張萌 趙艷輝 趙肖月 趙妍 史楠楠 龐泓

遼寧省沈陽市婦嬰醫(yī)院遺傳科（沈陽 110000）

耳聾在我國發(fā)病率約1‰～3‰[1]，其中90%以上的耳聾患者出生在無耳聾家族史的家庭[2]。耳聾的發(fā)生主要與遺傳因素和環(huán)境因素等有關(guān)，其中遺傳因素占60%[3]。遺傳性耳聾根據(jù)患者是否伴有耳外組織器官的發(fā)育異?；蚬δ苷系K可分為綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾，約70%遺傳性耳聾為非綜合征型，其主要遺傳方式為常染色體隱性遺傳[4]。中國人群的聾病分子流行病學調(diào)查顯示：我國常見的耳聾相關(guān)基因包括GJB2、SLC26A4、mt12srRNA及GJB3[5]。本研究采用微陣列基因芯片技術(shù)對43133例聽力正常孕早期婦女進行中國人常見4個耳聾基因9個突變位點的檢測，探討本地區(qū)聽力正常孕早期婦女中常見遺傳性耳聾基因致病突變攜帶情況，建立可行的遺傳性耳聾防控產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷流程。為推廣遺傳性耳聾防控工作提供科學參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究的研究對象為2014年7月-2020年11月就診于沈陽市婦嬰醫(yī)院產(chǎn)科門診的43133例孕早期孕婦。對受檢者及其配偶進行基本情況的采集，受檢者在充分知情同意的情況下，簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 血液標本采集

按照外周血采集標準操作流程，采集受檢者前臂外周血2-3mL到EDTA抗凝管，存放于醫(yī)用冰箱4℃保存。

1.2.2 DNA提取

DNA提取應(yīng)用血液基因組非柱式提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），提取DNA合格濃度在 100-200ng/μL，純度 OD260/280在 1.7-2.0之間。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增

針對9個突變位點的9組引物分成A和B兩個反應(yīng)體系分別進行多重PCR擴增。將晶芯九項遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒（北京博奧生物有限公司）中的PCR擴增引物混合物和試劑混合物分別充分混合（A、B管）后分裝，加入3μL的DNA樣本。預變性處理：37℃10min，95℃15min，96℃1min；擴增條件：94℃30s、55℃30s、70℃45s共32個循環(huán)，60℃10min。

1.2.4 雜交

從同一樣本模版的兩個不同擴增體系管（A、B）中各取3μL PCR產(chǎn)物加入到雜交緩沖液管中，充分混勻后用移液器將雜交反應(yīng)混合物經(jīng)芯片蓋玻片上的加樣孔垂直加入到芯片上后將密封好的雜交盒立即放入60℃的雜交儀器中60min。

1.2.5 芯片洗滌

取出雜交盒中的芯片放入芯片洗干儀中，程序為：洗滌液 I，42℃2 min，洗滌液 II，42℃1min×2次。1000rpm離心2min甩干。

1.2.6 芯片掃描及結(jié)果判讀

使用微陣列芯片掃描儀（LuxScan 10K/B）和相應(yīng)的遺傳性耳聾檢測芯片判別系統(tǒng)進行信號讀取及判斷。針對9個突變位點，若在同一位點中只有探針W出現(xiàn)陽性信號，判讀為該位點野生型；只有探針M出現(xiàn)陽性信號，判讀為該位點純合突變型；兩者均出現(xiàn)陽性信號，判讀為該位點雜合突變型。針對mt12SrRNA基因突變位點，只有探針M出現(xiàn)陽性信號判讀為均質(zhì)突變，兩者均出現(xiàn)陽性信號判讀為異質(zhì)突變，只有探針W出現(xiàn)陽性信號，判讀為該位點野生型。

1.2.7 基因測序

對GJB2和SLC26A4基因突變攜帶者配偶及產(chǎn)前診斷羊水樣本進行基因測序。外周血樣本采用EDTA抗凝管采集3-5mL，產(chǎn)前診斷羊水樣本采用羊水8-10mL離心后使用磁珠提取純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA；利用多重PCR技術(shù)擴增富集基因組DNA中靶序列并引入樣本標簽序列；利用多重PCR擴增技術(shù)擴增目的片段經(jīng)純化后，在DNA聚合酶、連接酶、磷酸酶的作用下完成PCR產(chǎn)物兩端特殊接頭的連接，經(jīng)過純化后完成文庫的制備；文庫質(zhì)檢后，將多個文庫混合為1個上機文庫；采用雙脫氧鏈終止法在測序儀（Applied Bio systems 3130，美國）上進行測序，獲取序列堿基信息，并將測序結(jié)果與標準序列進行對比。

2 結(jié)果

2.1 孕早期婦女基因芯片篩查結(jié)果

43133 例受檢者中，檢出2193例耳聾基因致病突變攜帶者，實際攜帶者人數(shù)為2167例，其中25例孕婦為雙雜合突變攜帶者及1例孕婦為GJB2基因雜合突變攜帶者同時伴有mt12SrRNA基因異質(zhì)突變見表1。突變攜帶率為5.08%（2193/43133），檢出GJB2基因1223例（2.84%,1223/43133）、SLC26A4基因 734 例 （1.70%,734/43133）、GJB3基 因 144 例（0.33%,144/43133）、mt12SrRNA基 因 92 例 （0.21%,92/43133），各個基因的具體位點分布情況見表2。隨訪到的攜帶者孕婦而配偶相應(yīng)基因檢測未見異常的患者中，暫未發(fā)現(xiàn)新生兒有聽力異常者。

表1 26例同時攜帶兩個不同耳聾基因變異患者的基因型及表型Table 1 Genotype and phenotype of 26 carriers of double heterozygousvariants of hereditary deafness gene

表2 2193例正常聽力孕早期攜帶者各個基因位點突變種類、例數(shù)及占比Table 2 Mutation types,number and proportion of each gene locus in 2193 normal hearing women in early pregnancy

2.2 攜帶者配偶相應(yīng)基因測序及結(jié)果

1957例GJB2及SLC26A4基因致病變異孕早期婦女中，1479例配偶知情選擇性進行了相應(yīng)基因測序，檢測出基因突變攜帶者為115例見表3。其中，發(fā)現(xiàn)夫婦雙方為同一基因致病突變攜帶者43例。另外根據(jù)配偶相關(guān)基因測序結(jié)果，需要孕婦再次采血進行相關(guān)基因測序的人數(shù)為27例，均未檢測到存在配偶突變基因上的位點突變。

表3 115例攜帶基因突變的孕婦丈夫相關(guān)基因測序情況Table 3 Related gene sequencing results of husbands of pregnant women with gene mutation

2.3 基因型沖突夫婦產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局

為同一基因致病突變攜帶者的43例夫婦中，19例行知情選擇性產(chǎn)前診斷。其中4例胎兒檢測出同一基因復合雜合突變；7例胎兒檢測出單一位點突變，后期隨訪均未發(fā)現(xiàn)新生兒存在聽力異常；8例胎兒未檢出致病變異，后期隨訪均未發(fā)現(xiàn)新生兒存在聽力異常見表4。

表4 19例行產(chǎn)前診斷家庭基因型分布情況及產(chǎn)前診斷結(jié)果Table 4 Genotype distribution and prenatal diagnosis results of 19 routine prenatal diagnosis families

24例孕婦與配偶基因型沖突但未進行產(chǎn)前診斷的家庭中，1例發(fā)生自然流產(chǎn)；2例胎兒出生后診斷為大前庭導水管綜合征并已經(jīng)進行了人工耳蝸植入；1例胎兒出生后聽力篩查未過，在進一步的診斷和治療中；其余20例新生兒聽力暫未見異常。

2.4 攜帶mt12SrRNA基因突變病例的家系分析及用藥指導

共檢測出mt12SrRNA基因致病變異92例，其中m.1555A＞G均質(zhì)/異質(zhì)突變83例，m.1494C＞T均質(zhì)/異質(zhì)突變9例。對上述所有受檢者進行了詳細的家系分析及遺傳咨詢。

3 討論

2013年世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的最新評估數(shù)據(jù)顯示,全球目前共有3.6億人存在不同程度的聽力障礙,占全球總?cè)丝诘?%。研究顯示，目前已經(jīng)明確的耳聾相關(guān)基因已有200多個[6]。在我國，由常見的耳聾相關(guān)基因GJB2、SLC26A4和mt12SrRNA突變所導致的耳聾占遺傳性耳聾的30%～40%，其中約21%的遺傳性耳聾與GJB2基因相關(guān)，約15%與SLC26A4基因相關(guān)，約4%與mt12SrRNA基因突變相關(guān)[7]。

GJB2基因突變是遺傳性耳聾最常見的致病原因，臨床表型具有明顯的多態(tài)性。GJB2基因編碼縫隙連接蛋白26（Cx26），在聲音傳導過程中，Cx26蛋白對鉀離子經(jīng)內(nèi)耳毛細胞循環(huán)回流進入耳蝸內(nèi)淋巴液起調(diào)節(jié)作用，發(fā)生突變后Cx26蛋白的生物活性喪失，鉀離子進入內(nèi)淋巴循環(huán)受影響，導致感音神經(jīng)性聾[8]。本地區(qū)育齡期婦女GJB2基因突變檢出率為2.84%（1223/43133），與文獻報道相似[9,10]。其中c.235delC位點檢出率居首位為2.02%（873/43133），其次為c.299-300delAT位點檢出率為0.56%（241/43133）。根據(jù)對攜帶GJB2基因突變孕婦配偶的基因檢測結(jié)果，c.109G＞A位點檢出率最高為32.1%（37/115），該位點突變的致病性既往存在爭議，但目前多數(shù)專家認為此突變?nèi)詾橹虏⌒酝蛔?，但其引起的聽力表型差異較大[11]，因此在本地區(qū)若GJB2基因（例如c.235delC）突變攜帶者配偶檢出c.109G＞A位點雜合突變，建議行聽力檢查監(jiān)測評估聽力水平，并定期進行聽力監(jiān)測。

SLC26A4基因編碼氯-碘離子轉(zhuǎn)運蛋白Pen‐drin,作為氯離子轉(zhuǎn)運體，調(diào)節(jié)內(nèi)淋巴液的離子平衡。在內(nèi)耳，氯離子轉(zhuǎn)運障礙可導致內(nèi)淋巴液成分的改變、內(nèi)淋巴囊液體潴留及內(nèi)淋巴管擴張。且由于滲透壓改變和成分改變的毒性機制導致膜迷路感覺上皮細胞的損傷，進而導致后天中度以上感音神經(jīng)性耳聾[12,13]。本地區(qū)育齡期婦女SLC26A4基因的檢出率為1.7%（734/43133），僅次于GJB2基因，其中c.919-2A＞G位點突變檢出率最高為1.38%（597/43133），與文獻報道相似[14-16]。在針對SLC26A4基因突變攜帶者配偶的檢測中我們發(fā)現(xiàn)，除了c.919-2 A＞G、c.2168A＞G最常見的致病變異以外，還檢出了攜帶c.1975G＞C雜合突變3例、ivs15+5G＞A雜合突變1例、c.1286C＞A雜合突變1例、c.2027T＞A雜合突變1例、ivs19+2T＞A雜合突變1例、c.2029C＞T雜合突變1例、c.1197delT雜合突變1例、c.757A＞G雜合突變1例、c.697G＞C雜合突變1例、c.1522A＞G雜合突變1例，以上突變位點均為致病性突變并且目前尚未納入本地區(qū)常規(guī)遺傳性耳聾基因篩查范圍，這意味著有一部分相關(guān)基因的攜帶者存在漏篩風險并且提示我們擴大耳聾基因篩查位點的范圍，提高耳聾相關(guān)基因檢出率。

mt12SrRNA基因突變是藥物性耳聾發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)，該基因發(fā)生突變后，使其編碼區(qū)域的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，改變后的結(jié)構(gòu)與細菌核糖體基因結(jié)構(gòu)非常相似，當接觸氨基糖甙類抗生素時，它與氨基糖甙類抗生素結(jié)合能力增加，阻礙了線粒體核糖體蛋白的合成，進而導致耳蝸的外毛細胞逐漸死亡導致永久性耳聾[17]。本地區(qū)育齡期婦女mt12SrRNA基因突變的檢出率為0.21%（92/43133），以m.1555A＞G最為常見。由于mt12SrRNA基因的遺傳方式以母系遺傳為主，我們對所有篩查出該基因的攜帶者均告知被檢者及其母系成員終身禁止使用氨基糖苷類藥物，并且為攜帶者發(fā)放用藥指導卡片，避免藥物聾的發(fā)生。GJB3基因是我國克隆的第一個基因，本地區(qū)GJB3基因攜帶率為0.33%（144/43133），該基因538C＞T位點突變被認為與高頻聽力下降有關(guān)[18]。

大部分以耳聾為唯一癥狀的非綜合征型耳聾主要的遺傳方式為常染色體隱性遺傳，有大量人群為聽力正常的隱形耳聾基因攜帶者，因此為生育年齡聽力正常人群進行常見耳聾基因檢測是十分必要的。本地區(qū)采用的篩查流程為首先為育齡期婦女進行常見耳聾基因篩查，對攜帶者配偶進行相關(guān)基因檢測，當夫婦雙方為同一基因致病突變攜帶者時，建議在孕婦孕周為16周-22周+6區(qū)間通過羊水穿刺的方式進行產(chǎn)前診斷，對采集到的羊水細胞進行相關(guān)基因高通量測序進而明確胎兒基因型，進一步實現(xiàn)降低遺傳性耳聾出生缺陷的目的。本地區(qū)篩查高風險家庭的產(chǎn)前診斷率為44.19%（19/43），在選擇進行產(chǎn)前診斷的家庭中，發(fā)現(xiàn)胎兒耳聾風險為100%的家庭占比21.05%（4/19）。根據(jù)隨訪結(jié)果，在24個放棄產(chǎn)前診斷的高風險家庭中，有3個家庭胎兒出生后發(fā)現(xiàn)存在聽力異常。因此，加強對耳聾基因的宣傳、加大遺傳咨詢的力度，進一步增強大眾對遺傳性耳聾的認知是十分必要的。

耳聾給家庭和社會都帶來極大的負擔，并且目前沒有耳聾的有效藥物治療方案，大多數(shù)耳聾患者只能依靠佩戴助聽器或植入人工耳蝸等輔助手段進行治療，因此做好耳聾的三級防控工作至關(guān)重要。隨著越來越多的遺傳性耳聾基因被克隆和鑒定，讓我們可以從分子的水平上全面的認識耳聾發(fā)生發(fā)展的過程并為臨床上開展耳聾基因檢測與診斷打下了堅實的基礎(chǔ)。因此，依靠先進的分子檢測技術(shù)在本地區(qū)建立適宜的遺傳性耳聾基因篩查流程，在原有的基礎(chǔ)上擴大致病位點的篩查范圍，并且通過多方面渠道加強對遺傳性耳聾的宣傳，進一步實現(xiàn)降低耳聾出生缺陷的防控目標。