張 婷 王 琴 賴河宇 郭舜遠(yuǎn) 柳旭澤 方 云＊

(1.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫，214122；2.江南大學(xué)至善學(xué)院，江蘇無錫，214122)

乳液體系在食品藥品化妝品以及個(gè)人清潔和護(hù)理用品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。常規(guī)的乳液通常由表面活性劑穩(wěn)定，這無疑會(huì)對環(huán)境以及產(chǎn)品的性能造成某些負(fù)面影響。20世紀(jì)初，Ramsden[1]在研究蛋白質(zhì)分散體系時(shí)發(fā)現(xiàn)膠體尺寸的固體顆粒也能穩(wěn)定油/水界面。隨后，Pickering對固體顆粒穩(wěn)定的乳液進(jìn)行了研究[1]，因此這種乳液被稱作Pickering乳液，而相應(yīng)的能穩(wěn)定油水界面的、具有雙親性的固體顆粒被稱為Pickering乳化劑。近年來，以生物質(zhì)顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液受到了更多的關(guān)注[2-4]，但目前研究集中在使用化學(xué)修飾或接枝聚合物鏈段等方法賦予生物質(zhì)顆粒良好的雙親性及刺激響應(yīng)性，這就導(dǎo)致乳化劑制備過程復(fù)雜且安全性降低，并使應(yīng)用受限[5]。

共軛亞油酸(CLA)是一類天然存在的不飽和脂肪酸，具有多種生物活性，其結(jié)構(gòu)中共軛雙鍵和羧基共存使其具有自組裝性、可聚合活性和弱還原性等性質(zhì)[6-8]。本實(shí)驗(yàn)試圖用CLA作為分子砌塊構(gòu)建穩(wěn)定的自交聯(lián)共軛亞油酸囊泡(SCLA-FAV)，使其有可能不需要經(jīng)過其他化學(xué)修飾，直接用作新型生物質(zhì)顆粒乳化劑穩(wěn)定Pickering乳液，并探究該P(yáng)ickering乳液對β-胡蘿卜素的有效包埋能力以及減小其降解速度從而提高其保留率的效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與儀器

共軛亞油酸(CLA，純度95%)，大連醫(yī)諾生物股份有限公司；白藜蘆醇(純度98%)，北京伊諾凱科技有限公司；葵花籽油、玉米油以及大豆油均購自上海嘉里食品工業(yè)有限公司；過硫酸銨(AR)、硼酸(H3BO3，AR)、硼砂(NaB4O7·10H2O，AR)、橄欖油(CP)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水(18.2 MΩ·cm)，由美國Millipore Synergy UV超純水系統(tǒng)制備。透射電子顯微鏡(JEM-2100，日本JEOL公司)；紫外可見分光光度計(jì)(TU-1950，北京普析通用儀器有限公司)；高速分散機(jī)(IKA-T18，德國IKA公司)；超景深三維顯微鏡(VHX-1000C，香港Keyence有限公司)；手提紫外檢測燈(ZF-7A，上海寶山顧村電光儀器廠)。

1.2 SCLA-FAV的構(gòu)建及表征

用pH 8.6的硼酸-硼砂緩沖液配制一系列不同CLA濃度的緩沖溶液，測定234 nm處的紫外吸光度，繪制CLA濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。同上配制30 mmol/L的CLA溶液，置于室溫下自組裝24 h，作為共軛亞油酸囊泡(CLA-FAV)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確量取10 ml的CLA-FAV儲(chǔ)備液于25 ml圓底燒瓶中，加入41 μl 2.0 mol/L的過硫酸銨溶液并通氮?dú)?0 min以排除瓶中的氧氣，將瓶口密封置于80 ℃油浴鍋中引發(fā)囊泡發(fā)生不同時(shí)長的熱聚合反應(yīng)，以獲得不同交聯(lián)度的系列SCLA-FAV樣品。用pH 8.6的硼酸-硼砂緩沖液將該系列樣品以及自交聯(lián)前的CLA-FAV儲(chǔ)備液均稀釋至0.03 mmol/L，測定234 nm處的吸收峰，并與上述標(biāo)準(zhǔn)曲線對照判斷SCLA-FAV的交聯(lián)度。將1滴SCLA-FAV樣品滴在銅網(wǎng)上，用濾紙吸干多余的液體，室溫晾干觀察SCLA-FAV的TEM影像以判斷其微觀形貌。

1.3 以SCLA-FAV為乳化劑制備Pickering乳液

將SCLA-FAV樣品作為Pickering乳化劑，油相為橄欖油(或分別以葵花籽油、玉米油、大豆油替換)，配制總體積為4 ml的油水混合液，其中油相體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、65%、70%、75%和80%；使用高速分散機(jī)在12000 r/min下均質(zhì)5 min，24 h后觀察乳液分相情況以確定最佳油/水比；將乳液用超純水稀釋20倍后在超景深三維顯微鏡下觀測，使用“Nano Measurer”軟件進(jìn)行粒徑統(tǒng)計(jì)。

1.4 Pickering乳液包埋活性物質(zhì)

配制一系列不同濃度β-胡蘿卜素的乙醇溶液，由于β-胡蘿卜素在乙醇中的最大吸收波長為450 nm，因此測定450 nm處的紫外吸光度，繪制β-胡蘿卜素的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。以橄欖油為溶劑于避光狀態(tài)下配制不同濃度(mg/L)的β-胡蘿卜素溶液，分別移取3 ml于玻璃瓶中，并加入1 ml的SCLA-FAV樣品作為含乳化劑水相，使用T-18高速分散機(jī)在12 000 r/min下乳化5 min后避光保存，24 h后使用超景深三維顯微鏡觀察乳液液滴大??；將油相含1000 mg/L的β-胡蘿卜素的乳液在室溫下暴露于365 nm紫外線下，每間隔1 h取出200 μl，用乙醇稀釋后測定其在450 nm處的吸光度，與β-胡蘿卜素的濃度-紫外吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線對照計(jì)算其中β-胡蘿卜素的剩余濃度，據(jù)此計(jì)算β-胡蘿卜素的保留率。

參照上述程序進(jìn)行橄欖油(或以玉米油、葵花籽油、大豆油替代)包埋白藜蘆醇的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 交聯(lián)時(shí)間對SCLA-FAV交聯(lián)度的影響

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用CLA作為分子砌塊，構(gòu)建穩(wěn)定的SCLA-FAV，其過程和原理示意圖見圖1。pH可調(diào)節(jié)脂肪酸分子間的氫鍵相互作用和羧酸根之間的靜電作用，從而誘導(dǎo)脂肪酸發(fā)生自組裝，在pH 8.6時(shí)CLA可自發(fā)形成不飽和脂肪酸囊泡(Ufasome)。CLA中含有的共軛雙鍵在234 nm處有特征吸收，并不受自組裝的影響。根據(jù)這一特點(diǎn)，測定不同濃度的CLA-FAV溶液在234 nm處的紫外吸收，從而得到CLA-FAV濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2A)。采用熱聚合法引發(fā)30 mmol/L的CLA-FAV溶液中共軛雙鍵自交聯(lián)，80 ℃下聚合不同時(shí)間后SCLA-FAV的紫外光譜圖見圖2B，其在234 nm處的特征吸收隨熱聚合時(shí)間延長而降低，表明SCLA-FAV的自交聯(lián)度在不斷地上升。根據(jù)圖2A所示的CLA-FAV標(biāo)準(zhǔn)紫外吸收曲線，計(jì)算得到的SCLA-FAV在不同熱聚合時(shí)間下的交聯(lián)度列于表1，說明熱聚合反應(yīng)20 h后自交聯(lián)度即接近50%，足以使SCLA-FAV結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以用作Pickering乳液的顆粒乳化劑。圖2C為該SCLA-FAV的TEM影像，表明其顆粒平均粒徑為14 nm左右。

圖1 CLA組裝及自交聯(lián)示意圖

圖2 SCLA-FAV的表征

表1 不同熱聚合時(shí)間對SCLA-FAV自交聯(lián)度的影響

2.2 SCLA-FAV穩(wěn)定的Pickering乳液

自交聯(lián)后的脂肪酸囊泡具有固體顆粒的性質(zhì)，可用于穩(wěn)定Pickering乳液?？紤]到自交聯(lián)度以及時(shí)間成本，選取15 h進(jìn)行熱聚合制備SCLA-FAV樣品。以橄欖油為油相，SCLA-FAV為乳化劑，經(jīng)高速均質(zhì)成乳，并用溶劑稀釋法初步判斷該乳液為O/W型。24 h后觀察乳液的外觀，發(fā)現(xiàn)其仍然沒有發(fā)生破乳，一周之后亦如此。這說明以熱聚合法制備的SCLA-FAV對橄欖油具有較好的乳化效果。此外，改變O/W比例，當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)為50%～70%的乳液底部均有水相析出，而當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)高達(dá)75%～80%時(shí)則無水相析出且無油相析出(圖3)，充分說明所制得的SCLA-FAV可以穩(wěn)定高內(nèi)相Pickering乳液，超景深三維顯微鏡照片顯示乳液液滴的平均粒徑為(20.0±4.0) μm。

圖3 SCLA-FAV穩(wěn)定的Pickering乳液的外觀圖

2.3 Pickering乳液包埋白藜蘆醇

將白藜蘆醇溶于橄欖油(100 mg/L)中成乳后避光保存一天后乳液即發(fā)生破乳，轉(zhuǎn)而分別以大豆油、葵花籽油和玉米油替代橄欖油，但均引起破乳。初步判斷這是由于白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)所引起的，白藜蘆醇屬于天然的多酚化合物(典型分子結(jié)構(gòu)如圖4所示)，據(jù)報(bào)道其易溶于甲醇、乙醇等極性較強(qiáng)的溶劑[9]；而本研究以天然油脂作為油相，其主要組成均是長鏈飽和/不飽和脂肪酸的甘油三酯，根據(jù)相似相容原理，白藜蘆醇難溶于其中，從而導(dǎo)致包埋不成功。

圖4 白藜蘆醇的典型分子結(jié)構(gòu)

β-胡蘿卜素在乙醇中的最大吸收波長為450 nm，因此選取在450 nm處測定一系列不同濃度β-胡蘿卜素乙醇溶液吸光度，繪制其濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5A所示。為了探究橄欖油中β-胡蘿卜素濃度對乳液液滴大小的影響，配制不同濃度的β-胡蘿卜素的橄欖油溶液，均質(zhì)乳化后使用超景深三維顯微鏡觀察乳液液滴，統(tǒng)計(jì)得平均粒徑均分布在(20±4.5) μm，即包埋的β-胡蘿卜素濃度較小時(shí)對乳液液滴影響并不明顯。β-胡蘿卜素是一種具有強(qiáng)抗氧化作用的脂溶性生物活性成分，可應(yīng)用于營養(yǎng)保健品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，但由于水溶性差、光敏性及熱敏性而導(dǎo)致其應(yīng)用受到一定限制[10]。為了研究SCLA-FAV穩(wěn)定的Pickering乳液包埋的β-胡蘿卜素在紫外輻射下的穩(wěn)定性，選取濃度為1000 mg/L的β-胡蘿卜素的橄欖油溶液作為油相制備Pickering乳液，并將β-胡蘿卜素在O/W型Pickering乳液中的保留率及其在橄欖油溶液或在橄欖油和pH 8.60的緩沖液(v/v=3:1)的簡單混合液(簡稱混合液)中的保留率進(jìn)行對比[11]。圖5B即為紫外輻射時(shí)間對上述三種環(huán)境下β-胡蘿卜素保留率的影響，反映了各自降低β-胡蘿卜素的降解速度的能力；5 h后，β-胡蘿卜素在Pickering乳液、橄欖油以及混合液中的保留率分別為88.40%、71.69%和71.63%。由于橄欖油以及混合液環(huán)境下β-胡蘿卜素直接面對紫外輻射，導(dǎo)致β-胡蘿卜素降解較快；而在乳液體系中，內(nèi)層油相包埋的β-胡蘿卜素分散在水連續(xù)相中，油/水界面上的SCLA-FAV顆粒吸附層能夠部分屏蔽紫外輻射，對β-胡蘿卜素提供了重要的保護(hù)作用；而且外水相折射也減弱了紫外輻射對β-胡蘿卜素的直接輻射。這與文獻(xiàn)中Xiao等[12]報(bào)道的以高粱醇溶蛋白顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液包埋姜黃素的效果類似。

圖5 β-胡 蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線(A)以及不同紫外輻射時(shí)間對β-胡蘿卜素保留率的影響(B)

3 結(jié)論

天然小分子脂肪酸CLA經(jīng)過自組裝和自交聯(lián)后形成脂肪酸囊泡SCLA-FAV，熱聚合反應(yīng)20 h后自交聯(lián)度即接近50%，平均粒徑為14 nm左右。用該SCLA-FAV作為Pickering乳液的顆粒乳化劑，可以穩(wěn)定O/W型高內(nèi)相(橄欖油的油相體積分?jǐn)?shù)已大于72%)的Pickering乳液，其乳液液滴的平均粒徑為20.0 μm左右。使用SCLA-FAV穩(wěn)定橄欖油的O/W型Pickering乳液對光-熱敏感性的β-胡蘿卜素進(jìn)行包埋，可有效抑制β-胡蘿卜素在紫外輻射下的降解速度。因此該新型SCLA-FAV顆粒乳化劑及其穩(wěn)定的Pickering乳液具有良好的生物安全性，在食品藥品化妝品以及個(gè)人清潔和護(hù)理用品行業(yè)中具有明顯的優(yōu)勢。