戴曉港，李淑嫻

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方楊樹工程技術(shù)研究中心，江蘇省楊樹種質(zhì)創(chuàng)新與品種改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037)

發(fā)展可再生能源是應(yīng)對(duì)溫室效應(yīng)引起全球氣候變化的重要手段[1]。林木為人類提供了最重要的可再生資源，楊柳科植物由于易于繁殖、生長速度快、產(chǎn)量高，是營建生物質(zhì)能源林重要的樹種之一[2]。全球柳屬有520個(gè)種，主產(chǎn)北半球溫帶地區(qū)[3]，我國柳樹資源豐富，包含種257個(gè)，變種122個(gè)和變型33種，且基本處于野生和半野生狀態(tài)，其遺傳變異豐富，改良潛力大[4]。全球范圍內(nèi)，培育高產(chǎn)和抗逆性強(qiáng)的柳樹無性系以適應(yīng)邊際土地開發(fā)和利用的需求也在不斷增長。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。在模式植物中，AP2/ERF基因家族的生物學(xué)功能已有深入研究。研究結(jié)果表明，該基因家族在很多植物生長過程中起著至關(guān)重要的作用，這些過程包括調(diào)控植物生長和發(fā)育[5-9]，對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的應(yīng)答[11-16]等。如AP2亞家族中的基因被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控植物開花時(shí)間[5]、調(diào)節(jié)花器官生長和發(fā)育[6]、胚珠發(fā)育[7]、決定小穗分生組織形成[8]及葉表皮細(xì)胞形成[9]，而該基因家族的RAV基因受乙烯和油菜素內(nèi)酯等激素調(diào)控[10]，過表達(dá)此類基因可以提高植物對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的抗性[11-12]，ERF亞家族基因則主要參與對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的應(yīng)答，包括病原菌和疾病刺激[13-14]、水分脅迫[15]、鹽脅迫[16]及高溫和低溫脅迫等[17-18]。

AP2/ERF基因家族重要的生物學(xué)功能，使得該家族的基因成為植物育種和基因工程重要的基因資源。簸箕柳基因組染色體水平的組裝序列[19]，為開展簸箕柳全基因組AP2/ERF基因家族分析提供了基礎(chǔ)。對(duì)簸箕柳AP2/ERF基因家族開展研究，有助于全面了解柳樹中該家族基因的組成和進(jìn)化歷史。柳樹不僅耐水濕，而且對(duì)干旱生境的適應(yīng)性很強(qiáng)[20]。本文還對(duì)柳樹干旱條件下差異表達(dá)的AP2/ERF基因進(jìn)行了分析，旨在獲得柳樹與干旱脅迫應(yīng)答有關(guān)的AP2/ERF基因家族候選基因。

1 材料與方法

1.1 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子查找

簸箕柳基因組參照Wei等[19]發(fā)表的序列。基因家族中基因查找方法如下：首先，以擬南芥AP2/ERF基因家族中具有代表性的AT1G25560.1和AT2G28550.1為參考序列[21]，采用BLASTp(2.2.26+)[22]將所有柳樹蛋白質(zhì)序列比對(duì)到上述2個(gè)基因序列上，比對(duì)參數(shù)為E-value=1e-5，Identity≥50%；然后，將所有柳樹蛋白質(zhì)序列采用hmmer-3.0的默認(rèn)參數(shù)[23]和含有AP2 domain的Pfam文件PF00847比對(duì)查找含有AP2 domain的簸箕柳基因；最后，將以上查找的基因去冗余后，再采用SMART(http:∥smart. embl-heidelberg.de/)在線搜索[24]，進(jìn)一步確認(rèn)上述查找的序列中是否含有AP2 domain序列。

1.2 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化

將擬南芥AP2/ERF基因家族[25]和簸箕柳AP2/ERF基因家族蛋白質(zhì)的domain序列采用ClustalW2.1[26]進(jìn)行多重比對(duì)，所有參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置。采用MEGA-X[27]中的鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，參數(shù)設(shè)置為泊松校正、pair-wise deletion、bootstrap，重復(fù)為1 000次，采用Figtree對(duì)構(gòu)建的進(jìn)化樹進(jìn)行可視化(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)。

1.3 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子保守基序和基因結(jié)構(gòu)

利用在線預(yù)測(cè)工具M(jìn)EME(Multiple Em for Motif Elicitation, https://meme-suite.org/meme/tools/meme)對(duì)簸箕柳AP2/ERF蛋白的保守基序(Motif)進(jìn)行分析，設(shè)置Motif個(gè)數(shù)為10個(gè)，Minimum width=10, Maximum width=70，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。根據(jù)基因注釋的gff文件，利用TBtools[28]進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)可視化。

1.4 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子順式作用元件

根據(jù)基因組注釋文件，提取基因家族成員起始密碼子上游2 000 bp序列作為基因的啟動(dòng)子序列，用Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，按照順式元件中與非生物脅迫和激素相關(guān)的順式作用元件對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果分類整理，最后利用TBtools[28]工具整合進(jìn)化樹和對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行可視化。

1.5 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子染色體分布及擴(kuò)增方式

根據(jù)AP2/ERF基因注釋gff文件中基因的位置，采用MapChart[29]將AP2/ERF基因繪制在染色體上。

1.6 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析

從EBI網(wǎng)站中下載了蒿柳雜交子代(S.viminalis×[S.viminalis×S.schwerinii)]基因型520號(hào)干旱脅迫處理和對(duì)照的根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB10883)，使用BWA[30](0.7.15-r1140)軟件將上述序列分別比對(duì)到所有AP2/ERF基因上，比對(duì)參數(shù)為小于等于2個(gè)錯(cuò)配，其余為默認(rèn)參數(shù)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)對(duì)照和干旱脅迫處理分別比對(duì)到每個(gè)基因的序列數(shù)量。采用RPKM (reads per kilobase of transcripts per million mapped reads) 的方法對(duì)統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因表達(dá)量。用DEGseq[31]軟件包來計(jì)算差異表達(dá)的基因，根據(jù)log2RPKM的值≥1，即其表達(dá)量差異超過1倍的、且P-value小于0.01的基因定義為差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量及分類

根據(jù)隱馬爾可夫模型對(duì)Pfam文件PF00847的搜索和擬南芥序列的比對(duì)，同時(shí)采用SMART對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明簸箕柳AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因家族中含有208個(gè)基因(見表1)。根據(jù)基因含有AP2 domain的數(shù)量和序列的相似度對(duì)這208個(gè)基因進(jìn)行分類，24個(gè)基因含有2個(gè)完整的AP2 domain序列被分到AP2家族，177個(gè)基因?qū)儆贓RF家族，其中每個(gè)基因只含有1個(gè)AP2 domain；4個(gè)基因?qū)儆赗AV家族，每個(gè)基因除了含有1個(gè)AP2 domain，還有1個(gè)B3 domain。

表1 簸箕柳AP2/ERF家族基因與毛果楊和擬南芥的比較

2.2 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化分析

以簸箕柳和擬南芥基因蛋白質(zhì)保守域序列，用MEGAX構(gòu)建簸箕柳AP2/ERF基因家族的進(jìn)化樹。進(jìn)化分析結(jié)果表明，雖然EVM0033490.1和EVM0002376.1只含有1個(gè)AP2 domain序列，但是這2個(gè)基因和AP2家族基因序列相似度較高，將這2個(gè)基因分類到AP2家族；還有1個(gè)基因EVM0011433.1雖然只含有1個(gè)AP2 domain序列，但與ERF和AP2家族分化較遠(yuǎn)而被定義為Soloist基因。按照Nakano等[25]對(duì)AP2/ERF基因家族的分類標(biāo)準(zhǔn)，ERF家族中的177個(gè)基因細(xì)分為ERF亞家族和DREB亞家族共12個(gè)group，其中DREB亞家族4個(gè)group (I—IV)分別含有10，15，32和13個(gè)基因成員，ERF亞家族8個(gè)group (V—X, VI-L, Xb-L) 分別含有16，7，6，21，37，14，4和2個(gè)基因成員(如圖1)。

圖1 簸箕柳208個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹

2.3 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白基序分析

利用MEME分析簸箕柳AP2/ERF基因家族的Motif，結(jié)果顯示只有Solisit基因含有1個(gè)Motif，其余所有AP2/ERF家族基因含有2—6個(gè)不等的Motif(如圖2)。簸箕柳208個(gè)AP2/ERF基因，98.6%的基因都含有Motif 2，其次93.8%和91.8%的基因含有Motif 1和Motif 4。大多數(shù)的AP2亞家族的基因都有6個(gè)Motif，其中Motif 3，Motif 5和Motif 6是AP2亞家族特有的Motif，AP2亞家族的26個(gè)基因中，分別有24個(gè)基因含有Motif 3、25個(gè)含有Motif 5、23個(gè)含有Motif 6。Motif 8是ERF亞家族中特有的，其中g(shù)roup Ⅲ的32個(gè)基因中均含有Motif 8。Motif 9和Motif 10是DREB亞家族中的group IX特有的。

圖2 簸箕柳AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白基序

2.4 AP2/ERF家族基因結(jié)構(gòu)

對(duì)簸箕柳AP2/ERF家族基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，不同基因亞家族之間基因結(jié)構(gòu)存在較大的差異。AP2家族中的26個(gè)基因全部含有內(nèi)含子，其內(nèi)含子數(shù)目在5—11個(gè)不等；而ERF家族70個(gè)基因中，只有14個(gè)基因含有內(nèi)含子，除了EVM0020240.1基因含有3個(gè)內(nèi)含子外，其余基因內(nèi)含子數(shù)量為1—2個(gè)；DREB家族中107個(gè)基因，也只有48個(gè)基因有內(nèi)含子，其內(nèi)含子數(shù)目在1—2個(gè)，而含有內(nèi)含子的基因主要集中在V，VII和X 3個(gè)亞家族，共30個(gè)基因含有內(nèi)含子；RAV家族中的4個(gè)基因都沒有內(nèi)含子，這與AP2家族中的基因結(jié)構(gòu)截然不同(如圖3)，而Soloist家族中1個(gè)基因含有5個(gè)內(nèi)含子。

圖3 簸箕柳AP2/ERF家族基因結(jié)構(gòu)

2.5 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件

為了解簸箕柳AP2/ERF家族基因的潛在功能，利用PlantCARE軟件對(duì)基因上游2 000 bp的序列開展啟動(dòng)子順式作用元件分析。結(jié)果顯示(如圖4)，順式作用元件中含有參與激素、光、低溫、防御脅迫、晝夜節(jié)律控制和干旱誘導(dǎo)等響應(yīng)元件。在激素類響應(yīng)元件中，響應(yīng)水楊酸和茉莉酸甲酯應(yīng)答的基因最多，分別有148個(gè)和138個(gè)基因，而應(yīng)答生長素和赤霉素的基因成員較少，分別有21個(gè)和34個(gè)。簸箕柳AP2/ERF家族中也有大量參與非生物脅迫等相關(guān)的作用元件，如干旱誘導(dǎo)、低溫響應(yīng)、防御脅迫等。其中分別有89個(gè)基因成員含有干旱誘導(dǎo)和防御脅迫作用元件，78個(gè)基因含有低溫響應(yīng)作用元件。推測(cè)這些基因在對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答中起著重要的作用。

圖4 簸箕柳AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件

2.6 AP2/ERF基因在染色體上的分布

通過物理作圖繪制出簸箕柳AP2/ERF基因在染色體上的分布(如圖5)。從圖5中可以看出，簸箕柳AP2/ERF基因在19條染色體上的分布是不均勻的，Ⅲ號(hào)染色體和XVI號(hào)染色體含有AP2/ERF基因最多，分別含有23和22個(gè)基因，Ⅱ號(hào)染色體含有18個(gè)AP2/ERF基因，V號(hào)和Ⅷ號(hào)染色體分別含有15個(gè)AP2/ERF基因，VI號(hào)和X號(hào)染色體分別含有15個(gè)AP2/ERF基因，然而IX號(hào)染色體卻只含有2個(gè)AP2/ERF基因。這個(gè)結(jié)果和對(duì)楊樹AP2/ERF基因家族的分析相似，多數(shù)AP2/ERF基因成簇的聚集在一起?；虻膹?fù)制方式分析發(fā)現(xiàn)，這個(gè)基因家族中有19個(gè)串聯(lián)復(fù)制事件共產(chǎn)生42個(gè)AP2/ERF基因，每個(gè)串聯(lián)復(fù)制基因簇基因數(shù)量為2—3個(gè)。在這19條染色體中，Ⅱ，Ⅲ和XVI號(hào)染色體均發(fā)生3次串聯(lián)復(fù)制包含20個(gè)基因，VI和XIV號(hào)染色體發(fā)生2次串聯(lián)復(fù)制包含8個(gè)基因，有7條染色體上均檢測(cè)到1個(gè)串聯(lián)復(fù)制。串聯(lián)重復(fù)導(dǎo)致基因家族成員擴(kuò)張是引起基因家族成員在染色體上分布不均勻的重要原因之一。

2.7 柳樹AP2/ERF抗旱相關(guān)基因分析

Pucholt等[32]完成了蒿柳雜交子代干旱脅迫及對(duì)照根系的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到了一批抗旱有關(guān)的基因，主要包括MYBs轉(zhuǎn)錄因子家族、bZIPs轉(zhuǎn)錄因子家族和葉綠素a/b結(jié)合蛋白等，有1個(gè)AP2基因和ERF基因在對(duì)照和干旱脅迫中存在差異表達(dá)。將蒿柳雜交子代干旱脅迫及對(duì)照處理根系的轉(zhuǎn)錄組序列分別比對(duì)到簸箕柳AP2/ERF家族基因序列上，查找差異表達(dá)的基因，結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出，蒿柳雜交子代在干旱脅迫下有5個(gè)ERF基因(見表2)和對(duì)照相比存在顯著的上調(diào)表達(dá)，Log2RPKM都大于1。在這5個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因中，EVM0039334.1和EVM0014843.1屬于DREB亞家族，且這2個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域都分別含有1個(gè)干旱誘導(dǎo)的響應(yīng)元件，其余3個(gè)基因?qū)儆贓RF亞家族，其中EVM0028026.1在對(duì)照處理中不表達(dá)，只有在干旱脅迫狀態(tài)下才高表達(dá)。

表2 蒿柳雜交子代干旱處理后根系差異表達(dá)的AP2/ERF基因

3 討論

本研究從簸箕柳的全基因組中查找出208個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，基因家族成員總數(shù)量和毛果楊(202個(gè))[33]中的數(shù)量基本相等，高于鉆天柳(173個(gè))[34]和擬南芥(148個(gè))[25]中的數(shù)量。根據(jù)Nakano等[25]的分類標(biāo)準(zhǔn)，簸箕柳的208個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，其中26個(gè)基因?qū)儆贏P2家族，107個(gè)基因?qū)儆贒REB亞家族，70個(gè)基因?qū)儆贓RF亞家族，4個(gè)基因被分類到RAV家族中，還有1個(gè)基因被分類到Soloist中。在簸箕柳和毛果楊基因組中，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子每個(gè)亞家族基因的數(shù)量幾乎是相等的，都含有26個(gè)AP2基因和1個(gè)Soloist基因，ERF亞家族分別含有70個(gè)和66個(gè)基因，DREB亞家族中分別含有107個(gè)和103個(gè)基因，簸箕柳RAV家族只含有4個(gè)基因，而毛果楊中含有6個(gè)基因。每個(gè)亞家族中基因的數(shù)量分布在楊樹和柳樹中基本相似，上述結(jié)果也說明了AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族在楊柳科植物的進(jìn)化過程中是高度保守的。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物基因組中的分布是不均勻的，如毛果楊中40%的基因主要分布在其中的4條染色體上(2n=38)，葡萄[35]中36%的基因主要分布在其中的3條染色體上(2n=38)，AP2/ERF基因在簸箕柳染色體上的分布與楊樹相似，58.2%的基因主要分布在其中的7條染色體上(2n=38)。這種基因在染色體上的不均勻分布可能與基因復(fù)制擴(kuò)張的方式有關(guān)[33-34]。在簸箕柳208個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子中，有42個(gè)基因是通過串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生的，如第Ⅱ，Ⅲ和XVI是含有AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子最多的染色體，在這3條染色體上共有9個(gè)串聯(lián)復(fù)制，包含20個(gè)AP2/ERF基因。簸箕柳第I號(hào)染色體的物理長度約是其他18條染色體長度的2倍，但簸箕柳第I染色體只含有12個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，其數(shù)量約是第Ⅲ和第XVI等染色體的1/2。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子保守的廣泛分布于植物中，參與控制植物的多種代謝[36]，主要包括控制植物生長和發(fā)育、對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)等。由于該基因家族的可塑性和這個(gè)基因家族每個(gè)成員的特異性，通過轉(zhuǎn)基因和過表達(dá)AP2/ERF某些轉(zhuǎn)錄因子可以提高植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗逆性，如DREB亞家族轉(zhuǎn)錄因子主要和順式作用脫水應(yīng)答元件相互作用提高植物對(duì)脅迫的響應(yīng)，在煙草中過表達(dá)AhDREB1基因可以提高抗鹽和抗干旱能力[37]；在擬南芥中過表達(dá)DREB19可以顯著提高植株對(duì)干旱和高鹽脅迫的能力，且對(duì)植株的表型不會(huì)帶來有害的影響[38]。Pucholt等[32]對(duì)蒿柳雜交子代在干旱脅迫下及對(duì)照處理轉(zhuǎn)錄組的分析，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)AP2和1個(gè)ERF基因在干旱脅迫處理后顯著上調(diào)表達(dá)，而全基因組測(cè)序的完成為轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析提供了重要的參考，將上述對(duì)照和干旱處理獲得的柳樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，比對(duì)到簸箕柳基因組上，發(fā)現(xiàn)5個(gè)ERF家族基因在干旱脅迫條件下顯著上調(diào)表達(dá)，其中EVM0039334.1和EVM0014843.1屬于DREB亞家族。之前的研究也表明，過表達(dá)DREB基因可以提高植株抗旱性[37-38]，且這2個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域都分別含有1個(gè)干旱誘導(dǎo)的響應(yīng)元件，推測(cè)這2個(gè)基因在柳樹的抗旱中起到重要的作用。簸箕柳AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和分析，將為通過轉(zhuǎn)基因培育對(duì)生物和非生物脅迫抗逆性高的柳樹提供基因資源。