陳敬忠，黃小龍，劉濟(jì)明*，孫慶文

（1 貴州大學(xué)林學(xué)院, 貴州貴陽(yáng) 550025；2 貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 貴州貴陽(yáng) 550025）

米槁 (Cinnamomum migaoH.W.Li)系樟科(Lauraceae)樟屬常綠高大喬木，是我國(guó)西南地區(qū)特有藥用植物，僅分布在滇黔桂交界干熱河谷地帶。由于分布區(qū)極為狹窄，種群數(shù)量稀少，《中國(guó)生物多樣性紅色物種名錄 · 高等植物卷》已將其列為近危物種(NT)[1–2]。米槁果實(shí)(即大果木姜子Fructus Cinnamomi)是貴州著名道地藥材和十大苗藥之一，在治療胃腸道和心腦血管疾病方面療效顯著。但由于不同產(chǎn)地米槁果實(shí)化學(xué)成分存在較大的地理變異，導(dǎo)致其藥材品質(zhì)差異很大[3]，造成了其藥材質(zhì)量良莠不齊。確定其果實(shí)化學(xué)成分地理變異的主導(dǎo)因素，有助于后期在人工栽培當(dāng)中選擇合適條件培育出質(zhì)優(yōu)效佳的藥材，但前期對(duì)于米槁果實(shí)化學(xué)成分變異原因研究表明，遺傳基礎(chǔ)、氣候和土壤條件均不是其化學(xué)成分地理變異的主導(dǎo)因素[4–5]。本研究小組發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分的形成與根際微生物之間存在密切的聯(lián)系，可能是其化學(xué)成分變異的主導(dǎo)因素之一[6]，但根際微生物多樣性在米槁果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的變化與果實(shí)成分積累的關(guān)系尚待解答。

大量研究表明，植物-微生物之間的互作反饋機(jī)制會(huì)影響植物的生理生化過(guò)程，二者相互作用深刻影響植物適應(yīng)性和生產(chǎn)力[7-9]。如植物根際中廣泛存在的Bacillus屬已被證實(shí)能夠促進(jìn)包括大豆、小麥、玉米等作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量的提升[10-11]。藥用植物丹參(Salvia miltiorrhiza)、三七 (Panax notoginseng)、人參(Panax ginseng)品質(zhì)的形成深受其根際微生物中的亞硝化細(xì)菌、固氮菌和芳香族分解菌的調(diào)控[12–13]。柑橘(Citrus reticulata)等經(jīng)濟(jì)果樹(shù)的研究也證明了根際微生物對(duì)其品質(zhì)形成的重要影響[14]。本研究小組對(duì)不同產(chǎn)地成熟時(shí)期根際真菌與米槁果實(shí)化學(xué)成分關(guān)系進(jìn)行了初步研究，表明傘菌屬(Agaricus)、鐮孢菌屬(Fusarium)、瓶霉屬(Phialophora)對(duì)米槁果實(shí)指標(biāo)成分檜烯及α-松油醇具有明顯的促進(jìn)作用，一定程度上佐證了根際微生物是影響米槁化學(xué)成分地理變異的重要因素[6]。

本研究以米槁發(fā)育成熟過(guò)程中3個(gè)關(guān)鍵時(shí)期根際土壤微生物動(dòng)態(tài)變化為切入點(diǎn)，探討根際微生物群落變化對(duì)米槁果實(shí)品質(zhì)形成的影響，為后期米槁果實(shí)化學(xué)成分的微生物調(diào)控提供策略參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇米槁分布典型區(qū)域，即貴州省黔東南州紅水河一帶，在 3 個(gè)野生居群羅甸 (E 106°35′44″, N 25°17′20″)、壩碰 (E 106°3′52″, N 25°7′16″)、祥樂(lè) (E 106°5′46″, N 25°10′32″)中隨機(jī)選擇 5 棵胸徑 32～38 cm左右的無(wú)病害掛果米槁植株并逐一標(biāo)記，分別在2019年6月(幼果期)、8月(近成熟期)、10月(成熟期) 3個(gè)果期收集每個(gè)居群標(biāo)記的植株根際土壤混勻；采樣時(shí)先去除林下表層腐殖質(zhì)和土壤，然后沿著米槁基部使用無(wú)菌鏟垂直挖取80 cm的剖面以獲取健康的細(xì)根，用抖落法將附著在根系2 mm左右的土壤抖入滅菌塑料袋中，迅速置于冰盒中保存并帶回實(shí)驗(yàn)室[15]。然后將采集的土壤樣品分成兩份，一份置于室溫環(huán)境條件下(25℃)風(fēng)干后用于化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定，一份置于–80℃超低溫冰箱中保存，用于根際土壤微生物基因組提?。还麑?shí)樣本收集與土壤樣本逐一對(duì)應(yīng)，冷凍干燥后粉碎過(guò)0.25 mm篩備用。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 土壤養(yǎng)分測(cè)定 土壤養(yǎng)分與pH測(cè)定參照《土壤農(nóng)化分析》第三版[15]進(jìn)行，其中pH使用水浸提-電位法測(cè)定，堿解氮使用半微量凱氏法，有效磷使用鉬銻抗比色法，速效鉀使用火焰光度法，有機(jī)質(zhì)使用重鉻酸鉀容量法測(cè)定。酸性磷酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶使用試劑盒方法測(cè)定，方法與結(jié)果計(jì)算參照試劑公司方案(北京索萊寶生物科學(xué)技術(shù)有限公司)。所有樣本重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.2 根際微生物組成測(cè)定 用FastDNA?SPINKit for Soil試劑盒(美國(guó)Mpbio公司)提取真菌和細(xì)菌基因組DNA，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用1%瓊脂糖凝膠 (5 V/cm, 20 min) 電泳檢測(cè)質(zhì)量，用 UV-1700紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度；真菌引物序列為：正向序列ITS1F (CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA)，反向序列 ITS2R (GCTGCGTTCTTCAT CGATGC)。細(xì)菌引物序列為：正向序列338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)，反向序列806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。PCR擴(kuò)增采用TaKaRa rTaq DNA Polymerase，20 μL 反應(yīng)體系：10 ×Buffer (2 μL)，2.5 mmol/L dNTPs (2 μL)，5 μmol/L Forward Primer (0.8 μL)，5 μmol/LReverse Primer(0.8 μL)，r-Taq Polymerase (0.2 μL)，牛血清白蛋白BSA (0.2 μL)，Template DNA (10 ng)，補(bǔ) ddH2O 至20 μL。PCR 擴(kuò)增參數(shù)：1 × (95℃ 3 min), 5 個(gè)循環(huán) ×(95℃ 30s; 55℃ 30s; 72℃ 45s)，72℃10 min，最后10℃ 直至停止 (PCR 儀：ABI GeneAmp? 9700 型)。PCR產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司代為測(cè)序 (Illumina Hiseq 平臺(tái)高通量)。

1.2.3 果實(shí)成分測(cè)定 粗脂肪與糖類參照劉剛等[16]的研究方法，檜烯、α-松油醇參照課題組前期建立的方法[16]。所有樣本重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

微生物組成分析流程：1）使用 Trimmomatic軟件，對(duì)raw data低質(zhì)量序列首先采用滑動(dòng)窗口法掃描，當(dāng)質(zhì)量低于20時(shí)，切掉堿基質(zhì)量平均值低于閾值的滑窗，并去除長(zhǎng)度小于50 bp的序列；2）使用Flash軟件，將上一步合格的雙端raw data拼接，序列拼接時(shí)最大overlap為200 bp，得到完整paired end序列；3）使用QIIME中的split_librarie去除paired end序列中含有N堿基的序列，去除單堿基重復(fù)大于8的序列，去除長(zhǎng)度小于200 bp的序列，得到clean tags 序列；4）使用UCHIME軟件去除clean tags中的嵌合體，最終得到用于后面OTU劃分(≥97%劃為同一個(gè)OTU)的valid tags。最后利用I-Sanger生物信息分析云(http://www.i-sanger.com/)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和生物多樣性分析；土壤與果實(shí)數(shù)據(jù)用WPS表格整理，IBM SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，多均值比較采用Turkey，P< 0.05 時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 米槁根際土壤化學(xué)特征與果實(shí)化學(xué)成分變化

表1表明，在米槁幼果期、近成熟期、成熟期所采集3個(gè)區(qū)域的根際土壤樣品，其化學(xué)性質(zhì)變化如下：pH在壩碰和羅甸幼果期最低、成熟期最高，在祥樂(lè)則是以近成熟期最高。堿解氮含量在壩碰和羅甸幼果期顯著高于近成熟期、成熟期，在祥樂(lè)則表現(xiàn)為幼果期高于近成熟期、成熟期。速效鉀含量壩碰和羅甸在幼果期顯著高于近成熟期、成熟期，祥樂(lè)則是近成熟期最高。有效磷含量在3個(gè)區(qū)域均呈現(xiàn)幼果期<近成熟期<成熟期，且同一區(qū)域不同果期均存在顯著差異。有機(jī)質(zhì)在壩碰和羅甸均以幼果期時(shí)含量最高而近成熟期時(shí)含量最低，祥樂(lè)則是近成熟期含量最高，但同一區(qū)域不同果期間均無(wú)顯著差異；脲酶(S-UE)活性在壩碰呈現(xiàn)出幼果期>成熟期>近成熟期，羅甸表現(xiàn)為近成熟期>成熟期>幼果期，祥樂(lè)表現(xiàn)為成熟期>近成熟期>幼果期，但壩碰和祥樂(lè)不同果期不存在顯著差異，羅甸幼果期顯著低于近成熟期和成熟期。酸性磷酸酶(S-ACP)在3個(gè)區(qū)域均表現(xiàn)為幼果期>成熟期>近成熟期，并且幼果期顯著高于近成熟期、成熟期。過(guò)氧化氫酶(S-CAT)在壩碰呈現(xiàn)出幼果期>成熟期>近成熟期，羅甸呈現(xiàn)出成熟期>幼果期>近成熟期，祥樂(lè)表現(xiàn)為成熟期>近成熟期>幼果期，壩碰和羅甸不同果期存在顯著差異，祥樂(lè)則是成熟期顯著高于近成熟期、幼果期。

表1 根際土壤化學(xué)特征Table 1 The chemical characteristics of rhizosphere soil

表2顯示，α-松油醇在壩碰以近成熟期含量最高，成熟期次之，幼果期最低，并且不同果期間均存在顯著差異。而羅甸和祥樂(lè)均隨著果實(shí)發(fā)育成熟含量逐步降低；檜烯在壩碰以幼果期含量最高，成熟期次之。而羅甸和祥樂(lè)則是隨著米槁果實(shí)發(fā)育成熟含量逐步上升，并且成熟期顯著高于幼果期；在糖類成分中總糖在3個(gè)區(qū)域均以近成熟期含量最高，并且均顯著高于幼果期。還原糖在壩碰和羅甸同樣以近成熟期含量最高，祥樂(lè)則以成熟期含量最高。可溶性多糖含量在3個(gè)區(qū)域均以成熟期含量最高，幼果期次之。粗多糖在壩碰和羅甸則以成熟期含量最高、幼果期次之，而祥樂(lè)則以幼果期含量最高、成熟期次之。粗脂肪在3區(qū)域均隨著米槁果實(shí)發(fā)育成熟不斷積累升高，呈現(xiàn)出幼果期<近成熟期<成熟期，并且同一區(qū)域不同果期間均存在顯著差異。

表2 米槁果實(shí)化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化Table 2 Chemical component content of C. migao fruit at different fruit stages

2.2 樣品測(cè)序結(jié)果及測(cè)序深度

利用高通量測(cè)序?qū)?個(gè)產(chǎn)地不同果期的9個(gè)樣本rDNA ITS和 16S rDNA區(qū)全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序，獲得真菌原始序列1740016條，有效優(yōu)質(zhì)序列870008條，按照相似性≥97%分類標(biāo)準(zhǔn)將其分為3026個(gè)OTU。獲得細(xì)菌原始序列1137478條，有效優(yōu)質(zhì)序列568739條，按照相似性≥97%分類標(biāo)準(zhǔn)將其分為4971個(gè)OTU(表3)。3個(gè)產(chǎn)地的9個(gè)樣本按照6月(幼果期)、8月(近成熟期)、10月(成熟期)進(jìn)行次序分析；真菌樣本中：壩碰3個(gè)時(shí)期樣本OTU介于340～374，羅甸3個(gè)時(shí)期樣本OTU介于592～797，祥樂(lè)3個(gè)時(shí)期樣本OTU介于495～790。9個(gè)真菌樣本的稀釋曲線隨著抽提數(shù)據(jù)量的增多(圖1A)，逐步趨于平穩(wěn)狀態(tài)，表明數(shù)據(jù)較為合理，且各樣本覆蓋度均達(dá)0.98以上，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果已包含大部分真菌物種能夠進(jìn)行后續(xù)分析；細(xì)菌樣本中：壩碰3個(gè)時(shí)期樣本OTU介于1623～2436，羅甸3個(gè)時(shí)期樣本OTU介于1734～2356，祥樂(lè)3個(gè)時(shí)期樣本的OTU介于1528～2388。同樣9個(gè)細(xì)菌樣本的稀釋曲線隨著抽提數(shù)據(jù)量的增多逐步趨于平穩(wěn)狀態(tài)(圖1B)，表明數(shù)據(jù)較為合理，且各樣本覆蓋度均達(dá)0.98以上，說(shuō)明細(xì)菌測(cè)序結(jié)果也包含大部分細(xì)菌物種能夠進(jìn)行后續(xù)分析。

表3 根際土壤樣本序列統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Table 3 Sequencing data statistics of 9 samples

圖1 米槁根際土壤OTU(≥97%)稀釋曲線(A、B)與韋恩圖(C、D、E、F)Fig. 1 OTU rarefaction curves (A, B) and Venn diagram (C, D, E, F) from rhizosphere soil of C. migao

3個(gè)居群中9個(gè)真菌樣本測(cè)序所得3815 OTU中，在3個(gè)居群(圖1C)中均存在的OTU數(shù)為178個(gè)，超過(guò)72.6 %的OTU (2197)僅在單個(gè)居群中有發(fā)現(xiàn)，其中LD居群OTU最為豐富；以不同果期作為觀測(cè)組來(lái)看 (圖1D)，在 3個(gè)時(shí)期中均存在的OTU數(shù)有437個(gè)，超過(guò)59.2% OTU (1700)僅在單個(gè)時(shí)期有分布；3個(gè)居群中9個(gè)細(xì)菌樣本測(cè)序所得9897 OTU中，僅有23.47 %在單個(gè)居群中有發(fā)現(xiàn)(圖1E)，3個(gè)居群中共有的OTU數(shù)僅1618個(gè)；以不同果期作為觀測(cè)組來(lái)看(圖1F)，在3個(gè)時(shí)期中均存在的OTU為2454個(gè)，達(dá)49.3 %，而僅有1007個(gè)OTU在單個(gè)時(shí)期分布。

2.3 微生物 Alpha 多樣性

真菌多樣性中香農(nóng)多樣性指數(shù)在壩碰表現(xiàn)為先降后升的趨勢(shì)，且在10月中旬最高，羅甸則表現(xiàn)表為逐步上升趨勢(shì)，在10月成熟期達(dá)到最高，祥樂(lè)則表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，在8月近成熟期達(dá)到最高。辛普森指數(shù)在壩碰表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，在羅甸則表現(xiàn)為逐步降低，在祥樂(lè)則表現(xiàn)為先降后升且在10月成熟期達(dá)到最高；細(xì)菌中香農(nóng)指數(shù)在壩碰表現(xiàn)為先降后升的趨勢(shì)，且在10月成熟期最高，在羅甸則表現(xiàn)為逐步上升趨勢(shì)，在10月成熟期達(dá)到最高，在祥樂(lè)則表現(xiàn)為逐步降低的趨勢(shì)。辛普森指數(shù)在壩碰表現(xiàn)為逐步降低的趨勢(shì)，在羅甸以及祥樂(lè)則表現(xiàn)為先升后降趨勢(shì)且在8月近成熟期最高(表3)。

2.4 根際微生物組成及分布特征

所有真菌樣本(圖2A)的3026個(gè)OTU隸屬于14門，42綱，105目，250科，485屬，從屬水平上來(lái)看3個(gè)產(chǎn)地真菌群落組成(除去未鑒定和相對(duì)豐度小于0.01類群)，在壩碰、羅甸以子囊菌門(Ascomycota)一未鑒定屬豐度最高；其次為被孢霉屬(Mortierella)，祥樂(lè)以雙歧桿菌科(Didymellaceae)一未鑒定屬豐度最高；其次為Saitozyma屬(圖2A)。以不同時(shí)期為觀測(cè)角度來(lái)看，3個(gè)果期采樣在屬水平真菌組成情況如下：根際真菌中幼果期Saitozyma被孢霉屬(Mortierella)較高，近成熟期以靈芝屬(Ganoderma)、小杯傘屬(Clitolybula)較高，成熟期以被孢霉屬(Mortierella)、Saitozyma較高(圖2B)。9個(gè)細(xì)菌樣本的4971個(gè)OTU隸屬于32門，91綱，244目，399科，711屬，從屬水平上來(lái)看(圖2C)3個(gè)產(chǎn)地細(xì)菌群落組成(除去未鑒定和相對(duì)豐度小于0.01類群)，壩碰以芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)一未鑒定屬最為豐富，其次為芽孢桿菌屬(Bacillus)。羅甸以節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)豐度最高，其次為鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)。祥樂(lè)以芽孢桿菌屬(Bacillus)最為豐富，其次為嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)。不同時(shí)期觀測(cè)角度來(lái)看3個(gè)果期采樣在屬水平細(xì)菌組成情況如下：根際細(xì)菌中幼果期以鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)較高，近成熟期以節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)較高，成熟期以節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、不動(dòng)桿菌屬 (Acidibacter)較高 (圖2D)。

圖2 米槁根際微生物分布Fig. 2 Distribution of rhizosphere microbe of C. migao

為了更好地反映不同果期樣本間的區(qū)別與聯(lián)系，對(duì)樣本進(jìn)行了主坐標(biāo)分析(PcoA)和非度量多維尺度分析(NMDS)，結(jié)果如圖3所示。PcoA分析顯示，真菌無(wú)論是以不同果期還是以居群為觀測(cè)組其相似性均較差，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯樣本內(nèi)相似性。細(xì)菌則在居群水平上具有較好相似性，可以看到壩碰(BP-2、BP-3)、祥樂(lè) (XL-2、XL-3)、羅甸 (LD-2、LD-3)的其中兩個(gè)樣本均較為相近。NMDS分析顯示，大多數(shù)樣本中真菌和細(xì)菌在不同果期和居群水平均未展示出較近的距離(僅細(xì)菌中羅甸的兩個(gè)樣本LD-1、LD-3距離較近)，說(shuō)明在NMDS分析中樣本間的相似性較差。

圖3 樣本PCA (A、B)與NMDS (C、D)分析Fig. 3 PCA (A, B) and NMDS (C, D) analysis of samples

基于系統(tǒng)發(fā)育層次聚類分析法對(duì)9個(gè)樣品根際微生物相似性進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建根際真菌和細(xì)菌的聚類熱圖。根際土壤真菌屬水平的聚類熱圖中(圖4A)，紅黃藍(lán)色代表菌群的相對(duì)豐度，顏色越紅則代表其相對(duì)豐度越高。從樣本的聚類結(jié)果來(lái)看，BP-1、LD-2先聚為一支，然后再與LD-3聚為一支。LD-1、XL-3先聚為一支，最后再與BP-2、XL-2聚為一支。BP-3、XL-1則單獨(dú)聚為一支。根際土壤細(xì)菌屬水平的聚類熱圖中(圖4B)，紅黃藍(lán)色代表菌群的相對(duì)豐度，顏色越紅則代表其相對(duì)豐度越高。從樣本的聚類結(jié)果來(lái)看，根際細(xì)菌明顯聚為兩大類，其中BP-2、BP-3先聚為一支，再與XL-2、XL-3聚為一支。另一支則是LD-3、XL-1先聚為一支，再與LD-2聚為一支，最后再與BP-1、LD-1聚為一支。從不同居群和不同果期角度觀察聚類結(jié)果，雖然細(xì)菌樣本聚類結(jié)果較真菌聚類結(jié)果規(guī)律性好，但實(shí)際無(wú)論在同一居群還是同一時(shí)期樣本均沒(méi)有表現(xiàn)出聚類上的明顯靠近，說(shuō)明在不同居群、不同時(shí)期樣本均具有明顯差異性。對(duì)于上述現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，應(yīng)當(dāng)結(jié)合根際微環(huán)境化學(xué)性質(zhì)進(jìn)一步分析，而上述微生物組成的差異性在藥材品質(zhì)形成過(guò)程中扮演何種角色更是值得進(jìn)一步研究。

圖4 聚類熱圖Fig. 4 Microbe from rhizosphere soil of C. migao heat map clustering

2.5 微生物與土壤、果實(shí)化學(xué)成分的關(guān)系

微生物與土壤化學(xué)性質(zhì)的RAD分析結(jié)果表明：脲酶(S-UE)對(duì)真菌組成影響最大，與Saitozyma屬、子囊菌門(Ascomycota)一未鑒定屬、真菌界一未鑒定屬呈正相關(guān)，與孢霉屬(Mortierella)負(fù)相關(guān)。其次為過(guò)氧化氫酶(S-CAT)，與真菌界(未鑒定屬)、蕉孢殼科(Diatrypaceae,未鑒定屬)、Saitozyma屬、子囊菌門(Ascomycota, 未鑒定屬)呈負(fù)相關(guān)(圖5A)土壤化學(xué)性質(zhì)與豐度前5的細(xì)菌相關(guān)性排序中(圖5B)：同樣受脲酶(S-UE)影響最大，與Athrobacter屬呈負(fù)相關(guān)，與Gommatimonadaceae科(未鑒定屬)、桿菌屬(Bacillus)呈正相關(guān)。其次為速效磷(AP)，與Gommatimonadaceae科(未鑒定屬)呈正相關(guān)，與桿菌屬(Bacillus)、Athrobacter屬呈負(fù)相關(guān)。

圖5 米槁根際土壤微生物群落與土壤化學(xué)性質(zhì)(A、B)和果實(shí)化學(xué)成分(C、D)的RDA關(guān)系Fig. 5 Redundancy (RDA) for microorganism community diversity and physicochemical properties of rhizosphere soil samples and fruit components of C. migao

微生物與米槁果實(shí)成分的RAD分析結(jié)果表明：真菌中(圖5C)一未鑒定物種對(duì)米槁果實(shí)成分積累影響最大，對(duì)檜烯、總糖積累有促進(jìn)作用，但對(duì)α-松油醇、粗脂肪、還原糖積累可能起抑制作用。其次為Didymellaceae科一未鑒定屬，能促進(jìn)α-松油醇、檜烯、可溶性多糖、粗多糖積累，但對(duì)粗脂肪、還原糖、總糖積累可能存在抑制作用。細(xì)菌中(圖5D)桿菌屬(Bacillus)對(duì)米槁果實(shí)成分積累影響最大，但可能對(duì)粗脂肪、總糖、α-松油醇、粗多糖、可溶性多糖、還原糖積累有抑制作用。其次為芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)一未鑒定屬，對(duì)粗脂肪、粗多糖、可溶性多糖、還原糖、檜烯有促進(jìn)作用，但對(duì)α-松油醇和總糖積累可能存在抑制作用。

3 討論

3.1 不同果期米槁果實(shí)化學(xué)成分積累特征

糖類、粗脂肪及揮發(fā)油是米槁果實(shí)中主要的化學(xué)組分，在米槁果實(shí)發(fā)育和藥材品質(zhì)形成過(guò)程中十分重要，其中糖類和粗脂肪含量是大多數(shù)果實(shí)中重要營(yíng)養(yǎng)和能量?jī)?chǔ)存物質(zhì)。米槁果實(shí)中糖類在成熟時(shí)期除總糖含量低于近成熟期外，還原糖、可溶性多糖、粗多糖都在成熟時(shí)期含量最高，這與獼猴桃(Actinidia chinensis)、越橘 (Vaccinium vitis-idaea)糖類含量的變化趨勢(shì)相似[17–18]；粗脂肪含量隨著果實(shí)成熟逐步升高，這與油茶(Camellia oleifera)、平歐雜種榛 (Corylus heterophylla×Corylus.avellana)等大多數(shù)油料植物果實(shí)中粗脂肪積累過(guò)程相似[19–20]。糖類和粗脂肪含量的變化說(shuō)明在米槁果實(shí)發(fā)育成熟的過(guò)程中發(fā)生物質(zhì)儲(chǔ)存形式的轉(zhuǎn)換，在米槁果實(shí)成熟時(shí)以粗脂肪為其主要儲(chǔ)能物質(zhì)。而米槁果實(shí)揮發(fā)油中的主要成分α-松油醇隨著果實(shí)生長(zhǎng)到成熟階段總體含量呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，這與果實(shí)類中藥枳實(shí)中α-松油醇的積累過(guò)程[21]一致；而檜烯呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢(shì)，與米槁同科植物山蒼子(Litsea cubeba)果實(shí)中月桂烯積累過(guò)程[22]相似?？梢?jiàn)揮發(fā)油中相關(guān)成分積累在芳香植物中具有相似的趨勢(shì)，作為米槁果實(shí)中的重要活性組分，米槁果實(shí)發(fā)育過(guò)程中揮發(fā)油的含量變化值得進(jìn)一步研究。

3.2 不同果期米槁根際微生物群落變化的影響因素

米槁3個(gè)居群不同果實(shí)發(fā)育階段根際微生物OTU總數(shù)和優(yōu)勢(shì)菌屬具有較大的差異，在黃芪(Astragalus membranaceusvar.mongholicus)、地黃(Rehmannia glutinosa)不同物候階段的根際微生物變化中也觀察到類似的變化，這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能在于植物活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生根系分泌物導(dǎo)致土壤理化環(huán)境變化，而RDA分析結(jié)果也證實(shí)了土壤酶活性和氮、磷、鉀等養(yǎng)分含量影響了米槁根際微生物的組成[23–24]。此外，有些微生物類群在不同季節(jié)其豐度會(huì)存在穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)變化，其背后影響因素除了物種本身的生活史特性和土壤理化性質(zhì)外，最大驅(qū)動(dòng)力便是季節(jié)變化導(dǎo)致土壤溫度和濕度的變化[25]。雖然不同果期(季節(jié))米槁根際微生物群落組成變化較大，但豐度較高的Mortierella、Saitozyma、Fusarium并未呈現(xiàn)出明顯變化規(guī)律，反而與S-UE、有效磷之間關(guān)系密切。有研究指出是因?yàn)橥寥啦≡c宿主之間的負(fù)反饋調(diào)節(jié)不受非生物環(huán)境條件(溫度和土壤濕度)的影響[26]，而不同果期米槁根際土壤病原菌類群中Mortierella、Saitozyma、Fusarium均具有植物致病特點(diǎn)[27–28]，一定程度上解釋了不同果期根際微生物的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化不規(guī)律的原因。

3.3 根際微生物對(duì)米槁果實(shí)化學(xué)成分積累的影響

在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中根際微生物的重要性已在大量生產(chǎn)實(shí)踐中被證實(shí)[29]，例如根際中厚壁菌等類群在蒙古黃芪 (Astragalus membranaceusvar.mongholicus)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中顯著影響其有效成分毛蕊異黃酮的積累，同樣在玉米(Zea mays)生長(zhǎng)成熟過(guò)程中桿菌屬(Bacillus)能夠有效促進(jìn)其植株生長(zhǎng)[30–31]。本研究結(jié)果表明，在不同果期米槁根際微生物中Saitozyma、被孢霉屬(Mortierella)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、桿菌屬(Bacillus)等類群與果實(shí)化學(xué)成分積累有著密切聯(lián)系。然而不同產(chǎn)地米槁果實(shí)成熟時(shí)期則是傘菌屬(Agaricus)、鐮孢菌屬(Fusarium)與米槁果實(shí)化學(xué)成分積累呈顯著相關(guān)，說(shuō)明在米槁果實(shí)發(fā)育過(guò)程中化學(xué)成分積累和不同產(chǎn)地果實(shí)化學(xué)成分差異是由不同微生物主導(dǎo)所致[32]。與米槁果實(shí)成分積累關(guān)系密切的類群中，Saitozyma屬于酵母菌，雖然在土壤中廣泛存在，但目前關(guān)于其對(duì)植物生長(zhǎng)的影響的認(rèn)識(shí)仍十分缺乏[33]。被孢霉屬(Mortierella)已被證實(shí)對(duì)植物脂肪酸類和揮發(fā)油的積累具有明顯促進(jìn)效應(yīng)，而米槁果實(shí)中揮發(fā)油和脂肪便是其化學(xué)成分的重要組成部分(α-松油醇、檜烯、粗脂肪)，被孢霉屬(Mortierella)與米槁果實(shí)中α-松油醇、檜烯、粗脂肪的關(guān)系[34]也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)已被認(rèn)知是植物生長(zhǎng)促進(jìn)根際菌，能夠促進(jìn)植物體內(nèi)糖類的積累，RDA分析也證實(shí)了其對(duì)米槁果實(shí)中糖類具有明顯促進(jìn)作用[32]。而桿菌屬(Bacillus)具有較強(qiáng)的解磷、解鉀能力，并且是重要的生防菌，可產(chǎn)生抗菌化合物，這對(duì)于米槁這種大喬木在生活過(guò)程中維持個(gè)體健康和生產(chǎn)力及果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程營(yíng)養(yǎng)供給十分重要[35]。另外RDA分析也表明，堿解氮、酸性磷酸酶、速效磷對(duì)米槁果實(shí)糖類與粗脂肪積累同樣有著不可忽視的影響，目前在某些經(jīng)濟(jì)作物大田試驗(yàn)[36]中已觀察到這種現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明，米槁果實(shí)發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分積累與部分根際微生物類群和土壤化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)，但其具體機(jī)理尚需進(jìn)一步通過(guò)田間試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

米槁根際微生物群落在幼果期、近成熟期和成熟期多樣性有明顯差異，不同果期米槁根際微生物均以子囊菌門(Ascomycota，未鑒定屬)，Saitozyma、被孢霉屬(Mortierella)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)等類群對(duì)果實(shí)化學(xué)成分積累具有明顯促進(jìn)作用。其中品質(zhì)最佳的羅甸居群受子囊菌門(Ascomycota，未鑒定屬)影響最大，壩碰、祥樂(lè)居群則受被孢霉屬(Mortierella)影響最大，這有別于不同產(chǎn)地根際真菌中傘菌屬(Agaricus)、鐮孢菌屬(Fusarium)、瓶霉屬(Phialophora)對(duì)米槁果實(shí)松油醇、檜烯積累影響最大的結(jié)論。說(shuō)明在米槁果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程中不同產(chǎn)地土壤微生物對(duì)米槁果實(shí)品質(zhì)影響的主導(dǎo)類群不一致，而在不同果期微生物群落結(jié)構(gòu)變化又主要受到土壤脲酶(SUE)活性的影響。