張光輝，劉大軍，楊曉旭，劉 暢，閆志山，馮國軍

（黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境，哈爾濱 150080）

0 引言

菜豆(Phaseolus vulgaris L.)俗稱蕓豆、四季豆、飯豆等，是一年生豆科菜豆屬蔓生或矮生草本植物[1]。原產(chǎn)于美洲，在中國南北均有種植，菜豆種子同其他豆科種子一樣也具有硬實性。硬實種子具有種皮不透水而不能吸脹發(fā)芽并保持原來大小狀態(tài)，這種自我保護機制對物種的延續(xù)和傳播極為有利，但生產(chǎn)上，利用同一批未經(jīng)處理的種子播種后，由于種子硬實性，經(jīng)常會出現(xiàn)出苗不齊或缺苗的現(xiàn)象[2]。多數(shù)研究表明，種子硬實主要是種皮致密且缺乏透性[2-4]。在干燥的環(huán)境中會加速種皮細胞壁或細胞內含物脫水進而發(fā)生膠體變化形成硬實[5-6]。因而，可以通過改變種皮透性打破種子硬實性。大量研究表明，熱水浸種、激素處理、機械損傷、酸堿腐蝕等可以打破種子硬實[7-9]。然而不同植物種子或同一品種的不同批次種子硬實程度往往不同，因而破除硬實的條件需要進一步優(yōu)化。本研究選用硬實率較高的盛冠菜豆品種，經(jīng)浸水法篩選出的硬實種子為試驗材料，以簡單易行的溫水浸泡、熱水浸泡和低溫貯藏方式處理硬實種子，進而確定栽培中破除種子硬實性的適宜方法，為今后生產(chǎn)時破除菜豆種子硬實提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本次研究在前期品種篩選的基礎上，以“盛冠”菜豆種子作為實驗材料。試驗開始之前剔除雜質以及干癟和蟲蛀的種子，挑選籽粒飽滿，富有光澤的優(yōu)良種子進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子基本性狀

（1）種子百粒重的測定：將篩選過后的菜豆種子隨機選取100粒，用精度為萬分之一的電子天平稱重，每組6次重復，計算平均值。

（2）種子大小的測定：隨機選取凈種子50粒，利用游標卡尺測定種子的長度和寬度。

（3）種子吸水率的測定：隨機選取常規(guī)盛冠種子20粒，稱重并記錄m0后放入盛有50 mL蒸餾水的三角瓶浸泡并置于人工氣候箱，于2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72 h分別取出種子，在濾紙上吸干種子表面水分，稱重并記錄m1，每組3次重復。

吸水率(R)的計算見公式(1)。

式中：m0為浸種前種子的質量；m1為浸種后種子的質量。

（4）種子硬實率測定：將篩選過后的菜豆種子隨機選取100粒，置于裝有100 mL蒸餾水的三角瓶中，然后放置在人工氣候箱（光，25℃，12 h/暗，20℃，12 h）浸泡24h，統(tǒng)計完全未吸脹的種子粒數(shù)，計算種子硬實率，見公式(2)，3次重復，計算平均值[2]。

（5）種子吸水情況的測定：選取經(jīng)硬實率測定后完全吸脹的非硬實種子，自然風干7天。隨機挑選無破損、飽滿的非硬實種子20粒，稱重并記為m0，然后采用凡士林密封法[10]測定種子不同部位的吸水情況。用凡士林分別對種子作5個處理(標記為Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,CK)：處理Ⅰ，只有種臍未用凡士林密封；Ⅱ，只有種孔部位未密封；Ⅲ，只有內臍部位未密封；Ⅳ，用凡士林密封整粒種子；CK則不用凡士林密封種子。每個處理20粒，3次重復，按上面的方法密封種子后分別置于盛有蒸餾水的燒杯中，浸種24 h后取出種子，用吸水紙擦除種子表面的凡士林及其水分后稱量，記為m1。

吸水量(X)的計算見公式(3)。

式中：m0為浸種前種子的質量；m1為浸種后擦除種子表面凡士林及水分后種子的質量。

（6）種子含水量的測定：隨機選取種子20粒，于研磨機磨碎，先稱裝樣錫箔紙的質量m1，后稱取樣品4.8～5.0 g，記為 m2，于 130℃烘箱烘 1 h（烘箱需提前20 min預熱），取出樣品稱總重m3；每個樣品3次重復。

含水量(W)的計算見公式(4)。

式中：m1為裝樣錫箔紙的質量；m2為烘干前樣品的質量；m3為烘干后樣品和錫箔紙的總質量。

（7）種子硬度的測定：隨機選取25粒菜豆種子，用硬度計測定種子承受的最大力。

（8）種子生活力的測定[11]：隨機取出100粒菜豆種子，先用解剖刀劃破非生長點處的種皮，然后放入裝有100 mL蒸餾水的三角瓶中，置于人工氣候箱浸泡12 h，吸脹后轉至培養(yǎng)皿進行萌發(fā)2天，然后，用0.1%的TTC溶液染色，置于35℃烘箱避光培養(yǎng)4h，統(tǒng)計胚根染成紅色的種子粒數(shù)（即有生活力的種子），每組3次重復，計算平均值。

1.2.2 解除硬實處理 試驗選用硬實率較高的盛冠菜豆種子，經(jīng)24 h浸泡后篩選出完全未吸脹的菜豆硬實種子，晾干后做解除硬實試驗。

（1）溫水處理。

恒溫浸種：采用50℃、60℃、70℃三個溫度梯度的溫水分別浸泡15、30、45、60 min，方案如表1。

表1 恒溫溫水浸種破除種子硬實試驗設計方案

隨機選取20粒硬實種子，置于10 cm×10 cm的2層紗布并用棉繩捆綁，共12個處理，每個處理3次重復。3個獨立恒溫水浴鍋加蒸餾水后分別設定50℃、60℃、70℃三個溫度，提前30 min預熱，將捆綁好的菜豆種子浸泡，計時開始，每隔15、30、45、60 min取出一個處理的菜豆種子，并均勻放置在墊有兩層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，做好標記，待處理完后做萌發(fā)試驗。

變溫浸種：采用50℃、60℃、70℃三個溫度梯度的溫水分別浸泡15、30、45、60 min，然后室溫冷卻1 h（即恒溫處理后，室溫自然冷卻1h）。

（2）熱水處理。

恒溫浸種：采用80℃、90℃兩個溫度梯度的溫水分別浸泡2 min、5 min、10 min，方案見表2。

表2 恒溫熱水浸種破除種子硬實試驗設計方案

隨機選取20粒硬實種子，置于10 cm×10 cm的2層紗布并用棉繩捆綁，共7個處理，每個處理3次重復。獨立恒溫水浴鍋加蒸餾水后分別設定80℃、90℃兩個溫度，提前30 min預熱，將捆綁好的菜豆種子浸泡，計時開始，每隔2、5、10 min取出一個處理的菜豆種子，并均勻放置在墊有兩層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，做好標記，待處理完后做萌發(fā)試驗。

變溫浸種：采用80℃、90℃兩個溫度梯度的溫水分別浸泡2 min、5 min、10 min，然后室溫冷卻1 h（即恒溫處理后，室溫自然冷卻1h）。

（3）低溫處理。

隨機選取20粒硬實種子放入自封袋密封，在4℃和-20℃條件下分別放置1天、3天、7天后做萌發(fā)試驗，3次重復，方案如表3。

表3 低溫貯藏破除種子硬實試驗設計方案

1.3 萌發(fā)試驗

試驗采用常規(guī)的培養(yǎng)皿發(fā)芽法[11-12]，種子解除硬實處理后，均勻的排列在墊有兩層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，每個處理3次重復，每個重復20粒種子。處理完畢的種子放置于25/20℃（白晝12/12 h）的人工氣候箱培養(yǎng)7天。發(fā)芽期間每天定時補充蒸餾水使濾紙保持濕潤，每2天換一次濾紙，觀察種子萌發(fā)情況并記錄發(fā)芽數(shù)，第7天測定幼苗下胚軸長、鮮重，計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)。

式中：Gt為第t天的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應發(fā)芽天數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理和制圖，SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對各測定指標進行數(shù)據(jù)方差分析和Duncan法顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 種子的基本性狀

種子的基本性狀可以初步反映種子品質。由表4可以看出，盛冠菜豆種子的百粒重是45.16 g，經(jīng)硬實鑒定后的非硬實種子比硬實種子百粒重高出10 g左右；在種子外觀大小上，非硬實種子的粒長、寬、厚的數(shù)值均是最大，分別為12.6、9.63、7.63 mm，同時顯著(P＜0.05)高于常規(guī)種子和硬實種子；此外，三者種子含水量存在顯著差異(P＜0.05)，其中，常規(guī)種子含水量最高，為14.28%，而硬實種子含水量最低，為11.04%；盛冠常規(guī)種子和非硬實種子的生活力均低于90%，而硬實種子的生活力為96.46%，顯著(P＜0.05)高于前兩者種子；硬實種子的硬度為146.46 N，比常規(guī)種子硬度顯著(P＜0.05)高出32.28 N；盛冠菜豆種子在含水量為14.28%時，硬實率為38%。

表4 盛冠菜豆種子的基本性狀

2.2 種子的吸水率及吸水情況

種子浸泡后，因種子種皮具有透水性，隨浸泡時間的延長，種子會逐漸吸水，且不同吸水部位的吸水量存在差異。由圖1(a)可看出，盛冠種子吸水率隨吸水時間的延長呈S形緩慢增加的變化趨勢，其中，種子快速吸水時間段是0～24 h，而后進入緩慢吸水狀態(tài)。因而，鑒定種子硬實與非硬實的時間點是浸泡24 h。由圖1(b)可以看出，未封口的非硬實種子吸水量最大，吸水量為3.9 g，而種子種臍、種孔、內臍的吸水情況相當，種子吸水24 h的吸水量約0.45 g，無顯著性變化(P＞0.05)。

圖1 盛冠種子的吸水情況

2.3 溫水浸種對硬實種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及活力指數(shù)的影響

2.3.1 恒溫溫水浸種對硬實種子萌發(fā)的影響 種子硬實的解除可以通過對比處理后的硬實種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù)等萌發(fā)指標和未處理(CK)的種子萌發(fā)指標來衡量。由圖2(a)可以看出，與對照相比，除70℃浸種60 min會顯著降低(P＜0.05)種子發(fā)芽率外，3個溫度的恒溫溫水浸種均能顯著提高(P＜0.05)種子發(fā)芽率，其中，50℃、60℃恒溫浸種15 min、30 min后硬實種子的發(fā)芽率最高，均在90%左右，較對照提高了2.5倍。圖2(b)是溫水恒溫浸種后硬實種子發(fā)芽勢的變化情況，可見其結果與發(fā)芽率相似，浸種很大程度上可以提高硬實種子的發(fā)芽勢，其中，在60℃恒溫溫水浸種中，隨浸種時間的延長，硬實種子的發(fā)芽勢呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢，在浸種30 min時，種子的發(fā)芽勢最高為85%，而此時對照組種子的發(fā)芽勢為23.2%。由圖2(c)可以看出，50℃浸種時隨浸種時間的增加，硬實種子的活力指數(shù)是逐漸上升的變化趨勢，而70℃浸種后，活力指數(shù)呈現(xiàn)出相反的變化趨勢；在60℃恒溫溫水浸種30 min的條件下，硬實種子的活力指數(shù)最大，為143.14，比對照（活力指數(shù)為23.17）提高了5倍左右。由圖2可知，50℃、60℃溫水浸種15～60 min和70℃溫水浸種15～45 min后硬實種子吸脹，同時顯著(P＜0.05)促進了種子萌發(fā)；而在70℃溫水浸種60min時并未促進硬實種子萌發(fā)。

圖2 恒溫溫水浸種對硬實種子萌發(fā)的影響

2.3.2 變溫溫水浸種對硬實種子萌發(fā)的影響 由圖3(a)可以看出，50℃、60℃變溫浸種15～60 min以及70℃浸種15 min后盛冠硬實種子的發(fā)芽率均顯著提高(P＜0.05)，其中，50℃變溫浸種60 min后種子的發(fā)芽率最高（為93.6%），較對照（發(fā)芽率為26.5%）提高了2.5倍；相反，與對照相比，70℃變溫浸種30～60 min后硬實種子的發(fā)芽率明顯降低。圖3(b)統(tǒng)計的是變溫溫水浸種后對種子發(fā)芽勢的影響，可以看出，發(fā)芽勢與發(fā)芽率的變化趨勢相近，但種子發(fā)芽勢在60℃變溫浸種30 min處達到最大值，為89.7%；硬實種子經(jīng)70℃變溫浸種，除浸種15 min處理能顯著提高(P＜0.05)種子發(fā)芽勢以外，后3個時間段的處理均降低了種子的發(fā)芽勢。由圖3(c)可知，在60℃變溫浸種30 min處種子的活力指數(shù)達到最大值，為171.2，較對照提高了6.4倍；同樣，變溫處理對種子活力指數(shù)與發(fā)芽率、發(fā)芽勢的影響一致，在70℃變溫處理中，浸種時間大于30 min種子活力指數(shù)會急劇下降，其中，在浸種60 min處達到最低值（活力指數(shù)為3.0），與活力指數(shù)最高值相比相差了56倍。因此，變溫浸種能有效解除種子硬實，其中，在60℃恒溫浸種30 min后置于室溫自然冷卻1 h的條件下，對促進硬實種子的萌發(fā)效果最明顯。

圖3 變溫溫水浸種對硬實種子萌發(fā)的影響.

2.4 熱水浸種對硬實種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及活力指數(shù)的影響

2.4.1 恒溫熱水浸種對硬實種子萌發(fā)的影響 恒溫熱水浸種試驗試驗結果表明，當溫度為90℃時，硬實種子幾乎不發(fā)芽，因而圖4是80℃恒溫熱水浸種對硬實種子萌發(fā)的影響。由圖4(a)可以看出，80℃恒溫熱水浸種時，隨浸種時間的延長，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)出下降的變化趨勢，其中，浸種2 min時種子的發(fā)芽率最高，為74.7%，較對照（發(fā)芽率為26.5%）提高了1.8倍，而浸種10 min后種子的發(fā)芽率與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。同樣，由圖4(b)和(c)可以看出，硬實種子經(jīng)80℃恒溫熱水浸種后發(fā)芽勢和活力指數(shù)與發(fā)芽率的變化趨勢一致，均在80℃恒溫浸種2 min處達到最大值，與對照相比（發(fā)芽勢為17%，活力指數(shù)為23.2），其發(fā)芽勢和活力指數(shù)提高了近3倍。由此可見，恒溫熱水處理破除種子硬實的最佳條件是80℃恒溫浸種2 min。

圖4 80℃恒溫熱水浸種對硬實種子萌發(fā)的影響.

2.4.2 變溫熱水浸種對硬實種子萌發(fā)的影響 試驗選擇80℃、90℃兩個熱水溫度浸種以破除種子硬實。由圖5(a)可以看出，兩個溫度浸種時隨時間的延長，硬實種子的發(fā)芽率均呈下降的變化趨勢，其中，僅80℃熱水變溫浸種處理2 min和5 min可以顯著提高(P＜0.05)硬實種子發(fā)芽率；與對照(CK)的發(fā)芽率(26.5%)相比，經(jīng)80℃熱水恒溫浸種2 min后于室溫環(huán)境中自然冷卻1 h的硬實解除處理（發(fā)芽率為78.7%）后，硬實種子發(fā)芽率提高了2倍。變溫熱水浸種后硬實種子的發(fā)芽勢如圖5(b)所示，在80℃浸種2 min且室溫冷卻1 h處種子的發(fā)芽勢最高，為68.3%；而經(jīng)90℃浸種10 min且室溫冷卻1 h處理后種子發(fā)芽勢為0（即處理后的硬實種子不發(fā)芽）。種子活力指數(shù)與種子每天的發(fā)芽率以及最后的生長量有關，其硬實處理后的變化（圖5(c)）情況與發(fā)芽率、發(fā)芽勢相似，也在80℃處理2 min時達到最大值為86.2，較對照提高了2.7倍。未浸種(CK)的硬實種子發(fā)芽率為26.5%、發(fā)芽勢為17%、活力指數(shù)為23.2，由圖5可以看出，在變溫熱水處理中80℃浸種2 min時對解除種子硬實效果最佳。

圖5 變溫熱水浸種對硬實種子萌發(fā)的影響.

2.5 低溫貯藏對硬實種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及活力指數(shù)的影響

低溫干燥的環(huán)境適合貯藏種子，同時該環(huán)境下也能一定程度上解除種子硬實。由圖6(a)可以看出，在低溫4℃和-20℃的條件下貯藏硬實種子，能顯著提高(P＜0.05)其發(fā)芽率，其中，4℃貯藏1～7天，硬實種子的發(fā)芽率無明顯變化(P＞0.05)；而-20℃貯藏1～7天，硬實種子發(fā)芽率呈現(xiàn)出緩慢的上升趨勢，在貯藏7天時，硬實種子的發(fā)芽率高達77.7%，較對照（發(fā)芽率為31.7%）提高了1.5倍。圖6(b)是不同低溫貯藏不同時間后硬實種子的發(fā)芽勢，可見，對照的硬實種子發(fā)芽勢為15.7%，經(jīng)低溫貯藏6個處理后，硬實種子的發(fā)芽勢均有所提高，其中，經(jīng)-20℃低溫貯藏7天后硬實種子的發(fā)芽率(57%)最高，比對照提高了2.6倍。由圖6(c)可以看出，低溫貯藏1～7天的時間段，隨貯藏時間的增加，種子活力指數(shù)均呈現(xiàn)上升的變化趨勢。但是，4℃貯藏3天和7天以及-20℃貯藏1天和3天時，種子活力指數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)；與對照（活力指數(shù)為53.8）相比，-20℃貯藏7天后對硬實種子的活力指數(shù)提高最明顯，其值為101.6，是對照硬實種子活力指數(shù)的2倍左右。由圖6可見，在低溫貯藏的6個處理中，-20℃貯藏7天時硬實種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù)均達到最高值，因而，該條件是本試驗低溫貯藏處理中解除種子硬實效果最佳的條件。

圖6 低溫貯藏對硬實種子萌發(fā)的影響

3 討論與結論

豆科植物普遍存在種子硬實性。本試驗發(fā)現(xiàn)：盛冠菜豆硬實種子無論是在百粒重，還是粒長、粒寬、粒厚上都比非硬實種子小。這一結果表明，粒小的種子出現(xiàn)硬實的可能性更大，這與古瑜[12]的結果一致。當盛冠種子含水量為14.28%時，種子硬實率在38%左右，生產(chǎn)上如果不經(jīng)處理直接播種，田間易大面積出現(xiàn)缺苗或出苗不齊的現(xiàn)象。在周健[13]的研究中表明，機械處理，熱水、酸蝕均能較好的解除種子硬實性；此外，程瑤[14]在破除黃芪種子硬實時，采用熱沙燙種、激素浸泡處理也能一定程度上破除硬實?？紤]到生產(chǎn)上對菜豆種子需求量大，使用機械損傷破除硬實容易傷及胚芽，不利于種子發(fā)芽；而酸腐蝕的時間農(nóng)民不易控制，且操作時不僅會腐蝕種皮也會傷害農(nóng)民自身；而本試驗激素處理的預實驗表明，赤霉素浸種對打破菜豆種子硬實效果不大，原因可能是菜豆種皮較厚且致密，短時間的激素浸泡對種皮影響較小，同時，胡晉[15]還指出，硬實不能用激素進行處理，因為這些物質無法透過種皮。

因而，本試驗解除種子硬實時選擇溫水浸種、熱水浸種和低溫貯藏3種較溫和的方式進行。由于本試驗目的是篩選出最佳的硬實破除條件，即破除處理及相應的處理時間，而這主要依據(jù)硬實破除后種子萌發(fā)情況來衡量。溫水浸種的結果表明，在50℃和60℃溫水浸種60 min以內均能促進種子萌發(fā)，且變溫浸種與恒溫浸種差異不大，這可能是硬實破除只需要打破一瞬間，不需要長期的處理。因而考慮處理時間和處理效果，在60℃恒溫浸種30 min對解除種子硬實效果最佳。本研究還發(fā)現(xiàn)，70℃浸種除了15 min處理較對照促進了種子萌發(fā)以外，時間延長反而促進效果不明顯，這可能是70℃浸種60 min處理溫度較高，且時間較長，類似于短時間破除種子硬實后，繼續(xù)用70℃浸種破環(huán)種子內部結構，使得種胚損傷無法萌發(fā)。這與程瑤[16]在破除黃芪種子硬實時結果一致。熱水浸種的結果表明，水溫在80℃處理2 min對種子的萌發(fā)效果較好，其中，恒溫比變溫處理效果更好，這可能與種子破除硬實后不適合浸泡在高溫環(huán)境有關。古瑜等[12]的研究表明，該環(huán)境下打破種子硬實仍適合其他品種的菜豆種子；本試驗結果還發(fā)現(xiàn)，90℃熱水浸泡菜豆種子對其萌發(fā)效果不利，原因是溫度過高，直接使硬實種子失去活力，這與古瑜等[12,16]的研究結果一致。

溫水浸種解除種子硬實的原理主要是溫度和水同時作用[17-19]，促使種皮致密性發(fā)生物理變化；但僅用水浸泡硬實種子，短時間內種子吸脹效果不明顯，而高溫對種子傷害極大，因而，本試驗解除種子硬實時還選擇了低溫貯藏的方式。由于溫水浸種與低溫貯藏處理的時間間隔較大，因而在低溫貯藏時有一個平行對照，但其發(fā)芽率比前一對照更高，這可能與種子自身質量有關，試驗樣本較小，不能確保每次試驗種子質量相近。最后低溫貯藏結果表明，4℃和-20℃貯藏硬實種子均能一定程度上解除種子硬實，進而促進種子萌發(fā)。但是其促進效果遠次于60℃浸種30 min，原因可能是，溫水處理時種皮在高溫環(huán)境下熱脹冷縮發(fā)生物理變化，進而致密性被打破的同時種子還能迅速吸水，而低溫貯藏時溫度與水是分開作用的，因此，其的硬實種子發(fā)芽率相對較低。

綜上所述，考慮到菜豆種植的實際情況和硬實破除的最佳效果，對硬實率較高的菜豆種子用60℃恒溫浸種30 min后進行播種將會利于種子萌發(fā)。