%的戊巴比妥麻醉后剪下一半右耳用HE染色處理,光鏡下觀察病理學(xué)組織形態(tài),采集標(biāo)本后行頸椎脫臼法處死各組動物。

1.6 細(xì)胞因子檢測

取剩余的一半右耳進(jìn)行皮膚組織勻漿細(xì)胞因子檢測,用預(yù)冷PBS溶液將大鼠右耳皮膚中的血液洗凈研碎后晾干放于EP管,加PBS勻漿(組織∶PBS體積比為1∶100),離心后取上清液,用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-4、MMP-9的含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察用藥后各組大鼠皮損變化

圖1示,空白組耳廓柔軟光滑,毛細(xì)血管清晰可見,模型組皮損處可見紅腫、脫屑及丘疹樣隆起或囊腫,毛細(xì)血管擴(kuò)張,觸之皮溫升高,粗糙干燥。陽性對照組可見輕度紅腫,脫屑減輕,皮損部位溫度降低,毛細(xì)血管及毛孔稍有縮小。高劑量組可見皮損處恢復(fù)光滑柔軟,毛孔縮小,可見清晰的毛細(xì)血管,溫度與空白組基本一致,中劑量組與陽性對照組大致一致,皮損處紅腫減輕溫度降低,脫屑緩解,皮損處柔軟,低劑量較模型組改善效果不顯著。

注:a.空白組;b.模型組;c.陽性對照組;d.低劑量組;e.中劑量組;f.高劑量組圖1 肉眼觀察用藥后各組大鼠皮損比較

2.2 病理學(xué)觀察各組大鼠用藥后右耳廓皮損變化

圖2示,光鏡下可見空白組耳廓厚度均一,皮下膠原纖維排列較為致密,毛囊及皮脂腺未見組織學(xué)改變,真皮及表皮界限清晰,脂肪組織清晰可見。模型組可見,表皮層增厚,角栓堵塞,毛囊增大,真皮層內(nèi)皮脂腺增生,皮下間質(zhì)內(nèi)形成明顯壞死灶,皮下組織內(nèi)炎性壞死灶形成,中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤。陽性對照組與中劑量表皮層厚度較為均一,角化物減少,炎性細(xì)胞及纖維壞死也較模型組減少。高劑量組表皮層較薄,炎性細(xì)胞基本消失,纖維組織減少。低劑量組表皮層較增厚,纖維組織增生,伴有中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤。

注:a.空白組;b.模型組;c.陽性對照組;d.低劑量組;e.中劑量組;f.高劑量組圖2 各組大鼠耳部組織炎癥改變比較(HE×100)

2.3 ELISA法檢測痤瘡模型大鼠局部組織中IL-4、MMP-9含量

表1示,模型組與空白組比較,IL-4、MMP-9含量顯著上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);黃芩素低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠組織中IL-4、MMP-9的含量與模型組比較均有不同程度降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),各組含量趨勢為高劑量組<陽性對照組<中劑量組<低劑量組。

表1 各組痤瘡模型大鼠局部組織中IL-4、MMP-9含量比較

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,痤瘡的發(fā)生與皮脂腺功能亢進(jìn)、毛囊角化過度、雄激素水平異常、痤瘡丙酸桿菌感染、炎癥相關(guān)[5]。特異性免疫反應(yīng)與痤瘡的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切,其中Th2細(xì)胞分泌的IL-4在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[6],IL-4與痤瘡的嚴(yán)重程度呈正比,且臨床研究表明IL-4與患者的痤瘡瘢痕有密切聯(lián)系[7,8]。金屬蛋白酶(MMPs)屬于鋅依賴性內(nèi)肽酶,存在于細(xì)胞外基質(zhì)中。在痤瘡患者的皮損組織中,MMP-2、MMP-3 以及 MMP-9呈現(xiàn)高表達(dá),MMPs的高表達(dá)可以加速皮膚膠原纖維的降解,最終導(dǎo)致瘢痕形成[9]。

《素問·生氣通天論篇》曰:“勞汗當(dāng)風(fēng),寒薄為皶,郁乃痤?!蓖庑啊⑻禎?、血熱致玄府閉塞,郁火內(nèi)生,升降悖逆,氣液失運(yùn),變生痰瘀,漸成結(jié)節(jié),觸之腫硬疼痛或按之如囊[10]。黃芩性苦、寒,有清熱燥濕、安胎止血之效[11],黃芩素是黃芩的主要成分之一,屬于5,6,7-三羥基黃酮,因其化學(xué)性質(zhì)活潑,水溶性較差[12],故本實驗以凡士林為基質(zhì)?,F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),黃芩素可通過抑制iNOS、COX-2、NO、IL-6等因子的釋放,從而減輕炎癥[13],或通過抑制髓樣分化因子-2(MD-2)/TLR4復(fù)合物的形成以及炎癥小體的激活,降低促炎介質(zhì)表達(dá)[14]。羅曉平等[15]發(fā)現(xiàn),黃芩素能夠干預(yù)AKT/NF-κB通路磷酸化蛋白表達(dá)而抑制該通路激活,減少炎癥因子釋放。并可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP/STAT途徑抑制細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子,對雙鏈RNA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞起到抗炎作用[16]。在體外細(xì)胞模型實驗中發(fā)現(xiàn),黃芩素可通過NF-κB和Wnt/b-catenin信號通路調(diào)控miR-9/IGF-1軸,抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的產(chǎn)生,從而達(dá)到治療瘢痕的作用[17],或作用于microRNA-29激活p38 MAPK-JNK通路,以延緩膠原的過度增殖和沉積,從而治療增生性瘢痕[18]。黃芩素亦可抑制MMP-2、MMP-9和組織蛋白酶來防止膠原降解[19]。此外黃芩素還具有抗菌[20]、抗氧化[21]、抗腫瘤作用[22]。紅細(xì)胞溶血實驗表明,黃芩素對眼睛無刺激性,對人體作用溫和[23]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn),黃芩素可能通過降低痤瘡模型組織中IL-4、MMP-9的含量,進(jìn)而調(diào)控炎性介質(zhì)的發(fā)展并減少后期痤瘡瘢痕的形成。在臨床診療的過程中,西醫(yī)治療痤瘡容易反復(fù),且存在使皮膚干燥、瘙癢、疼痛、色素沉著等副作用[24]。而中藥口感較差,有些患者不愿長期服用。外用黃芩素治療痤瘡療效確切,在臨床中有較好的應(yīng)用前景。

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