黃潔雅，陳 麗，周忠志，戴飛躍，張 揚(yáng)，陳敏敏，劉 慧，姜佳呈，廖亮英△

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 410007)

皮膚潰瘍是糖尿病常見并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至危及生命[1]。大量研究表明，糖尿病皮膚潰瘍的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種因素均可導(dǎo)致發(fā)病[2]，其中炎癥反應(yīng)為主要因素，白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為反應(yīng)主要因子[3，4]。解毒生肌膏由全蝎、蜈蚣、乳香、沒藥4味中藥按君臣佐使原則精密配伍制成，在臨床治療糖尿病皮膚潰瘍數(shù)年，獲得了較好的臨床療效。本課題組在前期臨床應(yīng)用基礎(chǔ)上，構(gòu)建糖尿病大鼠全層背部皮膚缺損模型，擬通過肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況，蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察組織形態(tài)學(xué)改變，免疫組化法分析IL-6、TNF-α陽性表達(dá)量變化等技術(shù)對(duì)該藥促進(jìn)潰瘍愈合的機(jī)制進(jìn)行研究。本研究由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，批準(zhǔn)編號(hào)LL2019112001。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠45只，4～6周齡，體質(zhì)量180～220 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證SCXK(湘)2016-0002，統(tǒng)一飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房。清潔并消毒動(dòng)物房及鼠籠；雄性SD大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠大鼠5只共9籠；飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)，濕度保持在45%～75%，室溫控制在20～25 ℃。大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用礦物質(zhì)水飼養(yǎng)，自由飲食飲水，每天補(bǔ)充1次飼料和水，更換1次墊料并消毒籠具，光暗周期12 h。

1.2 藥物

解毒生肌膏藥物組成：全蝎、蜈蚣、乳香、沒藥4味中藥，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(專利申請(qǐng)?zhí)朖SI01039ZYFS)；磺胺嘧啶銀乳膏，新鄉(xiāng)市華信藥業(yè)有限公司(批號(hào)H20094208)；鏈脲佐菌素(STZ)，sigma-aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司(貨號(hào)S0130)；檸檬酸鈉緩沖液，北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)C1013)；6-正丙基-2-硫代尿嘧啶，上海源葉生物科技有限公司(貨號(hào)S30643)；膽酸鈉(豬)，上海源葉生物科技有限公司(貨號(hào)S30219)；吐溫-80，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)20130128)；1,2-丙二醇，湖南匯虹試劑有限公司(批號(hào)20160412)；Anti-IL-6 抗體，Abcam公司艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司(貨號(hào)ab9324)；Anti-TNF Receptor II antibody[EPR1653]，Abcam公司艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司(貨號(hào)ab109322)。

1.3 試劑

1.3.1 高脂乳劑的配制 將100 g食用豬油放到水浴鍋上加熱，以澄清油樣透明為準(zhǔn)。取50 g膽固醇分多次加入研缽，研磨至無亮光后將其加入，并充分?jǐn)嚢杌靹蛴?00 g豬油中，然后依次攪拌加入1 g丙硫氧嘧啶、10 g膽酸鈉、已預(yù)熱的100 mL吐溫-80和100 mL丙二醇，最后緩慢加入適量蒸餾水定容至500 mL并搖晃均勻。

1.3.2 鏈脲佐菌素溶液的配制 分別取出100 mg冷凍保存的鏈脲佐菌素粉末(STZ)和5 mL冷藏保存的檸檬酸鈉緩沖液，將STZ溶解于檸檬酸鈉緩沖液中，配制濃度為20 mg/mL的STZ溶液，避光操作，30 min內(nèi)配制并使用。

1.3.3 分組藥物制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)雄性SD大鼠3 d后，將45只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、解毒生肌膏組和磺胺嘧啶銀乳膏組各15只。3組大鼠均分別隨機(jī)分為3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：即3 d、7d、21 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠。藥物制備方法按一定比例混合磨碎加工佐以凡士林調(diào)和制成，試驗(yàn)全過程使用同種劑量藥物。

1.3.4 糖尿病大鼠創(chuàng)面模型制備[5，6]每天同一時(shí)間段以2 ml/只的劑量，連續(xù)灌胃各組雄性SD大鼠高脂乳劑2周。各組雄性SD大鼠禁食不禁水，24 h之后按照40 mg/kg劑量腹腔注射配制濃度為20 mg/mL的STZ溶液。72 h后將各組雄性SD大鼠剪尾取血，測(cè)定隨機(jī)血糖水平超過16.7 mmoL/L則為2型糖尿病大鼠模型造模成功。按照3.5 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉各組2型糖尿病大鼠并備皮，在大鼠已脫毛的背部脊柱兩側(cè)標(biāo)記2個(gè)對(duì)稱直徑為1.5 cm的圓形圖案，常規(guī)消毒后且沿標(biāo)記線用手術(shù)刀創(chuàng)設(shè)2個(gè)全層皮膚缺損區(qū)域，創(chuàng)面深達(dá)筋膜層，即成功建立2型糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面模型。

1.3.5 給藥 造模成功后，模型組不做處理，解毒生肌膏組大鼠創(chuàng)面上立即均勻被覆一層解毒生肌膏，磺胺嘧啶銀乳膏組的大鼠創(chuàng)面上立即均勻被覆一層磺胺嘧啶銀乳膏，并每天進(jìn)行換藥。

1.3.6 血糖測(cè)量 (1)剪尾法：調(diào)試、校對(duì)血糖儀插入匹配試紙，消毒后于大鼠尾尖剪除約0.3 cm，并從尾根部向尾尖捋擠，流出第一滴血棄去不用，第二滴血吸于血糖儀試紙吸血點(diǎn)，按壓大鼠尾部止血，讀取血糖結(jié)果并記錄；(2)測(cè)量時(shí)間：分別于適應(yīng)性喂養(yǎng)第3天、高脂乳劑喂養(yǎng)第14天后(STZ注射禁食前)、STZ注射第72 h后、糖尿病大鼠造模成功后每3 d以及取材當(dāng)天同一時(shí)間段進(jìn)行隨機(jī)血糖測(cè)量。

1.3.7 標(biāo)本采集 分別于造模后3 d、7d、21 d為模型組、解毒生肌膏組和磺胺嘧啶銀乳膏組對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠進(jìn)行取材。首先將大鼠麻醉觀察創(chuàng)面愈合情況并拍照記錄，冰上以創(chuàng)面為中心取大小為2 cm×2 cm的標(biāo)本，于4%多聚甲醛溶液的瓶中固定，常溫保存。取材結(jié)束后采用頸椎脫臼處死法處死大鼠。

1.3.8 觀察指標(biāo) (1)創(chuàng)面大體形態(tài)學(xué)：肉眼觀察3組大鼠3 d、7d、21 d時(shí)間點(diǎn)；(2)HE染色：10%福爾馬林緩沖液浸泡標(biāo)本一晚后石蠟包埋，制作組織切片(5 μm)進(jìn)行HE染色做形態(tài)學(xué)評(píng)估；(3)免疫組化法：取皮膚創(chuàng)面標(biāo)本組織脫蠟至水，抗原修復(fù)、孵育，滴加一抗(IL-6濃度0.125 μg/ml，TNF-α稀釋濃度1/100-1/250)、反應(yīng)增強(qiáng)液、增強(qiáng)酶標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG H&L，顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明和封片，測(cè)定3組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)皮膚創(chuàng)面中IL-6、TNF-α受體陽性表達(dá)量(通過Image J軟件計(jì)算得到)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖結(jié)果

圖1示，在適應(yīng)性喂養(yǎng)階段，各組大鼠的隨機(jī)血糖值均在5.5～7.8 mmol/L區(qū)間內(nèi)，屬正常范圍。在高脂乳劑灌胃后即注射STZ禁食前，血糖值未見明顯變化。注射STZ后72 h隨機(jī)血糖值升高明顯，各大鼠血糖值均高于16.7 mmol/L，一部分大鼠血糖值升高尤為顯著，甚至高于血糖儀測(cè)量上限。在造模成功后直到取材前這段時(shí)間內(nèi)，大鼠血糖值有輕微波動(dòng)且略微下降，但大鼠一直保持著高血糖狀態(tài)。

圖1 實(shí)驗(yàn)全過程血糖變化比較

2.2 創(chuàng)面愈合情況

2.2.1 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠創(chuàng)面大體形態(tài)學(xué)結(jié)果 圖2示，取材前將各時(shí)間點(diǎn)大鼠麻醉后對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行局部拍照記錄，拍照并制作各組大鼠潰瘍創(chuàng)面大體形態(tài)學(xué)示意圖。造模后3 d模型組創(chuàng)緣腫脹不明顯，創(chuàng)面有少量膿點(diǎn)并有較多分泌物，可見新生肉芽組織(圖2-A)；解毒生肌膏組造模后3 d創(chuàng)緣腫脹明顯，創(chuàng)口面積縮小，創(chuàng)面分泌物較少，可見新生肉芽組織(圖2-D)；磺胺嘧啶銀乳膏組腫脹較輕，創(chuàng)面有較多干燥的膿性分泌物(圖2-G)。造模后7 d模型組創(chuàng)緣腫脹減輕，創(chuàng)面無明顯膿性分泌物，可見較厚痂皮(圖2-B)；解毒生肌膏組腫脹明顯減輕，創(chuàng)面無膿性分泌物，可見較厚且干燥的痂皮，創(chuàng)口面積明顯縮小(圖2-E)；磺胺嘧啶銀乳膏組腫脹略減輕，可見較干燥且薄的痂皮，創(chuàng)口面積縮小較明顯(圖2-H)。造模后21 d模型組部分痂皮脫落，創(chuàng)口面積小，創(chuàng)面呈愈合趨勢(shì)(圖2-C)；解毒生肌膏組痂皮脫落，創(chuàng)面基本完全愈合(圖2-F)；磺胺嘧啶銀乳膏組創(chuàng)面有干燥痂皮覆蓋，創(chuàng)口面積較小，創(chuàng)面基本愈合(圖2-I)。

注：A.3 d模型組；B.7 d模型組；C.21 d模型組；D.3 d解毒生肌膏組；E.7 d 解毒生肌膏組；F.21 d解毒生肌膏組；G.3 d磺胺嘧啶銀乳膏組；H.7 d磺胺嘧啶銀乳膏組；I.21 d磺胺嘧啶銀乳膏組圖2 3、7、21 d時(shí)間點(diǎn)各組大鼠潰瘍創(chuàng)面大體形態(tài)學(xué)示意圖

2.2.2 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠創(chuàng)面HE染色結(jié)果 造模后3 d模型組創(chuàng)緣表皮層次多且分布不均勻，創(chuàng)面結(jié)構(gòu)紊亂(圖3-1A)，膠原纖維、肌細(xì)胞水腫明顯(圖3-1B1C)；解毒生肌膏組創(chuàng)緣結(jié)構(gòu)完整均一(圖3-1D)，創(chuàng)面成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生明顯，細(xì)胞種類多，肉芽組織豐富(圖3-1E1F)；磺胺嘧啶銀乳膏組創(chuàng)緣結(jié)構(gòu)較完整(圖3-1G1H1I)。造模后7 d模型組創(chuàng)緣新生表皮較厚，層次不清，結(jié)構(gòu)紊亂(圖3-2A)，炎癥細(xì)胞浸潤明顯(圖3-2B)，創(chuàng)面可見大量毛細(xì)血管，肉芽組織豐富(圖3-2C)；解毒生肌膏組創(chuàng)緣平整且薄，層次均勻清楚(圖3-2D)，可見豐富細(xì)膩而平行排列的膠原纖維，成纖維細(xì)胞多且呈長梭形(圖3-2E)，肉芽組織和毛細(xì)血管明顯(圖3-2F)；磺胺嘧啶銀乳膏組創(chuàng)緣平整較薄，層次分明(圖3-2G)，肉芽組織和毛細(xì)血管較多(圖3-2H)，可見較多的膠原纖維、成纖維細(xì)胞(圖3-2I)。造模后21 d模型組創(chuàng)緣見少量新生毛囊(圖3-3A3B)，創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)量多，膠原纖維明顯增多但排列紊亂(圖3-3C)；解毒生肌膏組創(chuàng)緣表皮基本愈合，結(jié)構(gòu)、層次清楚(圖3-3D)，可見較多成熟的新生毛囊和皮脂腺等附屬器(圖3-3E)，創(chuàng)面膠原豐富，成纖維細(xì)胞退化(圖3-3F)；磺胺嘧啶銀乳膏組創(chuàng)緣表皮愈合(圖3-3G)，成纖維細(xì)胞減少，膠原纖維粗(圖3-3H),附屬器發(fā)育不成熟(圖5-I)。

注：1～3分別為造模后3 d 3組創(chuàng)面HE染色圖片、造模后7 d 3組創(chuàng)面HE染色圖片、造模后21 d 3組創(chuàng)面HE染色圖片；A-C.模型組(A為×20，B為紅框內(nèi)結(jié)構(gòu)×200，C為藍(lán)框內(nèi)結(jié)構(gòu)×200)；D-F.解毒生肌膏組(D為×20，E為紅框內(nèi)結(jié)構(gòu)×200，F(xiàn)為藍(lán)框內(nèi)結(jié)構(gòu)×200)；G-I.陽性對(duì)照組(G為×20，H為紅框內(nèi)結(jié)構(gòu)×200，I為藍(lán)框內(nèi)結(jié)構(gòu)×200)圖3 3、7、21d時(shí)間點(diǎn)各組大鼠潰瘍創(chuàng)面HE染色示意圖

2.3 各組各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面 IL-6、TNF-α免疫組化結(jié)果

IL-6、TNF-α陽性表達(dá)部位為巨噬細(xì)胞分泌物中，表達(dá)為棕黃色顆粒。圖4、5及表1、2示，造模后3 d對(duì)比模型組和磺胺嘧啶銀乳膏組，解毒生肌膏組炎癥細(xì)胞陽性表達(dá)明顯增多(P<0.05)；造模后7 d與模型組和磺胺嘧啶銀乳膏組比較，解毒生肌膏組棕黃色表達(dá)顆粒減少，炎癥細(xì)胞數(shù)量驟減，陽性表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；造模后21 d，除解毒生肌膏組較模型組IL-6表達(dá)數(shù)量明顯降低外(P<0.05)，其余組別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，較模型組和磺胺嘧啶銀乳膏組比較，解毒生肌膏組IL-6、TNF-α表達(dá)量提前達(dá)到峰值，且表達(dá)量峰值低于模型組和磺胺嘧啶銀乳膏組峰值。

表1 3、7、21 d時(shí)間點(diǎn)各組大鼠潰瘍創(chuàng)面 IL-6陽性表達(dá)量

注：從上至下依次為3、7、21 d時(shí)間點(diǎn)TNF-α表達(dá)示意圖(免疫組化染色×100)；A-C.3 d時(shí)間點(diǎn)(A為模型組，B為解毒生肌膏組，C為磺胺嘧啶銀乳膏組)；D-F.7 d時(shí)間點(diǎn)(D為模型組，E為解毒生肌膏組，F(xiàn)為磺胺嘧啶銀乳膏組)；G-I.21 d時(shí)間點(diǎn)(G為模型組，H為解毒生肌膏組，I為磺胺嘧啶銀乳膏組)圖5 3、7、21 d時(shí)間點(diǎn)各組大鼠潰瘍創(chuàng)面TNF-α表達(dá)示意圖(免疫組化染色 ×100)

3 討論

糖尿病潰瘍的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，大量研究認(rèn)為主要是由于體內(nèi)高糖環(huán)境、氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等多種生物因素共同導(dǎo)致[7-9]，而炎癥反應(yīng)是其主要機(jī)制[10]。炎癥反應(yīng)是指致炎因子作用于機(jī)體后，引發(fā)組織細(xì)胞的損壞，使局部組織細(xì)胞顯現(xiàn)變性、壞死的現(xiàn)象，同時(shí)誘發(fā)組織細(xì)胞產(chǎn)生抗炎反應(yīng)維持局部平衡。而TNF-α、IL-6等為炎癥反應(yīng)中的主要炎癥因子，是反應(yīng)炎癥水平的重要指標(biāo)[11]。

表2 3、7、21d時(shí)間點(diǎn)各組大鼠潰瘍創(chuàng)面TNF-α陽性表達(dá)量

創(chuàng)面愈合即皮膚在損傷后通過體內(nèi)各種因子相互作用進(jìn)行修復(fù)，是一種機(jī)體自我動(dòng)員，主要包括凝血期、炎癥期、增殖期、塑形期[17，18]，各期出現(xiàn)異常均可導(dǎo)致創(chuàng)面難愈。在持續(xù)高糖環(huán)境下，體內(nèi)晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glyclation end-products，AGEs)異常蓄積，與相應(yīng)受體結(jié)合后觸發(fā)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α等炎癥因子，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。大量研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)可以引發(fā)氧化應(yīng)激，如王文珊[12]證實(shí)炎癥介質(zhì)會(huì)刺激細(xì)胞，使之產(chǎn)生大量ROS，從而引起氧化應(yīng)激。此外，炎癥反應(yīng)會(huì)引起局部微循環(huán)通透性增加，使微血管擴(kuò)張，導(dǎo)致體液滲出和組織水腫；而大量炎癥細(xì)胞瘀積會(huì)導(dǎo)致微循環(huán)局部栓塞，造成組織缺血壞死，使創(chuàng)面難以愈合[12-14]。綜上所述，AGEs與其受體結(jié)合后，引發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激、微循環(huán)障礙等一系列相互級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面難愈的重要因素[15，16]。因此猜想，降低創(chuàng)面修復(fù)過程中炎癥因子表達(dá)，以減輕炎癥期反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)面愈合是治療糖尿病潰瘍的關(guān)鍵。

解毒生肌膏是由全蝎、蜈蚣、乳香、沒藥按君臣佐使原則精密配伍制成，是本課題組指導(dǎo)老師經(jīng)過長期臨床實(shí)踐研究總結(jié)的全新經(jīng)驗(yàn)方。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，全蝎具有抗血栓形成、抑菌[19]、收縮血管[20]的作用，蜈蚣酸性水提液可以阻止真菌生長繁殖，乳香化合物136具有抗炎作用[21]，沒藥水煎劑(1∶2)中所含的丁香油酚可能有抗真菌作用，其他的一些活性成分對(duì)急慢性炎癥都有抑制作用[22]。由此推斷，解毒生肌膏具有抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、抗微血栓形成等藥理作用[23-25]。

肉眼觀察結(jié)果顯示，解毒生肌膏組創(chuàng)面愈合速度明顯加快，愈合面瘢痕較少。HE染色示，解毒生肌膏組表皮、真皮層水腫明顯減輕，表皮結(jié)構(gòu)層次清晰，成纖維細(xì)胞、膠原更豐富，新生毛囊等附屬器增殖旺盛。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在每個(gè)愈合時(shí)期，解毒生肌膏組和磺胺嘧啶銀乳膏組與模型組比較，IL-6和TNF-α表達(dá)量均顯著降低，其中解毒生肌膏組降低程度更大(P<0.05)，且解毒生肌膏組于造模后3 d其炎性細(xì)胞表達(dá)量提前達(dá)到峰值。研究結(jié)果證實(shí)，解毒生肌膏可降低炎癥因子表達(dá)，加速潰瘍愈合。

綜上研究結(jié)果證實(shí)，中藥解毒生肌膏可通過下調(diào)IL-6、TNF-α的表達(dá)減輕炎癥，同時(shí)促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合，提高愈合質(zhì)量，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。