張卉芊， 李卓然， 陳怡歡， 代曉爍

1.鄭州大學(xué)護(hù)理與健康學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450001

結(jié)直腸癌（Colorectal carcinoma，CRC）包括結(jié)腸癌和直腸癌，是發(fā)生于結(jié)直腸上皮的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，類型以腺癌最為多見(jiàn)。在世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率居第三位，死亡率居第二位[1]。在中國(guó)，結(jié)直腸癌也是造成死亡的五大主要癌癥之一[2]。近年來(lái)，人們的生活水平不斷提高，而高油高脂的飲食模式及不規(guī)律的生活方式導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷上升。盡管在早期發(fā)現(xiàn)和治療方面取得了一定進(jìn)展，結(jié)直腸癌患者的預(yù)后仍然不容樂(lè)觀，局部結(jié)直腸癌患者五年生存率約為65%[3]。目前，結(jié)直腸癌患者的臨床治療面臨著易復(fù)發(fā)、預(yù)后差、現(xiàn)有藥物治療效果有限等問(wèn)題。因此，迫切需要尋找能夠預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。天然化合物作為我國(guó)特色的中醫(yī)藥寶庫(kù)，經(jīng)過(guò)千百年的傳承已被發(fā)現(xiàn)具有多種功效，天然化合物的抗腫瘤作用也受到越來(lái)越多的關(guān)注[4-6]。中醫(yī)古籍中多將腫瘤相關(guān)疾病命名為“癥瘕”“積聚”“肺積”等，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記錄了71味治療癥瘕積聚的藥物[7]。中藥在減輕放化療的毒副作用、提高患者生存率、防止術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮了重要作用[8]。因此，從天然化合物中尋找有效的臨床藥物不失為抗腫瘤治療的好方法[9]。近年來(lái)，生物信息學(xué)分析技術(shù)已被廣泛用于大數(shù)據(jù)的分析及篩選工作，從基因芯片中尋找腫瘤組織與相對(duì)應(yīng)的正常組織中的差異表達(dá)基因（differently expressed genes，DEGs）已成為數(shù)據(jù)分析的重要方法。本研究在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了GSE25070和GSE110225兩個(gè)結(jié)直腸癌基因表達(dá)譜芯片，從中篩選出腫瘤組織與正常組織的差異表達(dá)基因，并探討了其在CRC發(fā)生發(fā)展中的作用，并進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵差異基因，探究了其與患者預(yù)后的關(guān)系，從而尋找與患者預(yù)后顯著相關(guān)的關(guān)鍵基因，為CRC的靶向治療提供新策略。最后，本研究進(jìn)一步篩選了在大腸癌細(xì)胞系中與關(guān)鍵基因的表達(dá)具有相關(guān)性的天然化合物，旨在為臨床用藥提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 芯片的篩選

本研究篩選了美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的芯片（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles），選擇了包含結(jié)直腸腫瘤組織及鄰近正常組織的基因芯片信息，最終選擇了序列號(hào)為GSE25070和GSE110225的兩個(gè)芯片。芯片GSE25070包括26例結(jié)直腸腫瘤組織及其鄰近的正常組織。芯片GSE110225包含30例結(jié)直腸腫瘤組織及其鄰近的正常組織。

1.2 差異基因的篩選

本研究采用在線分析工具GEO2R對(duì)結(jié)直腸腫瘤組織及鄰近正常組織的差異基因進(jìn)行篩選，下載原始基因表達(dá)數(shù)據(jù)后，以P＜0.05，│log2FC│≥1.5作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到差異表達(dá)基因。其中，log2FC≥1.5定義為與正常組織相比上調(diào)的差異表達(dá)基因；log2FC≤-1.5定義為與正常組織相比下調(diào)的差異表達(dá)基因。此外，進(jìn)一步通過(guò)繪制韋恩圖對(duì)兩個(gè)芯片中的差異表達(dá)基因取交集（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），最終篩選出兩個(gè)芯片共同的差異表達(dá)基因。

1.3 差異基因的富集分析

本研究采用基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）[10]，對(duì) DEGs進(jìn)行基因本體分析（Gene Ontology，GO）及京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，其中GO功能分析包括生物過(guò)程（biological process，BP），細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三個(gè)部分，以P＜0.01為顯著性基因富集，并繪制柱形圖。

1.4 差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及核心基因識(shí)別

String（https://string-db.org/）在線工具用于對(duì)DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（proteinprotein interaction，PPI）分析[11]。分別輸入篩選出的共上調(diào)和共下調(diào)差異基因，選擇multiple proteins，物種選擇homo sapiens，即可構(gòu)建PPI蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖。其次，運(yùn)用Cytoscape（https://cytoscape.org/）對(duì)PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并篩選出與周圍基因有高度連通性的基因作為核心基因。Cytoscape是一款能夠圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)并能對(duì)其進(jìn)行分析和編輯的軟件，它通過(guò)幾種拓?fù)渌惴枋龌蚺c基因之間的拓?fù)潢P(guān)系。本研究采用Cytoscape中的cytohubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，cytohubba通過(guò)拓?fù)渌惴▽?duì)網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)及子網(wǎng)之間的關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，度（degree）被定義為某節(jié)點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)之間的相互連接的數(shù)目，各個(gè)節(jié)點(diǎn)由線連接，將實(shí)際存在或預(yù)測(cè)出有聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)相互串聯(lián)。

1.5 核心基因的表達(dá)量分析及生存分析

本研究采用GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析[12]。GEPIA基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php）是一種用于癌癥和正常組織基因表達(dá)以及交互式分析的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，提供交互式和自定義功能，包括差異基因表達(dá)分析、生存分析。UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）是基于TCGA，MET500和CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站，不僅能夠使用戶識(shí)別生物標(biāo)志物或執(zhí)行在線驗(yàn)證感興趣的基因，還能夠提供編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)譜及患者生存信息等。本研究通過(guò)GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心基因在CRC和正常組織中的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。

Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.kmplot.com/analysis/）用于檢測(cè)核心基因的表達(dá)水平與患者預(yù)后關(guān)系的分析[13]。Kaplan-Meier plotter能夠評(píng)估54 000個(gè)基因（mRNA，miRNA，蛋白質(zhì)）對(duì)21種腫瘤的影響，數(shù)據(jù)的來(lái)源包括GEO、EGA和TCGA。該工具的主要目的是發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證生存生物標(biāo)志物。在數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入基因名稱，選擇總生存期，設(shè)定P＜0.05為顯著性差異，繪制生存曲線。

1.6 核心基因相關(guān)的藥物敏感性分析

藥物敏感性分析將823種腫瘤細(xì)胞系和545種藥物的mRNA表達(dá)譜結(jié)合在CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)中[14]，CTRP數(shù)據(jù)庫(kù)包括CTRPv2.0_2015_ctd2_Expanded Dataset、ctrpv2.1_2016_pub_NatChemBiol_12_109、和CTRPv2.2_2015_pub_CancerDisc_5_1210。這些化合物包括FDA批準(zhǔn)的藥物、臨床候選藥物和小分子探針等。本研究采用Pearson相關(guān)分析方法，計(jì)算SPP1在癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及曲線下面積（AUCs）。

1.7 核心基因與天然化合物相關(guān)性分析

STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)用于檢索被預(yù)測(cè)的化合物和蛋白質(zhì)之間互作關(guān)系的平臺(tái)，化合物與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、數(shù)據(jù)庫(kù)以及文獻(xiàn)中的研究被證實(shí)（http://stitch.embl.de/）。STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)包含超過(guò)30 000種小分子化合物以及來(lái)自1133個(gè)物種的260萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系。本研究采用STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析核心基因與篩選出的天然化合物之間的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析均使用系統(tǒng)默認(rèn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，采用對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選

本研究從GSE25070芯片中篩選出84個(gè)上調(diào)基因及200個(gè)下調(diào)基因，從芯片GSE110225中篩選出54個(gè)上調(diào)基因及133個(gè)下調(diào)基因。圖1A所示為兩個(gè)芯片的差異基因表達(dá)火山圖，圖中藍(lán)色點(diǎn)代表下調(diào)基因，紅色點(diǎn)代表上調(diào)基因。進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集的差異基因取交集，得到22個(gè)共上調(diào)基因和74個(gè)共下調(diào)基因，表1中列舉了共變化的差異基因。

表1 兩例芯片中共上調(diào)及共下調(diào)的差異表達(dá)基因Table 1 Two cases of differentially expressed genes that were co-up-regulated and co-down-regulated in the chip

圖1 差異基因的篩選（A）差異基因火山圖。（B）兩個(gè)芯片中共上調(diào)和共下調(diào)基因韋恩圖Figure 1 Screening of differential genes（A）Differential gene volcano map（B）The Venn diagram of the two chips up-regulated and down-regulated genes

2.2 差異基因的富集分析

2.2.1 GO富集分析

本研究采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)22個(gè)共上調(diào)基因和74個(gè)共下調(diào)基因進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果如圖2和表2所示，上調(diào)的生物學(xué)過(guò)程主要有膠原蛋白分解代謝的過(guò)程、細(xì)胞外基質(zhì)的分解及中性粒細(xì)胞趨化性的正調(diào)控等過(guò)程；細(xì)胞組分主要有細(xì)胞外區(qū)域、蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)等；分子功能主要有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細(xì)胞外基質(zhì)綁定、趨化因子的活動(dòng)及細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分等。下調(diào)的生物學(xué)過(guò)程主要有鋅離子的細(xì)胞反應(yīng)、碳酸氫鹽運(yùn)輸、碳代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)鎘離子的反應(yīng)等；細(xì)胞組分主要有頂端等離子體膜、質(zhì)膜等；分子功能主要有鋅離子結(jié)合、碳酸脫水酶和氧化還原酶活性等。

表2 差異表達(dá)基因的GO富集Table 2 Natural compounds related to SPP1 expression

（續(xù)表2）

圖2 差異基因的GO和KEGG富集分析（A）上調(diào)基因的GO和KEGG富集分析。（B）下調(diào)基因的GO和KEGG富集分析GO功能中綠色代表分子功能（MF），藍(lán)色代表細(xì)胞組分（CC），紅色代表生物學(xué)過(guò)程（BP）Figure 2 GO and KEGG enrichment analysis of differential genes（A）GO and KEGG enrichment analysis of up-regulated genes（B）GO and KEGG enrichment analysis of downregulated genes. In GO function, green represents molecular function（MF），blue represents cellcomponent（CC），and red represents biological process（BP）

2.2.2 KEGG富集分析

本研究采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)22個(gè)共上調(diào)基因和74個(gè)共下調(diào)基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的通路主要有ECM-受體交互作用、阿米巴病、軍團(tuán)病、NOD樣受體信號(hào)通路、粘著斑、沙門(mén)氏菌感染及蛋白質(zhì)消化吸收等；下調(diào)的通路主要有礦物質(zhì)的吸收、氮代謝等。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

將共表達(dá)的差異基因輸入String網(wǎng)站，物種選擇Homo sapiens，即可構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI圖，結(jié)果如圖3所示，PPI顯示各基因之間具有一定的相互作用關(guān)系，其中，各節(jié)點(diǎn)之間淺藍(lán)色及紫色的連線代表已被實(shí)驗(yàn)證明的已知相互作用關(guān)系；綠色、紅色及深藍(lán)色的線代表經(jīng)預(yù)測(cè)可能存在的相互作用關(guān)系，其分別代表基因臨近、基因融合及基因同現(xiàn)。在此基礎(chǔ)上，分別將上下調(diào)的差異基因?qū)隿ytoscape中，即得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心基因圖，共得到8個(gè)上調(diào)核心基因（MMP1、MMP3、MMP7、SPP1、CXCL1、CXCL2、CXCL8、COL1A1）及 5個(gè)下調(diào)核心基因（MT1F、MT1E、MT1M、MT1H、MT1G）。

圖3 差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因（A）上調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因。（B）下調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因。Figure 3 PPI network and core genes of differential genes（A）PPI network and core genes of up-regulated genes（B）Down-regulated gene PPI network and core genes.

2.4 核心基因的表達(dá)水平及生存分析

我們進(jìn)一步通過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的核心基因的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，我們?cè)贕EPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)了核心基因在結(jié)直腸癌組織與相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)水平，并在Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)了其表達(dá)水平與患者生存期的關(guān)系。結(jié)果如圖4所示，最終我們篩選出在這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中表達(dá)水平與預(yù)后水平均有顯著性差異的SPP1和MT1E基因。SPP1基因在結(jié)腸癌及直腸癌組織中的表達(dá)水平均高于相應(yīng)的正常組織，并且隨著腫瘤進(jìn)展，其表達(dá)水平進(jìn)一步升高。SPP1基因在結(jié)直腸腺癌及黏液型腺癌中的表達(dá)水平均高于正常組織。生存曲線顯示SPP1的高表達(dá)與患者更短的生存期呈正相關(guān)。MT1E基因在結(jié)腸癌及直腸癌組織中的表達(dá)水平均低于相應(yīng)的正常組織，并且隨著腫瘤進(jìn)展，其表達(dá)水平進(jìn)一步降低。MT1E基因在結(jié)直腸腺癌及黏液型腺癌中的表達(dá)水平均低于正常組織。生存曲線顯示MT1E的低表達(dá)與患者更短的生存期呈正相關(guān)。因此，SPP1和MT1E基因可能成為評(píng)價(jià)CRC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

圖4 SPP1和MT1E的表達(dá)水平及生存分析（A）SPP1在結(jié)腸腫瘤（COAD）與直腸腫瘤（READ）中的表達(dá)水平；SPP1在COAD的不同分期中的表達(dá)水平；SPP1在結(jié)直腸腺癌及黏液型腺癌中的表達(dá)水平；SPP1表達(dá)水平與患者生存期的相關(guān)性分析。（B）MT1E在結(jié)腸腫瘤（COAD）與直腸腫瘤（READ）中的表達(dá)水平；MT1E在COAD的不同分期中的表達(dá)水平；MT1E在結(jié)直腸腺癌及黏液型腺癌中的表達(dá)水平；MT1E表達(dá)水平與患者生存期的相關(guān)性分析。Figure 4 The expression level and survival analysis of SPP1 and MT1E（A）The expression level of SPP1 in colon tumors（COAD）and rectal tumors（READ），the expression level of SPP1 indifferent stages of COAD；the expression level of SPP1 in colorectal adenocarcinoma and mucinous adenocarcinoma;SPP1 expression Analysis of the correlation between the level and the survival time of patients.（B）The expression levelof MT1E in colon tumor（COAD）and rectal tumor（READ）；the expression level of MT1E in different stages of COAD，the expression level of MT1E in colorectal adenocarcinoma and mucinous adenocarcinoma；MT1E expressionAnalysis of the correlation between the level and the survival period of patients.

2.5 藥物敏感性分析

為了更好地了解核心基因的表達(dá)與藥物反應(yīng)的相關(guān)性，從而為臨床用藥提供指導(dǎo)，我們進(jìn)一步對(duì)篩選出的核心基因進(jìn)行了藥物敏感性分析。由于CTRP數(shù)據(jù)庫(kù)中未查詢到MTIE基因的相關(guān)藥物，因此我們僅對(duì)SPP1進(jìn)行了藥物敏感性分析。首先，我們?cè)u(píng)估了823個(gè)腫瘤細(xì)胞系中SPP1的表達(dá)與來(lái)自CTRP的545種藥物的響應(yīng)數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。在所有癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)31種藥物與SPP1表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05，相關(guān)系數(shù)R＞0.2）；有2種藥物與SPP1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05，相關(guān)系數(shù)R＜-0.2）。圖5A中列舉了相關(guān)性最強(qiáng)的10個(gè)正相關(guān)的藥物及2個(gè)負(fù)相關(guān)藥物。SPP1表達(dá)越高，對(duì)應(yīng)的AUC值越小，藥物反應(yīng)越好。因此，我們認(rèn)為這31種藥物對(duì)SPP1低表達(dá)腫瘤可能具有較好的治療效果，而對(duì)高表達(dá)SPP1的腫瘤可能會(huì)表現(xiàn)出耐藥性反應(yīng)。為了使分析更加具體，我們將腫瘤分為10種腫瘤類型，對(duì)SPP1的表達(dá)與545種藥物的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物反應(yīng)率因腫瘤類型而異（圖5B），在皮膚腫瘤細(xì)胞系中，有大約20%的藥物反應(yīng)與SPP1表達(dá)有關(guān)；而在大腸腫瘤細(xì)胞系中，約10%的藥物其反應(yīng)與SPP1表達(dá)相關(guān)。

圖5 SPP1的藥物敏感性分析（A）823種癌細(xì)胞株SPP1的表達(dá)與545種藥物的相關(guān)系數(shù)（x軸）和-log10（p-value）（y軸）火山圖。（B）10種不同腫瘤類型中相關(guān)系數(shù)R大于0.3或小于-0.3，且P值小于0.05的藥物所占比例。Figure 5 Drug sensitivity analysis of SPP1（A）The correlation coefficient（x-axis)）and-log10（p-value）（y-axis）volcano plots of the expression of SPP1 in 823 cancer cell lines and 545 drugs.（B）The proportion of drugs with a correlation coefficient R greater than 0.3 or less than-0.3 and a P value less than 0.05 among the 10 different tumor types.

在此基礎(chǔ)上，我們關(guān)注了與大腸腫瘤細(xì)胞系有相關(guān)性的藥物，并從中挑選出天然化合物（表3）。最終發(fā)現(xiàn)天然化合物葫蘆素I、姜黃素、雷公藤甲素、根皮素、異吳茱萸堿、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）和一種從海綿中提取出的微管蛋白抑制劑與大腸腫瘤細(xì)胞系中SPP1的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。我們進(jìn)一步在STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)SPP1蛋白及以上天然化合物進(jìn)行互作預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葫蘆素I、姜黃素、雷公藤甲素、根皮素及EGCG與SPP1的表達(dá)存在一定的相互作用關(guān)系。該結(jié)果提示以上五種天然化合物可能對(duì)SPP1低表達(dá)的大腸腫瘤具有較好的治療作用，而對(duì)SPP1高表達(dá)的大腸腫瘤可能具有耐藥性，這為臨床上的個(gè)體化給藥治療提供了一定的指導(dǎo)。

表3 與SPP1表達(dá)相關(guān)的天然化合物Table 3 Natural compounds related to SPP1 expression

3 討論

結(jié)直腸癌目前已成為世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅了人類的生命健康。在臨床治療中，多數(shù)結(jié)直腸腫瘤患者初診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者預(yù)后差，生存率極低，其五年生存率僅為13%[3]，而常用的化學(xué)藥物治療和放射治療的整體治療效果不容樂(lè)觀，因此迫切需要找到更為有效的治療靶點(diǎn)或臨床藥物。目前，大數(shù)據(jù)分析已成為一種統(tǒng)籌整合信息的分析方法，由于該分析基于大量原始數(shù)據(jù)，并且能夠從數(shù)據(jù)中尋找普遍規(guī)律，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可靠。本研究通過(guò)篩選基因芯片，尋找兩個(gè)芯片中共同的差異基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行進(jìn)一步的分析，進(jìn)而探索結(jié)直腸癌潛在有效的生物標(biāo)志物，從而為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶標(biāo)并為臨床用藥提供指導(dǎo)。

圖6 SPP1-天然化合物的相關(guān)性分析Figure 6 Correlation analysis of SPP1-natural compounds

本研究通過(guò)對(duì)22個(gè)共上調(diào)基因和74個(gè)共下調(diào)基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)了分泌磷蛋白1（SPP1）和MT1E基因在多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均具有顯著性差異，且與患者的生存預(yù)后顯著相關(guān)，因此，本研究結(jié)果預(yù)測(cè)SPP1和MT1E基因可能成為評(píng)價(jià)CRC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。SPP1作為一種細(xì)胞因子，可參與增強(qiáng)干擾素-γ和白細(xì)胞介素-12的產(chǎn)生，減少白細(xì)胞介素-10的產(chǎn)生，在產(chǎn)生I型免疫的過(guò)程中起重要作用。并且其編碼的蛋白質(zhì)能夠被分泌并以高親和力結(jié)合羥基磷灰石，從而作為一種主要的非膠原骨蛋白參與破骨細(xì)胞與礦化骨基質(zhì)的附著過(guò)程，這對(duì)細(xì)胞-基質(zhì)相互作用過(guò)程具有重要意義。有研究顯示SPP1與胃腺癌[15]及肝細(xì)胞癌[16]的治療敏感性顯著相關(guān)。SPP1可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的進(jìn)展[17]，并且SPP1可通過(guò)激活上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[18]。這與我們的分析結(jié)果相一致。金屬硫蛋白1E（MT1E）是一種蛋白質(zhì)編碼基因，主要參與細(xì)胞新陳代謝、礦物質(zhì)吸收、銅穩(wěn)態(tài)及鋅穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過(guò)程。MT1E具有多種能夠結(jié)合各種重金屬的半胱氨酸殘基，可與蛋白質(zhì)、鋅離子及其他金屬離子結(jié)合。有研究顯示MT1E在腫瘤的形成、發(fā)展和耐藥性中起著關(guān)鍵作用，它可作為一種肝細(xì)胞腫瘤抑制因子[19]，但是在肝癌后期表達(dá)明顯升高并促進(jìn)腫瘤發(fā)展[20]。低表達(dá)的MT1E是前列腺癌進(jìn)展的生物標(biāo)志物[21]，而僅有一篇研究顯示MT1E可能參與到組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡的過(guò)程中[22]。SPP1是本研究中篩選出的結(jié)直腸腫瘤關(guān)鍵上調(diào)基因，GO分析中顯示在結(jié)直腸腫瘤中上調(diào)的生物學(xué)過(guò)程主要有膠原蛋白分解代謝的過(guò)程、細(xì)胞外基質(zhì)的分解，上調(diào)的信號(hào)通路主要有ECM-受體交互作用等。MT1E是本研究中篩選出的結(jié)直腸腫瘤關(guān)鍵下調(diào)基因，GO分析中顯示在結(jié)直腸腫瘤中下調(diào)的生物學(xué)過(guò)程主要有鋅離子的細(xì)胞反應(yīng)，分子功能有鋅離子結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程。以上關(guān)鍵蛋白的生物學(xué)功能與我們的GO與KEGG分析結(jié)果相一致。

中醫(yī)學(xué)將結(jié)直腸癌歸屬于“積聚”“癥瘕”“臟毒”“腸風(fēng)”“腸覃”“腸癖”“鎖肛痔”等范疇，明代《外科大成》有“鎖肛痔，肛門(mén)內(nèi)外如竹節(jié)鎖緊，形如海蜇，里急后重，糞便細(xì)而帶扁，時(shí)流臭水……”的記載，與結(jié)直腸癌的臨床癥狀基本相符?？梢?jiàn)，結(jié)直腸癌病位在腸，以脾腎虛弱為本，以痰瘀、濕熱為標(biāo)，是一種本虛標(biāo)實(shí)的疾病[23]。藥物敏感性分析篩選出葫蘆素I、姜黃素、雷公藤甲素、根皮素及沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）與SPP1的表達(dá)存在一定的相關(guān)性。天然葫蘆素存在于多種十字花科、葫蘆科、玄參科等植物中，具有解毒清熱，利濕退黃等功效。臨床上主要用于濕熱毒盛所致的遷延性肝炎、慢性肝炎及原發(fā)性肝癌的輔助治療。葫蘆素I在祛痰、去濕熱、去水腫方面的功效與結(jié)直腸癌痰瘀、濕熱的本質(zhì)相合，已有研究表明葫蘆素家族的另一成員葫蘆素E能夠增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[24]，而葫蘆素I被報(bào)道能夠顯著抑制乳腺癌[25]和卵巢癌[26]細(xì)胞的凋亡。姜黃素是一種從姜黃根莖中提取得到的黃色色素，其抗氧化、抗炎、逆轉(zhuǎn)肝損傷、提高免疫力的作用已被廣泛報(bào)道[27]。高血壓、高血脂及高膽固醇已被認(rèn)為是增加結(jié)直腸癌發(fā)病率的危險(xiǎn)因素，而姜黃素的降血脂功效對(duì)結(jié)直腸癌的臨床治療將會(huì)具有積極作用[28]。同時(shí)，姜黃素對(duì)腫瘤也具有顯著的抑制作用，研究報(bào)道姜黃素能夠顯著抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展[29]，逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸腫瘤的耐藥性[30]，并且針對(duì)姜黃素的載藥也已開(kāi)發(fā)了一些新型納米遞送系統(tǒng)[31]，從而更好地發(fā)揮抑瘤作用。雷公藤甲素是從衛(wèi)矛科植物雷公藤的根、葉、花及果實(shí)中提取的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一。藥理和臨床試驗(yàn)表明，雷公藤甲素具有顯著的免疫抑制、抗炎、抗生育及抗腫瘤等生物活性，其在結(jié)直腸腫瘤方面也被報(bào)道具有顯著的抑制作用[32-33]。還有研究表明雷公藤甲素能夠有效減輕小鼠的腸道炎癥[34]，其對(duì)結(jié)腸“炎-癌”轉(zhuǎn)化方面的獨(dú)特功效對(duì)未來(lái)用于結(jié)直腸癌的臨床治療具有積極地指導(dǎo)作用。根皮素主要分布于蘋(píng)果、梨等多汁水果的果皮及根皮中，是一種新型天然皮膚美白劑，研究顯示根皮素能夠與阿托伐他汀或釕協(xié)同發(fā)揮抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[35-36]。EGCG是茶多酚中的有效活性成分，目前的研究主要顯示EGCG可以用來(lái)保護(hù)正常細(xì)胞和組織免受氧化損傷，而口服EGCG被報(bào)道可加重AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸腫瘤的生成[37-38]。本研究篩選出的以上五種天然化合物均與SPP1表達(dá)相關(guān)的結(jié)直腸腫瘤呈正相關(guān)性，這可能對(duì)未來(lái)結(jié)直腸癌的臨床用藥及個(gè)體化給藥方案提供一定的參考價(jià)值。在今后的研究中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)中醫(yī)藥有效成分的深入探索，并明確中醫(yī)藥的作用機(jī)理，以更好地將中醫(yī)藥應(yīng)用于結(jié)直腸癌的臨床治療中。

綜上所述，SPP1和MT1E基因可能成為評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，并且葫蘆素I、姜黃素、雷公藤甲素、根皮素及EGCG對(duì)SPP1相關(guān)的結(jié)直腸腫瘤具有一定的藥物反應(yīng)相關(guān)性。因此，我們的研究可能為結(jié)直腸癌提供新的生物標(biāo)志物并對(duì)其臨床用藥提供參考。