張娜蔣刈宋立強鮑文琪高搏袁永一高志英游艷琴侯偉張弢楊貴和王明明*

1 北京貝康醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司（北京 101111）

2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所，上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室（上海 200011）

3 解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科解放軍總醫(yī)院耳聾病分子診斷中心（北京 100853）

4 解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科（北京 100853）

5 南京大學(xué)現(xiàn)代工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院（南京 210093）

產(chǎn)前診斷能夠?qū)ε咛セ蛱菏欠窕加心承┻z傳病或先天畸形在出生前做出準(zhǔn)確診斷，是預(yù)防和控制出生缺陷的重要手段。耳聾是常見的出生缺陷，超過60%的先天性耳聾是遺傳因素導(dǎo)致的，分子診斷技術(shù)是目前檢測遺傳性耳聾的主要方法[1]。目前，臨床上獲取胎兒細胞的金標(biāo)準(zhǔn)是羊膜腔穿刺和宮腔絨毛取樣。這些方法的診斷結(jié)果雖然準(zhǔn)確可靠，但對孕婦和胎兒有宮內(nèi)感染和流產(chǎn)發(fā)生的風(fēng)險[2]。孕婦外周血中的胎兒有核紅細胞（Fetal Nu‐cleated Red Blood Cells,FNRBCs）含有胎兒全部的基因組，被認為是最理想的胎兒遺傳物質(zhì)來源細胞[3]。但是，20ml孕婦外周血中約含有0～20個胎兒細胞[4]，因此要獲得足夠數(shù)量的FNRBCs用于分子診斷必須進行富集分離，而體外進行FNRBCs富集分離需要大量孕婦外周血液。目前還沒有能夠適用于臨床的FNRBCs富集分離方法。

本文設(shè)計了一種在體捕獲FNRBCs方法，即將一種可以安全進入人體血管的結(jié)構(gòu)和功能化醫(yī)療導(dǎo)絲（functional and structured medical guidewire,FSMW）[5]固定于醫(yī)用注射器活塞上，再在FSMW上包被FNRBCs抗體，制成FNRBCs采集器。采集時，將注射器通過留置針將FSMW置于孕婦前臂靜脈血管中適當(dāng)時間，以捕獲孕婦外周血中的FN‐RBCs。整個采集過程操作簡單，不需要昂貴的儀器，對孕婦傷害性小。本文利用血液循環(huán)模擬裝置進行了原位捕獲FNRBCs可行性研究和遺傳性耳聾無創(chuàng)產(chǎn)前診斷新方法的探索。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2018年1月在中國人民解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科足月分娩的健康男性新生兒3例，取每例新生兒臍帶血10ml，EDTA抗凝。

選擇2019年3月-5月在中國人民解放軍總醫(yī)院耳聾病分子診斷中心就診的孕婦5例，分別編號為C001、C002、C003、C004、C005；取每例孕婦外周血10ml，EDTA抗凝。

本項目通過中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理編號S2016-120-02，在檢測前孕婦及家屬均被告知并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備采集器

分別稱取 0.06g EDC[1-ethyl-3-（3-dimethyl‐aminopropyl）carbodiimide hydrochlorid, Thermo Fisher]和 NHS （N-hydroxysuccinimide,Thermo Fisher）溶于2ml ddH2O，加入28ml二氧六環(huán)（1,4-Dioxane，阿拉?。?，放入FSMW，活化1小時后加入10μg/ml CD71抗體（sc-32272,SANTA CRUZ BIO‐TECHNOLOGY），4℃孵育24h。

1.2.2 體外捕獲

在體捕獲FNRBCs之前，需要進行FNRBCs原位捕獲效率及可行性研究。本文將輸液管和恒流泵組成血液循環(huán)模擬裝置來體外捕獲FNRBCs（見圖1）。根據(jù)手臂靜脈血管直徑（3～5mm）和血流速度（＜90ml/min），確定輸液管直徑為4mm和流速20ml/min。將FNRBCs采集器穿入輸液管中，注入孕婦外周血或新生兒臍血10ml，以流速20ml/min室溫下循環(huán)30min，使FNRBCs被采集器上的抗體捕獲。

圖1 循環(huán)血液模擬裝置Fig.1 The circulating blood simulation device

1.2.3 洗脫

加入0.25%胰酶溶液浸沒導(dǎo)絲，置于37℃水浴消化10min，取出導(dǎo)絲，離心、洗滌后留5μl細胞懸液。

1.2.4 FISH雜交

3例男性新生兒臍血經(jīng)體外捕獲后，采用An‐euVysion?Multicolor DNA Probe Kit（05J38-050）對洗脫下來的細胞進行FISH雜交，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.2.5 全基因組擴增

參考《胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）》說明書進行捕獲細胞的全基因組擴增。

1.2.6 STR分型

用 MicroreaderTM 21 ID System（V4.1，Code:10403421）對捕獲細胞擴增產(chǎn)物和孕婦外周血DNA進行復(fù)合擴增，在3100型遺傳分析儀上對STR基因座進行檢測。

1.2.7 Sanger測序及捕獲細胞來源鑒定

以5例孕婦的捕獲細胞擴增產(chǎn)物和外周血DNA為遺傳材料，分別對孕婦本人攜帶的耳聾基因致病性變異位點進行片段擴增，然后對擴增片段進行Sanger測序。捕獲細胞Sanger結(jié)果與孕婦外周血DNA Sanger結(jié)果及已知的胎兒羊水穿刺結(jié)果進行比較，從而判斷捕獲細胞的來源。

2 實驗結(jié)果

2.1 FISH雜交結(jié)果

FISH雜交探針的目標(biāo)染色體為18常染色體（橘色）、X染色體（綠色）和Y染色體（紅色）。在3例男性新生兒臍血捕獲細胞的FISH雜交結(jié)果中，共觀察到3個有明確信號的有核細胞，核型為46,XY（見圖2）。此實驗證明體外捕獲體系是可行的。

圖2 FISH結(jié)果（100×）Fig.2 The results of FISH(100×)

2.2 全基因組擴增產(chǎn)物

5例孕婦外周血捕獲細胞全基因組擴增產(chǎn)物達1.7-2.5μg。

2.3 STR分型結(jié)果

STR分型結(jié)果顯示同一孕婦的捕獲細胞擴增產(chǎn)物與外周血DNA存在1或多個明顯差異位點（見表1）。如C004的D8S1179基因座，STR分型顯示其捕獲細胞為三峰，而其外周血DNA為雙峰（見表1，圖3）。STR分型結(jié)果說明捕獲細胞中存在一定數(shù)量的FNRBCs。

圖3 C004的部分STR基因座擴增峰圖Fig.3 The amplification peaks of some STR loci of C004

表1 捕獲細胞擴增產(chǎn)物與外周血DNA的STR分型差異位點Table 1 The different sites of STR typing between the amplified products of captured cells and the peripheral blood DNA

2.4 Sanger測序結(jié)果及捕獲細胞來源鑒定

如表2所示，C004的捕獲細胞為FNRBCs，而其余4例均為母體細胞。C004孕婦本人致病性位點為SLC26A4:NM_000441:c.2168A＞G雜合突變，而C004捕獲細胞Sanger測序結(jié)果顯示該位點為正常基因型，與胎兒羊水穿刺結(jié)果一致（見表2）。Sanger測序峰圖顯示捕獲細胞中有低比例的SLC26A4:NM_000441:c.2168A＞G雜合突變（見圖4）。此結(jié)果說明C004捕獲細胞中含有較高比例的FNRBCs，也含有少量母體細胞；同時表明FNRBCs的陽性率為1/5。

圖4 C004的Sanger峰圖Fig.4 The Sanger peaks of C004

表2 Sanger結(jié)果及捕獲細胞來源鑒定Table 2 The Sanger results and the source identification of captured cells

3 討論

1969年，Walknowska等[6]發(fā)現(xiàn)母血中含有46,XY男性細胞，證實了孕婦外周血中確實存在胎兒細胞。這為利用孕婦外周血中胎兒細胞進行非侵入性產(chǎn)前診斷提供了理論依據(jù)。迄今為止已分離出4種胎兒細胞：滋養(yǎng)層細胞、胎兒淋巴細胞、胎兒粒細胞和FNRBCs。而FNRBCs具有其他細胞不可比擬的優(yōu)點：①正常人的外周血中不存在有核紅細胞，若出現(xiàn)則屬于病理現(xiàn)象；②含有胎兒完整基因組，便于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析；③具有較多且相對特異的抗原成分如CD71、CD36、GPA、珠蛋白（包括Hbγ、Hbε和Hbζ）和半乳糖殘基等；④妊娠早期大量出現(xiàn)，整個妊娠期持續(xù)存在，產(chǎn)后約90天在母體外周血中消失，用于診斷時不受前次妊娠影響等[7-10]。已有報道利用FNRBCs對非整倍體[11]、胎兒性別[12]、單基因病如血紅蛋白病[13]和地中海貧血[14]等進行檢測。如Kolialexi等[14]通過磁激活細胞分選法和單細胞顯微操作法對22例孕婦進行了FN‐RBCs分離，并用于β地中海貧血的產(chǎn)前診斷。該方法的FNRBCs陽性率為9.8%。雖然這些技術(shù)還處于初期研究階段，但是這些研究結(jié)果為FNRBCs應(yīng)用于臨床疾病的檢測提供了可能。

胎兒細胞用于產(chǎn)前診斷所面臨的主要的問題是母血中胎兒細胞含量稀少和母體細胞污染，所以需要嚴格將母血細胞與胎兒細胞分離。目前常用的富集分離方法有微流控技術(shù)、流式細胞儀分選法、磁激活細胞分選法、密度梯度離心法、親和素分離法和單細胞顯微操作法等。2002年發(fā)表了以開發(fā)非侵入性產(chǎn)前診斷為目的的前瞻性、多中心研究結(jié)果[15]。該研究以FNRBCs為中心，主要采用兩種策略進行FNRBCs富集，分別為磁激活細胞分選法富集CD71抗體標(biāo)記的細胞和流式細胞儀分選法分離血紅蛋白F（HbF）抗體標(biāo)記的細胞。但研究結(jié)果并不令人滿意，染色體異常樣本中成功捕獲一個以上胎兒細胞的比例為74.4%，假陽性率為0.6%～4.1%，該結(jié)果還無法運用到臨床檢測中。與這些方法相比，本文方法操作簡單，不需要昂貴儀器，更不需要抽取大量的孕婦外周血。但目前最大問題是捕獲的FNRBCs數(shù)量和純度較低，這主要受限于母血量和抗體的特異性。由于目前還沒有完成安全性評價，采集器還不能進行孕婦在體捕獲試驗，體外捕獲血量無法滿足?？贵w方面，目前應(yīng)用較多的是CD71抗體，但CD71也存在于早期紅細胞、單核細胞等細胞膜上，所以用CD71抗體分離FNRBCs會存在母體細胞污染[16]。另外，目前最常用的細胞來源鑒定方法是用Y染色體特異序列探針進行FISH雜交，但該方法受到胎兒性別的限制。本文采用了STR分型法，STR廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中，符合孟德爾遺傳規(guī)律，胎兒STR分型一半與母親相同，另一半與父親相同。這對判斷細胞是否為胎兒細胞具有重要價值。該方法對男女性胎兒均適用，彌補了FISH雜交鑒定細胞來源受胎兒性別限制的不足。

目前，臨床上獲取胎兒細胞進行產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是羊膜腔穿刺和宮腔絨毛取樣，但對孕婦和胎兒有宮內(nèi)感染和流產(chǎn)發(fā)生的風(fēng)險。基于母血中游離DNA的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT），由于技術(shù)本身的局限性，僅能作為篩查手段，即NIPT結(jié)果為陽性孕婦，仍需進行有創(chuàng)性診斷。隨著單克隆抗體技術(shù)、單細胞基因診斷技術(shù)的成熟，胎兒細胞的分離方法較以往得到了明顯改善，可有望從母血中分離出少量胎兒細胞用于無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷。下一步我們將在孕猴上進行在體原位捕獲實驗，以期克服體外捕獲的不利條件，提高捕獲效率和穩(wěn)定性，為孕婦在體捕獲FNRBCs并應(yīng)用于耳聾等遺傳病的產(chǎn)前無創(chuàng)診斷提供更有利的可靠證據(jù)。