王大華 何茜 趙凱 程思 何清

1 中國(guó)礦業(yè)大學(xué)

2 中國(guó)礦業(yè)大學(xué)附屬醫(yī)院

3 鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院

4 鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市婦幼保健院

聽力損傷是人類最常見的感覺神經(jīng)損傷，它影響了超過6%的世界人口[1]，因此，這種殘疾造成了非常嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)影響[2]。聽力損傷有許多原因，其中最常見的是老年性耳聾[3,4]。除了這些因素，越來越多的證據(jù)表明聽力損傷是糖尿病的另一種致殘性并發(fā)癥[5,6]。大多數(shù)聽力損傷病例是由于內(nèi)耳中的機(jī)械感受器——感覺毛細(xì)胞的退化造成的[7-9]。

Gjb2基因位于染色體13q12上，Gjb2基因突變是聽力障礙的最常見原因[10,11]。有文獻(xiàn)研究將Gjb2小鼠的聽覺表型與耳蝸導(dǎo)管中的細(xì)胞凋亡和氧化損傷聯(lián)系起來[12]，但是Gjb2對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激的調(diào)控作用尚不明確。因此在本課題中，選取HEI-OC1細(xì)胞株，通過高糖處理，并在細(xì)胞中過表達(dá)Gjb2，深入研究Gjb2在高糖誘導(dǎo)的HEIOC1細(xì)胞株凋亡與氧化應(yīng)激中的作用，為保護(hù)高糖引起的HEI-OC1細(xì)胞株損傷提供了新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 HEI-OC1細(xì)胞培養(yǎng)和高糖處理

House Ear Institute-Organ of Corti 1 （HEI-OC1）細(xì)胞在37℃，5% CO2的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[13]。對(duì)于血糖處理，HEIOC1細(xì)胞用不同濃度 （5.5、11、22、33 mM）的血糖處理24 h。根據(jù)葛均波等主編的內(nèi)科學(xué)（第9版）可知有效血漿滲透壓公式為：Posm=2×（Na++K+）+Glu。其中血糖濃度對(duì)其影響較小，血鈉濃度對(duì)其影響較高。根據(jù)公式可估算出實(shí)驗(yàn)中各組血糖對(duì)應(yīng)的有效血漿滲透壓分別：control組-295mOsm；5.5mM組-300.5mOsm；11mM組-306mOsm；22mM組-317mOsm；33mM組-328mOsm。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

過表達(dá)Gjb2的質(zhì)粒 （pcDNA-Gjb2）和對(duì)照質(zhì)粒 （pcDNA-NC）均購(gòu)自 GenePharma Co.（上海，中國(guó)）。按照Lipofectamine 2000 （Invitrogen）說明書轉(zhuǎn)染pcDNA-NC和pcDNA-Gjb2[14]。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 Tunel實(shí)驗(yàn)

用2%福爾馬林在37℃固定各組細(xì)胞24h，用0.1% Triton X‐100在冰上滲透2min，然后在37℃黑暗條件下用50 μl Tunel反應(yīng)混合物孵育1h，加入DAPI染核 5min。在熒光顯微鏡（LSM880，Zeiss，Germany）下觀察結(jié)果[15]。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡[16]

按照Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（4030ES20，Sigma，San Francisco，California，USA）的說明，按 1：2：50 比例將 Annexin-V-FITC、PI、HEPES緩存液配成Annexin-V-FITC/PI染液。每100 μL染液重懸1×106個(gè)細(xì)胞，振蕩混勻，室溫孵育15 min后加入1 mL HEPES緩存液，振蕩混勻。以488 nm波長(zhǎng)激發(fā)525、620 nm帶通濾片分別檢測(cè)FITC、PI熒光，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5 RT-qPCR

采 用 RNeasy Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA，USA）提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （RR047A,Takara，Japan）進(jìn) 行逆 轉(zhuǎn) 錄 得到 cDNA。 使 用SYBR? Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）kit（DRR081,Takara，Japan）和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（ABI 7500，ABI，F(xiàn)oster City，CA，USA）中進(jìn)行qRTPCR反應(yīng)，引物由上海生工合成（引物序列見表1）。記錄各孔 Ct值，以 GAPDH[17]為內(nèi)參，采用公式 2-ΔΔCt法計(jì)算產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR引物Table 1 qPCR primers

1.6 Western blot

蛋白用10% SDS-PAGE進(jìn)行分離電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5% BSA室溫封閉2 h，分別加入稀釋的一抗，4℃孵育過夜，洗膜后，二抗IgG室溫孵育1 h，ECL工作液 （美國(guó)EMD Millipore公司）顯影。用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行灰度定量，β-actin作為內(nèi)參。所有抗體均購(gòu)自Abcam （Cambridge，UK），每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[18]。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS生成[19]

用PBS洗滌細(xì)胞，并在50μL反應(yīng)體積中以105個(gè)細(xì)胞重懸。5-（and-6）-chloromethyl-20,70-di‐chlorodihydrofluorescein diacetate （CM-H2DCFDA）在最終濃度為5μM時(shí)用于測(cè)量細(xì)胞質(zhì)活性氧水平。細(xì)胞在黑暗中于37℃孵育30min，在C6 Accuri?流式細(xì)胞儀上，在λem=530±30nm處測(cè)量CMH2DCFDA的熒光。使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（USA）進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，多組間比較采用one-way ANOVA分析。P＜0.05表示差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞凋亡

HEI-OC1細(xì)胞經(jīng)高糖處理后，首先通過Tunel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HEI-OC1細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示與Control組比較，HG組HEI-OC1細(xì)胞凋亡率顯著升高（圖1A）。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果也顯示與Control組比較，高糖處理后，凋亡率顯著升高（圖 1B）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，與 Control組比較，高糖處理后BCL2的mRNA表達(dá)顯著降低，而BAX、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達(dá)則顯著升高（圖1C）。Western blot實(shí)驗(yàn)也呈現(xiàn)了類似的結(jié)果，高糖處理后BCL2的蛋白表達(dá)顯著降低，而BAX、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9的蛋白表達(dá)則顯著升高（圖1D）。上述所有結(jié)果提示高糖處理誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞的凋亡。

圖1 高糖誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞凋亡。A.Tunel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HEI-OC1細(xì)胞的凋亡情況；B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；C.RT-qPCR檢測(cè)了BCL2、BAX、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達(dá)；D.Western blot檢測(cè)BCL2、BAX、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9的蛋白表達(dá)；與Control組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，n=3。Fig.1 High glucose induces apoptosis of HEI-OC1 cells.A.Tunel experiment to detect the apoptosis of HEI-OC1 cells;B.Flow cytometry to detect cell apoptosis;C.RT-qPCR to detect the mRNA expression of BCL2,BAX,Caspase-3 and Caspase-9;D.Western blot detected the protein expression of BCL2,BAX,Cleaved-Caspase-3,and Cleaved-Caspase-9;compared with the Control group,*P＜0.05,**P＜0.01,n=3.

2.2 高糖誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激

為了證實(shí)高糖處理對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高糖處理后HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。結(jié)果顯示，與Control組比較，高糖處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（圖2A）。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，高糖處理顯著誘導(dǎo)了SOD2和catalase的mRNA和蛋白表達(dá)（圖2B，C）。

圖2 高糖誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)ROS的生成；B.RT-qPCR檢SOD2和catalase的mRNA表達(dá)；C.Western blot檢測(cè)高糖處理后HEI-OC1細(xì)胞中SOD2和catalase的蛋白表達(dá)；與Control組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，n=3。Fig.2 High glucose induces oxidative stress in HEI-OC1 cells.A.Flow cytometry to detect ROS generation in HEI-OC1 cells;B.RT-qPCR to detect SOD2 and catalase mRNA expression;C.Western blot to detect SOD2 and catalase protein expression in HEI-OC1 cells after high glucose treatment;compared with the Control group,*P＜0.05,**P＜0.01,n=3.

2.3 高糖抑制Gjb2的表達(dá)

為了確認(rèn)高糖處理對(duì)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，不同濃度的血糖處理細(xì)胞后，通過RT-qPCR檢測(cè)Gjb2的表達(dá)，結(jié)果顯示與Control組比較，隨著血糖濃度的升高Gjb2的表達(dá)顯著降低，在血糖濃度為22 mM時(shí)Gjb2的表達(dá)達(dá)到最低（圖3A）。接下來選擇22 mM血糖濃度處理不同時(shí)間后，通過RT-qPCR檢測(cè)Gjb2的表達(dá)，結(jié)果顯示與0h比較，22 mM血糖分別處理細(xì)胞8、16、24h時(shí)，Gjb2的表達(dá)顯著降低，24h后，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Gjb2的表達(dá)無顯著變化（圖3B）。22 mM血糖處理24h作為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件。

圖3 高糖影響Gjb2的表達(dá)。A.不同濃度血糖處理細(xì)胞后，RT-qPCR檢測(cè)Gjb2的表達(dá)；與Control組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。B.22 mM血糖濃度處理不同時(shí)間后，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中Gjb2的表達(dá)；與0h比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，n=3。Fig.3 High glucose affects the expression of Gjb2.A.After treating the cells with different concentrations of blood glucose,RT-qPCR detects the expression of Gjb2;compared with the Control group,*P＜0.05,**P＜0.01;B.After 22 mM blood glucose concentration treatment for different time,RT-qPCR detects the expression of Gjb2 in the cells;compared with 0h,*P＜0.05,**P＜0.01,n=3.

2.4 過表達(dá)Gjb2抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步確認(rèn)Gjb2在高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，在過表達(dá)Gjb2的同時(shí)用高糖處理細(xì)胞。Tunel和流式細(xì)胞術(shù)被用來檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果顯示與pcDNA-NC組比較，高糖能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)Gjb2則能逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖4A，B）。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞中BAX、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達(dá)，BCL2的mRNA表達(dá)則被顯著抑制（圖4C）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞中 BAX、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9的蛋白表達(dá)，而過表達(dá)Gjb2則能逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)BAX、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9表達(dá)的促進(jìn)作用；BCL2的檢測(cè)結(jié)果則于BAX趨勢(shì)相反（圖4D）。

圖4 過表達(dá)Gjb2抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。A.Tunel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HEI-OC1細(xì)胞的凋亡情況；B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；C.RT-qPCR檢測(cè)了BCL2、BAX、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達(dá)；D.Western blot檢測(cè)BCL2、BAX、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9的蛋白表達(dá)；與pcDNA-NC組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與pcDNA-NC+HG組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01，n=3。Fig.4 Overexpression of Gjb2 inhibits cell apoptosis induced by high glucose.A.Tunel experiment to detect the apoptosis of HEI-OC1 cells;B.Flow cytometry to detect cell apoptosis;C.RT-qPCR to detect the mRNA expression of BCL2,BAX,Caspase-3 and Caspase-9;D.Western blot detection of protein expression of BCL2,BAX,Cleaved-Caspase-3,Cleaved-Caspase-9;compared with pcDNA-NC group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with pcDNA-NC+Comparison of HG group,#P＜0.05,##P＜0.01,n=3.

2.5 過表達(dá)Gjb2抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激

為了確認(rèn)Gjb2在高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用，HEI-OC1細(xì)胞中過表達(dá)Gjb2后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。結(jié)果顯示，高糖處理顯著提高了ROS，而過表達(dá)Gjb2則能逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的ROS的生成（圖5A）。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示高糖處理能夠顯著促進(jìn)SOD2和catalase的mRNA和蛋白表達(dá)，而過表達(dá)Gjb2則能逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)SOD2和catalase表達(dá)的促進(jìn)作用（圖5B，C）。

圖5 過表達(dá)Gjb2抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激。A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高糖處理后HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)ROS的生成；B.RT-qP‐CR檢測(cè)高糖處理后HEI-OC1細(xì)胞中SOD2和catalase的mRNA表達(dá)；C.Western blot檢測(cè)高糖處理后HEI-OC1細(xì)胞中SOD2和catalase的蛋白表達(dá)；與pcDNA-NC組比較，**表示P＜0.01；與pcDNA-NC+HG組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01，n=3。Fig.5 Overexpression of Gjb2 inhibits cell oxidative stress induced by high glucose.A.Flow cytometry to detect the generation of ROS in HEI-OC1 cells after high glucose treatment;B.RT-qPCR to detect the mRNA expression of SOD2 and catalase in HEI-OC1 cells after high glucose treatment;C.Western blot detection The protein expression of SOD2 and catalase in HEI-OC1 cells after high glucose treatment;compared with pcDNA-NC group,**P＜0.01;compared with pcDNA-NC+HG group,#P＜0.05,##P＜0.01,n=3.

3 討論

聽力損傷和糖尿病是世界上最普遍的兩種致殘情況[20]。在基于人口的研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病和聽力損傷之間有很大程度的關(guān)聯(lián)[21]。眾所周知，糖尿病與神經(jīng)病變和微血管損傷有關(guān)，尤其影響周圍血管和神經(jīng)的功能[22,23]。在糖尿病發(fā)展過程中，耳蝸和聽覺神經(jīng)也有很高的損傷風(fēng)險(xiǎn)，如毛細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致永久性聽力損失或平衡障礙[6]，然而，糖尿病和聽力損傷過程之間的關(guān)聯(lián)的潛在機(jī)制在很大程度上仍然未知。

因此，本研究利用高血糖處理HEI-OC1細(xì)胞株，進(jìn)一步研究高血糖誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，為保護(hù)高血糖引起的HEIOC1細(xì)胞損傷提供了新的潛在靶點(diǎn)。

本研究將HEI-OC1細(xì)胞株進(jìn)行高糖處理后，檢測(cè)了HEI-OC1細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激。結(jié)果顯示，高糖處理后HEI-OC1細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加，同時(shí)伴隨著細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的升高。氧自由基的形成是導(dǎo)致多種類型聽力損傷的關(guān)鍵介質(zhì)[24,25]。研究表明耳蝸組織中的ROS是由線粒體產(chǎn)生的[26,27]。活性氧的積累阻斷了內(nèi)源性解毒途徑，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的氧化修飾和損傷。最終，激活凋亡信號(hào)通路，包括c-Jun-N末端激酶和P38 MAPK通路被激活，這可能誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞凋亡[28]。氧化應(yīng)激以及隨之而來的組織損傷，持續(xù)的高葡萄糖水平導(dǎo)致氧化應(yīng)激和耳蝸毛細(xì)胞的不可逆損傷[29]。與這一觀點(diǎn)相一致，一些抗氧化劑和增強(qiáng)內(nèi)在抗氧化防御的試劑已被證明能夠保護(hù)耳蝸HEI-OC1細(xì)胞免于凋亡[30]。

為了進(jìn)一步檢測(cè)高糖誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的深入機(jī)制，本研究用不同濃度的血糖處理HEI-OC1細(xì)胞不同時(shí)間后，檢測(cè)了Gjb2的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)高血糖會(huì)抑制Gjb2的表達(dá)。編碼縫隙連接蛋白Cx26的基因Gjb2的突變是感音神經(jīng)性聽力損傷的最常見原因[12]。Gjb2基因的突變占不同人群中所有非綜合征性耳聾病例的四分之一[31]。先前的研究表明，出生后早期Gjb2基因的敲除可導(dǎo)致小鼠模型外毛細(xì)胞的丟失[32]。有文獻(xiàn)報(bào)道縫隙連接蛋白的敲除，導(dǎo)致能量代謝出現(xiàn)障礙，高耗能細(xì)胞出現(xiàn)葡萄糖短缺，進(jìn)而導(dǎo)致ATP不足，導(dǎo)致大量的超氧化物產(chǎn)生，而超氧化物的聚集，通過凋亡途徑會(huì)導(dǎo)致耳蝸中細(xì)胞凋亡并最終導(dǎo)致耳蝸聽覺功能的喪失[33]。Gjb2基因過度表達(dá)，會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體蛋白激酶（PKC）的活化，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡抗氧化應(yīng)激的作用[34]。

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Cx26在耳蝸縫隙連接中高度表達(dá)，Cx26缺陷引起耳蝸細(xì)胞之間的連接障礙進(jìn)而導(dǎo)致縫隙連接通道的滲透性改變，而細(xì)胞間的連接又依賴于細(xì)胞外基質(zhì)，Cx26缺陷會(huì)引起細(xì)胞外基質(zhì)的異常，進(jìn)而細(xì)胞間的連接出現(xiàn)障礙和異常[35]。近幾年，有文獻(xiàn)報(bào)道，Cx30（-/-）小鼠中缺乏縫隙連接蛋白connexin30（Cx30）會(huì)導(dǎo)致血管紋內(nèi)皮細(xì)胞屏障的破壞，進(jìn)而影響聽力[36,37]。耳蝸毛細(xì)胞一旦失去周圍細(xì)胞的連接和支持，失去細(xì)胞-基質(zhì)之間的正常相互作用，必然造成耳蝸毛細(xì)胞的位置改變，并引起所謂的“厭食”性“自殺”行為[38,39]。本研究的結(jié)果顯示，在高血糖處理HEI-OC1細(xì)胞的同時(shí)，在細(xì)胞中過表達(dá)Gjb2后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Gjb2能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)異常，引發(fā)細(xì)胞間的電荷選擇性改變和信號(hào)傳遞及營(yíng)養(yǎng)和能量供應(yīng)障礙，進(jìn)而造成“失聯(lián)”細(xì)胞因細(xì)胞間連接的外基質(zhì)損害而發(fā)生失巢凋亡[40]。

綜上所述，在高糖誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激中，過表達(dá)Gjb2能夠發(fā)揮HEI-OC1細(xì)胞保護(hù)作用，這為保護(hù)高糖引起的HEI-OC1細(xì)胞損傷提供了新的潛在靶點(diǎn)。