朱 慶,高 蓉

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所,南京 210014;2.南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗學系,南京 211166)

殺蟲劑的選擇性毒性是指其能夠致死某種害蟲，但對非靶標生物如天敵、高等動物等相對無害或對一些害蟲有毒而對另一些害蟲無毒。選擇性毒性的機制主要有作用靶標的選擇性和代謝差異的選擇性。生物體內(nèi)羧酸酯酶、細胞色素P450、谷胱甘肽轉移酶、ABC轉運蛋白、UGT葡萄糖醛酸轉移酶等是生物體內(nèi)重要的解毒酶系，這些解毒酶基因的數(shù)量、豐富度和代謝活性的差異是造成選擇性毒性的重要因素。如擬除蟲菊酯類殺蟲劑在哺乳動物體內(nèi)經(jīng)羧酸酯酶催化的水解反應和P450催化的氧化反應兩種途徑快速水解擬除蟲菊酯是其選擇性毒性的重要機制(Kaneko,2011)。而目前高選擇性殺蟲劑的開發(fā)更多地關注靶標的選擇性，這種選擇性來源于兩種情況。一是殺蟲劑的作用靶標是昆蟲特有的。此類殺蟲劑比較典型的是調(diào)節(jié)或干擾昆蟲生長發(fā)育的昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，如作用于蛻皮激素受體的蛻皮激素類似物和雙酰阱類殺蟲劑，作用于保幼激素受體的保幼激素類似物、昆蟲幾丁質(zhì)合成抑制劑和昆蟲幾丁質(zhì)酶抑制劑等(Liuetal.,2017)；二是不同物種中作用靶標對殺蟲劑的敏感性不同。殺蟲劑作用靶標是害蟲與殺蟲劑互作過程中被賦予藥物效應的特定分子，通常為生命活動中具有不可或缺的生物學功能的離子通道、酶或結構蛋白。如比較昆蟲和哺乳動物煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)離子通道對不同新煙堿類殺蟲劑的敏感性發(fā)現(xiàn)，烯啶蟲胺對害蟲nAChRs的親和力是對哺乳動物的3 500倍，噻蟲胺與吡蟲啉的選擇毒力比(哺乳動物半數(shù)抑制濃度與昆蟲半數(shù)抑制濃度之比)分別為1 591和605(Casida,2018)。此外，電壓門控鈉離子通道(簡稱鈉通道)作為另一種重要的靶標蛋白也吸引了研究人員的大量關注(Ffrench-Constantetal.,2016)。

鈉通道在神經(jīng)元和興奮性細胞動作電位的產(chǎn)生和傳導過程中扮演著極為重要的角色(Catterall,2000)。對于哺乳動物鈉通道的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物鈉通道由220～260 kD的α亞基和30～40 kD的β輔助亞基組成(Lopez-Charcasetal.,2021)。昆蟲鈉通道的研究相對滯后，其整體結構和氨基酸序列與哺乳動物鈉通道高度相似，由一個α亞基和一個輔助亞基TipE組成(Vaisetal.,2001;Tsengetal.,2007;Wangetal.,2013,2015)。

鈉通道毒素是研究電壓依賴性鈉離子通道門控機制的有力分子探針，因此其作用位點也一直是研究的熱點之一。根據(jù)這些毒素生理活性和結合位點的不同，至少存在7類鈉通道毒素，分別對應于鈉通道上的7個作用位點。包括作用于鈉通道位點1的河豚毒素、蛤蚌毒素和μ芋螺毒素，作用于位點2的箭蛙毒素、藜蘆定和烏頭堿，作用于位點3的α蝎毒素和?？舅兀饔糜谖稽c4的β蝎毒素，作用于位點5的雪卡毒素和短裸甲藻毒素，作用于位點6的δ芋螺毒素以及作用于位點7的擬除蟲菊酯類化合物(Blumenthal and Seibert,2003;Catteralletal.,2007;Lopez-Charcasetal.,2021)。其中，位點3毒素(包括α-蝎毒素、海葵毒素和蜘蛛毒素)能夠延緩或阻止鈉通道的失活，使通道保持在開放狀態(tài)，從而使動作電位重復發(fā)放，造成獵物的痙攣(de Limaetal.,2002;Arnonetal.,2005;Groomeetal.,2011;Maetal.,2013;Clairfeuilleetal.,2019)。

在鈉通道位點3毒素中，與其他毒素相比，關于Ⅲ型海葵毒素(type III sea anemone toxin,Av3)分子生物活性表面的研究極少。Av3只含有27個氨基酸，并有許多疏水方環(huán)殘基，二級結構既不含α螺旋也沒有β折疊(Manoleras and Norton,1994;Honma and Shiomi,2006)。已有報道顯示，對小鼠腹腔注射Av3的半數(shù)有效劑量(median effective dose,ED50)大于6 μmol/kg，對絲光麗蠅Luciliasericata幼蟲ED50為2.65 pmol/100 mg (Moranetal.,2007)，結果提示Av3是一個對昆蟲活性高，而對哺乳動物活性非常低的具有選擇性的鈉通道毒素。作為常見的衛(wèi)生害蟲，德國小蠊Blattellagermanica可以攜帶多種致病細菌和病毒，從而導致痢疾、肝炎、傷寒等多種疾病的傳播，也可以引起哮喘等過敏反應。因此，本研究通過丙氨酸篩選和生物活性測定試驗分析Av3毒素的生物活性表面，以及借助電生理技術研究Av3毒素在德國小蠊鈉通道上的關鍵作用位點，以期為以德國小蠊為靶標的新型殺蟲劑的對靶設計提供重要信息，同時為探索鈉通道結構和功能的關系提供信息和參考。

1 材料與方法

1.1 供試動物及昆蟲

德國小蠊取自江蘇省疾病預防控制中心消毒與媒介生物防治所，為室內(nèi)人工飼養(yǎng)種群。在溫度29±1℃、相對濕度70%、光周期12L∶12D的光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，以全價顆粒鼠料喂育。

非洲爪蟾購自中國科學院上海神經(jīng)科學研究所，在光周期為12L∶12D的斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)JXZ-500D中培養(yǎng)，以搖蚊幼蟲為食物喂養(yǎng)。

1.2 供試化合物和試劑

Av3野生型(Av3 wild type,Av3-WT)及其氨基酸突變體購自上海強耀生物科技有限公司，德國小蠊鈉通道BgNav1-1a及輔助亞基TipE與大鼠鈉通道rNav1.2a由美國密歇根州立大學董珂教授贈與。Stbl2感受態(tài)細胞購自Invitrogen公司，KpnI,BamHⅠ,EcoRⅠ,HandⅢ和PvuⅡ等酶購自TaKaRa公司，其他生化試劑均購自Sigma公司。

1.3 德國小蠊生物活性測定

1.4 德國小蠊鈉通道BgNav1-1a在非洲爪蟾卵母細胞中的表達

取2年齡健康非洲爪蟾的卵母細胞，經(jīng)Type IA膠原酶消化后逐個分離。PvuⅡ和EcoRⅠ分別驗證BgNav1-1a和輔助亞基TipE酶切圖譜。NotⅠ酶線性化BgNav1-1a和TipE，T7轉錄試劑盒(Promega)轉錄BgNav1-1a和TipE并純化。BgNav1-1a和輔助亞基TipE的cRNA按質(zhì)量比1∶1顯微鏡下注射非洲爪蟾卵母細胞。每個細胞注射40～50 nL(Fengetal.,1995;Warmkeetal.,1997)。

1.5 毒素與鈉通道突變體和嵌合體的構建

Av3-WT的一級結構由27個氨基酸組成，在這27個氨基酸中，除了對空間結構的穩(wěn)定性格外重要的6個半胱氨酸(Cys)和5個參與到二級結構中轉角構成的甘氨酸(Gly)保持不變之外(Manoleras and Norton,1994)，剩余氨基酸進行丙氨酸掃描(Ala-scanning)突變，共形成16個Av3突變體。目前，鈉通道上毒素作用位點3主要由4個胞外環(huán)DIV/S1-S2(Loop 3,L3)，DIV/S3-S4(Loop 4,L4)，DI/S5-SS1(Loop 1,L1)和DI/SS2-S6(Loop 2,L2)構成(Wangetal.,2011)。本研究中鈉通道嵌合體主要以BgNav1-1a為骨架，將其4個胞外環(huán)分別替換為對Av3不敏感的rNav1.2a上的胞外環(huán)，構建7個重組嵌合體，分別為Chimera 1(替換L1,L2,L3,L4)、Chimera 2(替換L3,L4)、Chimera 3(替換L1,L2)、Chimera 4(替換L3)、Chimera 5(替換L4)、Chimera 6(替換L1)、Chimera 7(替換L2)。Av3突變體的合成由上海強耀生物有限公司完成?；阝c通道BgNav1-1a及rNav1.2a的嵌合體及突變體由蘇州金唯智生物科技有限公司構建完成。

1.6 鈉電流的記錄

待表達電流在1.5～2.0 μA之間開始記錄。使用美國Axon公司的900A放大器和1440A數(shù)模轉換器記錄電流。激活程序：置鉗制電位于-120 mV，給予從-100--10 mV，以5 mV遞增，波寬為30 ms的去極化脈沖刺激，記錄激活電流。失活程序：置鉗制電位為-120 mV，先給予從-100--10 mV、時程為100 ms、5 mV遞增的預刺激脈沖，然后再給予-10 mV的測試脈沖刺激，波寬為20 ms，記錄通道失活電流。峰電流程序：置鉗制電位為-120 mV，給予-10 mV的測試脈沖刺激，波寬為20 ms，記錄通道最大開放時的峰電流值(Tanetal.,2005)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

激活曲線擬合方程：先以方程G=I/(Vm-VNa)計算電導，其中G為峰電導，I為峰電流，Vm為膜電位，VNa為翻轉電位；再以Boltzmann方程擬和：G/Gmax=1/{1+exp[(Vm-V1/2)/k]}，其中Gmax為峰電導的最大值，V1/2為半數(shù)激活電壓，k激活斜率因子。失活曲線擬合方程：I/Icontrol=1/{1+exp[(Vm-V1/2)/k]}，其中Imax為峰電流的最大值，Vm為膜電位，V1/2半數(shù)失活電壓，k失活斜率因子。Av3-WT及其突變體導致通道失活被抑制的比例(通道失活的抑制率)我們通過參數(shù)I20/Ipeak來表示，I20代表時間在20 ms處的電流值，本研究中毒素作用下20 ms時鈉通道失活被抑制程度已處于穩(wěn)定狀態(tài)，Ipeak代表峰電流的大小(Gaoetal.,2014)。實驗中每一組測試的細胞數(shù)n>6，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，結果分析采用Origin8.0軟件和Sigmaplot9.0軟件完成；Editseq和Bioedit軟件被用來對序列進行分析和翻譯。應用Student氏t檢驗和方差分析進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 Av3-WT及其突變體的化學合成與殺蟲活性

Av3-WT的一級結構由27個氨基酸組成，6個半胱氨酸形成3對二硫鍵交聯(lián)形成Av3-WT的空間網(wǎng)狀結構(圖1)。通過化學合成獲得的毒素突變體利用反相高效液相色譜技術和電噴霧質(zhì)譜技術確定其純度和分子量。經(jīng)檢測，Av3-WT及其突變體的純度在85.81%～98.89%之間，合成后的毒素分子量與預測分子量差值在0.16～6.74之間(表1)。

表1 化學合成的Av3-WT及其氨基酸突變體的純度和分子量Table 1 Purity and molecular weight of chemically synthesized Av3-WT and its amino acid mutants

圖1 溝迎風海葵Ⅲ型海葵毒素Av3野生型(Av3-WT)氨基酸序列及二硫鍵Fig.1 Amino acid sequence and disulfide bonds of type III sea anemone toxin (Av3)wild type (Av3-WT) from Anemonia viridis實線代表二硫鍵。Solid lines represent disulfide bonds.

德國小蠊成蟲經(jīng)胸部側線區(qū)域注射給予Av3-WT后10 min可陸續(xù)觀察到蟲體有效的翻仰，腹部抽搐無法爬行等現(xiàn)象，8 h后可觀察到蟲體的死亡。Av3-WT引起德國小蠊的擊倒效應和致死效應呈現(xiàn)劑量依賴性，KD50和LD50分別為20.51±6.2 pmol/g和30.05±9.8 pmol/g。毒素的不同突變體對德國小蠊成蟲的毒性效果變化不一，對德國小蠊成蟲KD50如表2所示。其中，R1A,P5A,P12A,W13A,N16A和S23A對德國小蠊的KD50是Av3-WT的2.1～5.7倍；Y7和W8 2個位點的突變則更為顯著地降低了毒素對德國小蠊成蟲的毒性作用，對試蟲造成半數(shù)擊倒效應所需的劑量分別是Av3-WT的24.8倍和12.4倍；而Y18A毒素毒性作用的降低最為顯著，在Y18A濃度達到1 nmol/g時，對德國小蠊成蟲的擊倒效應數(shù)不足50%，故Y18A的KD50遠大于1 nmol/g(表2)。除此之外，S2A,E20A和K26A毒素毒性作用的降低并不顯著，對試蟲的KD50與Av3-WT接近，分別為38.8,27.3和25.1 pmol/g(表2)。其中，Q15,P19和P25 3個位點的突變則升高了毒素對試蟲的毒性作用，造成擊倒效應的劑量分別是Av3-WT的0.8,0.7和0.9倍(表2)。

表2 Av3-WT及其突變體對德國小蠊成蟲的毒性Table 2 Toxicity of Av3-WT and its mutants to Blattella germanica adults

24 h后觀察毒素的致死效應，我們發(fā)現(xiàn)突變體Y7A,W8A和Y18A對德國小蠊成蟲的致死效應降低顯著。Y7A的KD50和LD50分別為510.3±60.3 pmol/g和737.8±63.2 pmol/g，W8A的KD50和LD50分別為253.9±36.7 pmol/g和303.2±45.7 pmol/g，而Y18A的KD50和LD50則超過1 nmol/g(表2;圖2)。

圖2 Av3-WT及其突變體Y7A,W8A和Y18A對德國小蠊成蟲的半數(shù)擊倒劑量(KD50)(A)和半數(shù)致死劑量(LD50)(B)Fig.2 Median knockdown doses (KD50)(A)and median lethal doses (LD50)(B)of Av3-WT and its mutants Y7A,W8A and Y18A on Blattella germanica adultsAv3-WT:Av3野生型 Av3 wild type.下同The same below.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；星號和雙星號分別表示與Av3-WT差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(Student氏t檢驗)。Data in the figure are mean±SE.Asterisk and double asterisk indicate significant difference (P<0.05)and extremely significant difference (P<0.01)from Av3-WT (Student’s t-test).圖4 同The same for Fig.4.

2.2 Av3及其突變體對德國小蠊鈉通道失活的抑制

按質(zhì)量比1∶1將BgNav1-1a和TipE的cRNA注入爪蟾卵母細胞共表達24 h后記錄到穩(wěn)定的鈉電流。經(jīng)波茨曼方程擬合后得到半數(shù)激活電壓和半數(shù)失活電壓分別為-29.3±1.3 mV和-49.2±1.0 mV。同時，結果顯示Av3-WT抑制BgNav1-1a通道失活的半數(shù)有效濃度為196.26 nmol/L(圖3:A)，選取250 nmol/L(EC60)的濃度作為后續(xù)實驗中檢測各毒素突變體對BgNav1-1a失活的抑制效果。與加藥前相比，250 nmol/L的Av3-WT顯著增加了峰電流值，由1.25 μA變?yōu)?.7 μA；同時通道的失活也被顯著抑制，I20/Ipeak×100%為62%(圖3:B)。我們分別檢測了Av3的16個丙氨酸突變體在250 nmol/L的濃度時對BgNav1-1a失活的影響。結果顯示，在第1部分的生測實驗中顯著降低了對德國小蠊成蟲毒性作用的3個突變體(Y7A,W8A和Y18A),在電生理實驗中也顯著降低了它們對鈉通道BgNav1-1a失活的抑制(圖4:A-C)，Y7A,W8A和Y18A的I20/Ipeak×100%分別12%,23%和8%(圖4:F)；S23A和P25A顯著增加了毒素對BgNav1-1a失活的抑制(圖4:D,E)，通道失活的抑制率分別為88.3%和100%。而在生測實驗中，這2個位點突變后毒素的毒性變化并不大(表2)。除此之外，其他突變體對通道失活的抑制效果和Av3-WT相比差別不大，R1A,P5A,P12A,W13A,N16A抑制BgNav1-1a失活的通道數(shù)占總通道數(shù)的比例分別為50%,46%,39%,45%和60%(圖4:F)。

圖3 Av3-WT對德國小蠊鈉通道BgNav1-1a 失活的抑制Fig.3 Inhibition of Av3-WT on the inactivation of sodium channel BgNav1-1a of Blattella germanicaControl:注射生理鹽水的對照組Injection of physiological saline as the control group.圖4-6同。The same for Figs.4-6.A:Av3-WT對德國小蠊鈉通道 BgNav1-1a失活抑制的劑量依賴曲線Dose dependent curve of inactivation inhibition effect of Av3-WT on BgNav1-1a;B:250 nmol/L Av3-WT作用下德國小蠊鈉通道 BgNav1-1a電流曲線Current traces of BgNav1-1a with or without 250 nmol/L Av3-WT.I20/Ipeak (%)：通道失活的抑制率 (%)Inhibition rate (%)of channel inactivation.

圖4 Av3突變體對德國小蠊鈉通道 BgNav1-1a 失活的抑制Fig.4 Inhibition of Av3 mutants on the inactivation of sodium channel BgNav1-1a of Blattella germanicaA:250 nmol/L Y7A對德國小蠊鈉通道BgNav1-1a失活的抑制Inhibition of 250 nmol/L Y7A on BgNav1-1a inactivation;B:250 nmol/L W8A對德國小蠊鈉通道 BgNav1-1a失活的抑制Inhibition of 250 nmol/L W8A on BgNav1-1a inactivation;C:250 nmol/L的Y18A對德國小蠊鈉通道 BgNav1-1a失活的抑制Inhibition of 250 nmol/L Y18A on BgNav1-1a inactivation;D:250 nmol/L S23A對德國小蠊鈉通道 BgNav1-1a失活的抑制Inhibition of 250 nmol/L S23A on BgNav1-1a inactivation;E:250 nmol/L P25A對德國小蠊鈉通道 BgNav1-1a失活的抑制Inhibition of 250 nmol/L P25A on BgNav1-1a inactivation;F:Av3突變體對德國小蠊鈉通道 BgNav1-1a失活的抑制情況Inhibition of Av3 mutants on BgNav1-1a inactivation.

2.3 德國小蠊鈉通道上影響Av3-WT選擇性毒性的關鍵位點

經(jīng)雙電極電壓鉗技術檢測，在1 μmol/L Av3-WT的作用下，Chimera 1通道的失活未受到抑制(圖5:A)。因此，我們推斷，BgNav1-1a DI和DIV上4個胞外環(huán)的替換移除了Av3-WT在BgNav1-1a上的結合位點。為了進一步明確4個胞外環(huán)中哪個或者哪幾個參與Av3-WT與BgNav1-1a的結合，我們分別檢測了替換DI或DIV上2個胞外環(huán)的嵌合體Chimera 3和Chimera 2對Av3-WT的敏感性。其中，Chimera 2對250 nmol/L的Av3-WT敏感，毒素作用下63%的通道的失活受到抑制(圖5:B)，而Chimera 3則對Av3-WT不敏感，通道的失活幾乎不被抑制(圖5:C)。為了進一步確定DI上L1和L2 2個胞外環(huán)對Av3-WT與BgNav1-1a結合的作用，分別檢測了Chimera 6(替換L1)和Chimera 7(替換L2)對Av3-WT的敏感性。結果顯示，67%的Chimera 6通道在Av3-WT的作用下，失活被抑制(圖5:D)，而在1 μmol/L的Av3-WT作用下，僅3.6%的Chimera 7的失活被抑制(圖5:E)。

圖5 Av3-WT對以BgNav1-1a為骨架替換rNav1.2a胞外環(huán)的重組嵌合體通道失活的抑制Fig.5 Inhibition of Av3-WT on inactivation of recombinant chimeric channels bearing extracellular loops of rNav1.2a in BgNav1-1aA:1 μmol/L的Av3-WT對嵌合體1(替換L1,L2,L3和L4)的作用Action of 1 μmol/L Av3-WT on chimera 1 (L1,L2,L3 and L4 replaced);B:250 nmol/L的Av3-WT對嵌合體2(替換L3和L4)的作用Action of 250 nmol/L Av3-WT on chimera 2 (L3 and L4 replaced);C:1 μmol/L的Av3-WT 對嵌合體3(替換L1和L2)的作用Action of 1 μmol/L Av3-WT on chimera 3 (L1 and L2 replaced);D:250 nmol/L的Av3-WT對嵌合體6(替換L1)的作用Action of 250 nmol/L Av3-WT on chimera 6 (L1 replaced);E:1 μmol/L的Av3-WT 對嵌合體7(替換L2)的作用Action of 1 μmol/L Av3-WT on chimera 7 (L2 replaced).

通過對BgNav1-1a與rNav1.2a胞外環(huán)DI/SS2-S6序列比對(圖6:A)，發(fā)現(xiàn)兩個通道在這一片段上的氨基酸序列相差并不大，利用定點突變技術將BgNav1-1a通道DI/SS2-S6上的Val396,Ser399,Pro402,Trp403和His404分別替代為rNav1.2a上所對應的Thr,Ala,Lys,Thr和Tyr。突變體V396T,S399A,P402K和W403T幾乎不影響Av3-WT對通道失活的抑制，而H404Y則顯著的降低了Av3-WT對通道失活的抑制作用，1 μmol/L Av3-WT作用下失活被抑制的通道比例僅為6%(圖6:B-F)。

圖6 DI/SS2-S6上氨基酸替代對Av3-WT抑制BgNav1-1a失活的影響Fig.6 Effect of amino acid substitution on DI/SS2-S6 on the inhibition of Av3-WT on BgNav1-1a inactivationA:BgNav1-1a與rNav1.2a上胞外環(huán)DI/SS2-S6氨基酸序列比對Amino acid sequence alignment of DI/SS2-S6 in BgNav1-1a and rNav1.2a;B:Av3-WT對突變體V396T的作用Action of Av3-WT on mutant V396T;C:Av3-WT對突變體S399A的作用Action of Av3-WT on mutant S399A;D:Av3-WT對突變體P402K的作用Action of Av3-WT on mutant P402K;E:Av3-WT對突變體W403T的作用Action of Av3-WT on mutant W403T;F:Av3-WT對突變體H404Y的作用Action of Av3-WT on mutant H404Y.

3 討論

天然產(chǎn)物是尋找對靶標生物具有特異活性物質(zhì)的巨大寶庫。如從蝎毒、蛇毒、芋螺毒素中分離得到的抗昆蟲毒素和抗哺乳動物毒素一直是這一領域研究的熱點，研究結果可以為疾病治療藥物和新型殺蟲劑的研制提供重要信息(Smithetal.,2013;Chatterjee,2018;Senji Laxmeetal.,2019)。Ⅲ型?？舅谹v3較小的分子量(27個氨基酸)以及其獨特的空間構型吸引了我們的注意(Madioetal.,2019)。本研究利用化學合成的方法構建了溝迎風?？蘑笮秃？舅匾吧虯v3-WT及其16個突變體(表1)。在Av3-WT及其突變體對德國小蠊的毒性試驗中，我們發(fā)現(xiàn)Av3-WT對德國小蠊成蟲具有較強的擊倒效應，而突變體R1A,P5A,Y7A,W8A,P12A,W13A,N16A,Y18A和S23A與Av3-WT相比都顯示出了對德國小蠊成蟲毒性作用的顯著降低(表2)。由于Av3分子二級結構沒有α螺旋和β折疊，只有轉角(Madioetal.,2019)，個別位點的突變極有可能引起Av3分子空間結構攝動，而這種攝動會影響到Av3與通道的親和性，從而影響到多肽毒素的作用。所以我們在后續(xù)的實驗中將會利用圓二色譜和傅立葉紅外光譜技術分析以上位點的突變是否導致了空間結構的攝動。

在本研究中，為進一步明確Av3分子與靶標蛋白互作的生物活性表面，我們利用雙電極電壓鉗技術來檢測毒素對其受體德國小蠊鈉通道BgNav1-1a的作用，結合生物活性測定試驗分析構成Av3分子生物活性表面的關鍵氨基酸。在德國小蠊生物活性測定試驗中展示出改變毒素毒性作用的突變體R1A,P5A,Y7A,W8A,P12A,W13A,N16A,Y18A和S23A抑制BgNav1-1a失活的通道數(shù)占總通道數(shù)的比例分別為50%,46%,12%,23%,39%,45%,60%,8%和88.3%。我們發(fā)現(xiàn)，這些多肽毒素突變體中，Y7A,W8A和Y18A這3個突變體除了在生物活性測定試驗中顯著降低了毒素對試蟲的毒性作用(圖2)，也極大地降低了對BgNav1-1a失活的抑制(圖4)。這表明，Y7,W8和Y18這3個位點的突變影響了通道對毒素的敏感性，使得毒素對通道失活的抑制作用不夠顯著，從而降低了德國小蠊體內(nèi)動作電位點火的頻率，也就降低了毒素對德國小蠊成蟲的神經(jīng)興奮毒性。Dalia Gordon和Michael Gurevitz團隊的生物活性測定研究發(fā)現(xiàn)Av3上Y7,P12,W13和Y18 4個位點的突變顯著降低了毒素對麗蠅幼蟲的毒性作用(Moranetal.,2007)，與本研究結果相似，差異之處可能是源于不同靶標試蟲體內(nèi)毒素受體的結構差異。我們推斷Tyr7,Trp8和Tyr18這3個位點上的芳香族氨基酸參與構成了Av3分子對德國小蠊鈉通道作用的生物活性表面。同為鈉通道位點3毒素的Ⅱ型?？舅谹v2和α蝎毒素的生物活性表面與Av3相比，差異較大。Av2分子的生物活性表面不包含芳香族氨基酸(Moranetal.,2006;Kalinaetal.,2020),α蝎毒素LqhαIT的生物活性表面更大，分為兩個主要氨基酸簇(Bosmans and Tytgat,2007;Gordon,2007;Chen and Chung,2012)。3類生物活性表面結構差異較大的毒素同時可與鈉通道位點3作用，發(fā)揮抑制通道失活的特性，暗示鈉通道位點3涵蓋了通道上較廣的區(qū)域(Clairfeuilleetal.,2019)。另外，對德國小蠊成蟲毒性作用變化并不算顯著的兩個突變體S23A和P25A在電生理實驗中顯著增加了多肽毒素對通道失活的抑制作用。兩者抑制通道數(shù)目占總通道數(shù)目的比例分別為88%和100%。同一種多肽毒素在蛋白水平實驗和動物在體實驗中表現(xiàn)出作用效果的差異，來源于活體動物對不同多肽毒素的消化和代謝。這一結果的發(fā)現(xiàn)表明S23和P25這2個位點上的氨基酸以某種方式參與到干擾和阻礙Av3與德國小蠊鈉通道BgNav1-1a的相互作用。同時，給我們提供了通過“毒素工程”理論進一步改造和提高Av3毒性的思路和建議，也證實了在自然界中所獲得的多肽可以進一步改進其潛在殺蟲活性的可行性(Yanetal.,2014;Sinha and Shukla,2019)。

基于德國小蠊鈉通道BgNav1-1a和大鼠鈉通道亞型rNav1.2a構建的重組嵌合體與電生理試驗結果表明以rNav1.2a上的DI/SS2-S6替換BgNav1-1a上對應的胞外環(huán)后所得的嵌合體通道對Av3的敏感性顯著降低(圖6)。原本我們想通過反向替換，將BgNav1-1a上的DI/SS2-S6替換到rNav1.2a上，以觀察構成的嵌合體是否可以改變rNav1.2a對Av3的不敏感性，但此嵌合體在爪蟾卵母細胞中的表達并不成功，沒有檢測到電流亦或電流值很低不足以被觀察到。而DI/SS2-S6上氨基酸H404突變后顯著降低了BgNav1-1a對毒素的敏感性，更進一步確定了Av3在德國小蠊鈉通道上選擇性毒性的關鍵位點。序列比對發(fā)現(xiàn)，在節(jié)肢動物門中，昆蟲、螨蟲和甲殼綱類生物在對應BgNav1-1a上的His404位點較為保守(Gur Barzilaietal.,2014)，基本都是組氨酸(His)，而脊椎動物亞門鈉通道對應的位點多為酪氨酸(Tyr)。我們相信，正是這個差異使得節(jié)肢動物門生物對Av3毒素更敏感(Béressetal.,1975;Schweitzetal.,1981;Moranetal.,2007;Yanetal.,2014;Niklasetal.,2021)，而包括哺乳動物、蛙、魚在內(nèi)的脊椎動物亞門生物則對Av3不敏感(Erxlebenetal.,1984;Moranetal.,2007;Fraz?oetal.,2012)。這也為我們在以后研究脊椎動物安全的多肽殺蟲劑提供了參考和借鑒。

致謝本研究感謝美國密歇根州立大學董珂教授提供的鈉通道BgNav1-1a和rNav1.2a質(zhì)粒以及南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院高聰芬教授提供的儀器使用指導。