安豐豪，曹煜婕，姜珊珊，劉佶軒，李 明

（通化師范學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林通化 134001）

玉米醇溶蛋白是存在于玉米胚乳中的一種醇溶性蛋白，約占玉米蛋白總量的60%[1-2]。雖然玉米醇溶蛋白不溶于水，但由于其含有50%以上的疏水性氨基酸，因此該蛋白質(zhì)可溶解于乙醇溶液、高濃度尿素、堿性pH 值（＞11）緩沖劑和陰離子表面活性劑中[3]，并且可以通過(guò)自組裝轉(zhuǎn)化為具有兩親性的微/納米顆粒，用于運(yùn)載疏水性活性物質(zhì)，提高其穩(wěn)定性和生物利用率[4-8]。然而，玉米醇溶蛋白單獨(dú)作為載體使用時(shí)，其穩(wěn)定性并不理想，對(duì)pH、離子強(qiáng)度和溫度的變化敏感。多糖作為天然材料已被廣泛用于食品工業(yè)，具有高度的穩(wěn)定性、生物相容性和生物可降解性。由于多糖在分子鏈上帶有天然電荷（離子或非離子）和各種基團(tuán)（羥基、羧基、氨基等），因此多糖可以通過(guò)化學(xué)交聯(lián)、物理交聯(lián)、多離子復(fù)合物和自組裝等方式與蛋白質(zhì)一起參與微/納米載體的制備[9-10]。因此，玉米醇溶蛋白常與多糖反應(yīng)制備復(fù)合微粒以提高其穩(wěn)定性。

玉米醇溶蛋白-多糖復(fù)合微粒的制備多采用反溶劑法（anti-solvent），也稱(chēng)為液-液分散法（liquid-liquid dispersion）。目前，在玉米醇溶蛋白-多糖復(fù)合微粒的研究中，多集中于穩(wěn)定性及生物活性物質(zhì)的運(yùn)載方面，對(duì)制備方法則鮮有報(bào)道。Joye 等[11]提出，反溶劑法制備微/納米顆粒的過(guò)程中，混合技術(shù)（攪拌或超聲波）、添加順序（溶劑向反溶劑中加入或反溶劑向溶劑中加入）、添加方式（滴加或倒入）、反溶劑與溶劑的比例、化合物濃度、溫度和穩(wěn)定劑等都可能會(huì)對(duì)產(chǎn)品特性產(chǎn)生影響。因此，本研究重點(diǎn)考察了不同制備技術(shù)對(duì)玉米醇溶蛋白-海藻酸鈉復(fù)合微粒特性的影響，以期促進(jìn)蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合微/納米顆粒技術(shù)的深入研究和推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白，Z3625，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；海藻酸鈉、無(wú)水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉，分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

水浴鍋，DK-S24，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-3000A，上海亞榮生化儀器廠；分光光度計(jì)，722N，上海儀電分析儀器有限公司；高速分散均質(zhì)機(jī)，F(xiàn)J-200S，杭州齊威儀器科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，LGJ-12，北就松源華興科技發(fā)展有限公司；傅立葉紅外光譜分析儀，Nicolet iS20，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合微粒制備

方法一（F1）：將玉米醇溶蛋白溶于80%乙醇后得到玉米醇溶蛋白乙醇溶液，將其滴入海藻酸鈉水溶液中，邊滴邊攪拌，攪拌速率為10 000 r/min，混合后繼續(xù)攪拌5 min，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，用蒸餾水定容至原體積，得復(fù)合微粒溶液，進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。

方法二（F2）：將海藻酸鈉溶液滴入玉米醇溶蛋白乙醇溶液中，其他操作同方法一。

方法三（F3）：將玉米醇溶蛋白乙醇溶液緩慢倒入海藻酸鈉溶液中，其他操作同方法一。

方法四（F4）：將海藻酸鈉溶液緩慢倒入玉米醇溶蛋白乙醇溶液中，其他操作同方法一。

方法五（F5-分階段制備）：將玉米醇溶蛋白乙醇溶液滴入蒸餾水中，邊滴邊攪拌，攪拌速率為10 000 r/min，混合后繼續(xù)攪拌5 min，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，用蒸餾水定容至原體積，得玉米醇溶蛋白微粒懸浮液，然后將玉米醇溶蛋白微粒溶液與等體積海藻酸鈉溶液混合，得復(fù)合微粒溶液，進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。

1.3.2 紅外光譜檢測(cè)

復(fù)合微粒溶液經(jīng)冷凍干燥后得固體樣品，取一定量固體樣品進(jìn)行ATR-FTIR 檢測(cè)，檢測(cè)所得各樣品紅外光譜數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行對(duì)比分析。

1.3.3 穩(wěn)定性檢測(cè)

復(fù)合微粒的穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，微粒是否易于發(fā)生聚集甚至沉淀。復(fù)合微粒聚集時(shí)，粒度增加，粒度變化可由樣品的透光度反映出來(lái)[12]。在一定條件下，當(dāng)樣品的透光度降低，說(shuō)明復(fù)合微粒發(fā)生聚集，粒度增加，溶液渾濁度增加。因此，復(fù)合微粒溶液的透光度可反映樣品微粒的聚集狀態(tài)，從而判斷復(fù)合微粒的穩(wěn)定性。

（1）pH 穩(wěn)定性

吸取1 mL 復(fù)合微粒溶液，加入19 mL 磷酸鹽緩沖溶液（pH 3～8），混勻，在波長(zhǎng)500 nm 條件下測(cè)定溶液的透光度。

（2）離子強(qiáng)度穩(wěn)定性

NaCl溶液濃度分別為200、400、600、800、1 000 mol/L。吸取1 mL 復(fù)合微粒溶液，加入1 mL、200 mol/L NaCl 溶液，混勻，取1 mL 混合溶液，再加入19 mL、100 mol/L NaCl 溶液稀釋?zhuān)诓ㄩL(zhǎng)500 nm 條件下測(cè)定溶液透光度。其它不同NaCl 濃度條件下的離子強(qiáng)度穩(wěn)定性檢測(cè)方法同上。

（3）熱處理穩(wěn)定性

吸取1 mL 復(fù)合微粒溶液，加入19 mL 水，混勻，分別置于45、55、65、75、85、95、100 ℃水浴中，加熱15 min，在波長(zhǎng)500 nm 下測(cè)定溶液透光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。應(yīng)用Origin 8.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備方法對(duì)復(fù)合微粒穩(wěn)定性的影響

2.1.1 制備方法對(duì)復(fù)合微粒pH 穩(wěn)定性的影響

由圖1 可知，pH 變化對(duì)F1 的穩(wěn)定性影響不顯著，但對(duì)F2～F5 具有顯著性影響（P＜0.05）。說(shuō)明F1 對(duì)pH 變化的穩(wěn)定性相對(duì)較好。除F1 和F4 的透光度比較接近外，其它方法制備所得樣品的透光度在數(shù)值上相差較大，其中F3 的透光度最高，其次是F1、F4、F2 和F5，說(shuō)明F3 制備的微粒粒度最小，其次是F1、F4、F2 和F5。由以上結(jié)果可得，F(xiàn)1 的pH 穩(wěn)定性最好，F(xiàn)2 的穩(wěn)定性最差；F3的粒度最小，F(xiàn)5 的粒度最大。因此，在復(fù)合微粒制備過(guò)程中，玉米醇溶蛋白與多糖溶液的添加順序、混合方式（滴入、倒入）以及復(fù)合方式（F5）對(duì)pH 變化的敏感度不同，所得微粒的粒度也不同，是在微粒制備時(shí)需要重點(diǎn)考察的因素。

圖1 制備方法對(duì)復(fù)合微粒pH 穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of preparation method on pH stability of composite microparticles

2.1.2 制備方法對(duì)復(fù)合微粒離子強(qiáng)度穩(wěn)定性的影響

由圖2 可知，離子強(qiáng)度的變化對(duì)復(fù)合微粒的穩(wěn)定性有顯著影響（P＜0.05）。其中，F(xiàn)1 在200 mmol/L NaCl 條件下透光度最高，在300～500 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)變化不顯著；F2 在100～300 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)變化不顯著，但在300～500 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)先下降后上升；F3 在100～300 mmol/L NaCl 范圍透光度逐漸下降，在300～500 mmol/L NaCl 時(shí)透光度先上升后下降；F4 在100～500 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)先上升后下降，300 mmol/L NaCl時(shí)透光度最高；F5 在100～500 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)變化顯著（P＜0.05），在400 mmol/L NaCl 時(shí)透光度最低。通過(guò)以上分析可得，5 種制備方法對(duì)離子強(qiáng)度的變化都較敏感，透光度隨離子強(qiáng)度的變化呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。由極差比較可得，在100～500 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)，F(xiàn)1 的透光度變化相對(duì)最小，F(xiàn)2 的透光度變化相對(duì)最大，因此，各制備方法對(duì)離子強(qiáng)度的相對(duì)穩(wěn)定性由大到小依次是F1＞F5＞F3＞F4＞F2。

圖2 制備方法對(duì)復(fù)合微粒離子強(qiáng)度穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of preparation method on ionic strength stability of composite microparticles

2.1.3 制備方法對(duì)復(fù)合微粒熱處理穩(wěn)定性的影響

透光度可通過(guò)檢測(cè)樣品的混濁度而得，反映了樣品微粒聚集程度的大小或微粒粒度的大小[12]。由圖3 可知，在45～100 ℃范圍內(nèi)，不同制備方法所得復(fù)合微粒的透光度對(duì)溫度的變化比較敏感（P＜0.05），說(shuō)明熱處理對(duì)復(fù)合微粒穩(wěn)定性的影響顯著。5 種制備方法所得的復(fù)合微粒中，F(xiàn)1 對(duì)熱處理的穩(wěn)定性相對(duì)較好，F(xiàn)5 對(duì)熱處理的穩(wěn)定性相對(duì)最低。

圖3 制備方法對(duì)復(fù)合微粒熱處理穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of preparation method on thermo stability of composite microparticles

綜上所述，在復(fù)合微粒制備過(guò)程中，不同的制備方法對(duì)所得微粒的透光度有顯著影響，說(shuō)明不同方法所得微粒的粒度大小差異明顯，同時(shí)，不同制備方法所得微粒的穩(wěn)定性也不同。因此，在利用玉米醇溶蛋白和多糖制備復(fù)合微粒時(shí)，添加順序、混合方式及復(fù)合方式等制備參數(shù)都是需要重點(diǎn)考察的因素。

2.2 不同制備方法所得復(fù)合微粒的紅外光譜分析

傅立葉變換紅外光譜技術(shù)常用于研究蛋白質(zhì)與多糖的相互作用，有效地識(shí)別功能團(tuán)。蛋白質(zhì)重復(fù)單元的振動(dòng)產(chǎn)生一些特征性的紅外吸收帶，如酰胺A、B 和I～VII 等[13]。

由圖4 可知，在玉米醇溶蛋白的紅外光譜中，1 644 cm-1和1 531 cm-1分別屬于酰胺I 帶（1 700～1 600 cm-1區(qū)域，主要是C═O 拉伸）和酰胺II 帶（1 600～1 500 cm-1區(qū)域，主要是C—N 拉伸加上N—H 彎曲模式），3 100～3 500 cm-1是由于羥基的O—H 拉伸振動(dòng)，CH2反對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)拉伸振動(dòng)的光譜在3 000～2 800 cm-1范圍內(nèi)。在海藻酸鈉的紅外光譜中，O—H 和C—H 的伸縮振動(dòng)分別表現(xiàn)在3 242 cm-1和2 925 cm-1[14]，而1 590 cm-1和1 409 cm-1分別來(lái)源于COO—和C═O 的伸縮振動(dòng)[15]，C—O—C 的伸縮振動(dòng)表現(xiàn)在1 082 cm-1[16]。

圖4 玉米醇溶蛋白（A）、海藻酸鈉（B）、玉米醇溶蛋白和海藻酸鈉的物理混合物（C）、方法1～5（D～H）所得微粒的紅外光譜Fig.4 The infrared spectroscopy of Zein (A),sodium alginate(B),zein-alginate physical mixture (C),microparticles obtained from F1～F5 (D～H)

由圖4 可知，玉米醇溶蛋白和海藻酸鈉粉末混合樣品的紅外光譜（圖4C）與F1～F4 的光譜有顯著的區(qū)別，說(shuō)明玉米醇溶蛋白與海藻酸鈉的相互作用不是簡(jiǎn)單的物質(zhì)混合，而是發(fā)生了某些化學(xué)反應(yīng)。有研究顯示，蛋白質(zhì)與多糖之間的相互作用包括離子鍵、氫鍵和疏水作用力[10]。由F1～F4 的光譜結(jié)果可知（圖4 D～G），不同制備方法對(duì)樣品紅外光譜的影響不顯著，說(shuō)明玉米醇溶蛋白與海藻酸鈉的作用機(jī)制是相同的，不受溶液的添加順序和混合方式（滴入、倒入）的影響。但是，由圖4H 可知，F(xiàn)5 的紅外光譜與前4 種樣品的紅外光譜有顯著區(qū)別，說(shuō)明F5 與F1～F4 的反應(yīng)機(jī)制不同。

3 結(jié)論

由穩(wěn)定性研究結(jié)果可得，在玉米醇溶蛋白與海藻酸鈉復(fù)合微粒的制備過(guò)程中，添加順序和混合方式（滴入、倒入）對(duì)微粒的穩(wěn)定性有顯著影響，其中，F(xiàn)1 對(duì)pH 和熱處理的穩(wěn)定性相對(duì)較好。同時(shí)，不同制備方法所得復(fù)合微粒的粒度不同，由小到大依次是F3＜F1＜F4＜F2＜F5。由紅外光譜結(jié)果可得，分階段制備法（F5）與其它方法在微粒的形成機(jī)制上有本質(zhì)的區(qū)別，需要進(jìn)一步深入的研究。