陳 剛， 鄭澤宇

（1.福建省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建 福州 350001；2.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350100）

自從40多年前科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了RNA印跡法（northern blotting），單細(xì)胞表型研究就成為了生物學(xué)家的夢(mèng)想。以往研究中需要百萬(wàn)計(jì)的細(xì)胞才能獲取足量的RNA來(lái)檢測(cè)單個(gè)基因mRNA水平，而現(xiàn)在通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq），可以輕松確定單個(gè)細(xì)胞中各基因的表達(dá)水平。如今，scRNA-seq也為胰島細(xì)胞生物學(xué)研究提供了極大便利。過(guò)去3年間已有一系列關(guān)于小鼠和人類胰島scRNA-seq分析的文獻(xiàn)資料相繼發(fā)表。scRNA-seq分析能夠幫助人們了解已知細(xì)胞特征，并發(fā)現(xiàn)已知不同內(nèi)分泌細(xì)胞（如產(chǎn)生胰高血糖素的α細(xì)胞和產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞）之間的異質(zhì)性，從而使細(xì)胞亞型分類更科學(xué)。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析研究進(jìn)展

新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用給生物學(xué)研究帶來(lái)了極大的便利和突破，而傳統(tǒng)的批量測(cè)序（Bulk RNA-seq）作為其中的突出代表，在科學(xué)研究中發(fā)揮著極大的作用。盡管從一群細(xì)胞中獲得全基因組范圍的RNA表達(dá)量在生物學(xué)機(jī)制研究中十分有利，但是這種方法只能獲得所有細(xì)胞基因表達(dá)的平均水平，無(wú)法體現(xiàn)細(xì)胞的異質(zhì)性。單細(xì)胞測(cè)序是在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)，其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞中微量mRNA通過(guò)高效擴(kuò)增后再進(jìn)行高通量測(cè)序。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠有效解決組織樣本細(xì)胞異質(zhì)性以及常規(guī)RNA-seq被掩蓋的細(xì)胞群內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性難題，有助于發(fā)現(xiàn)新的稀有細(xì)胞類型，并深入了解細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

隨著技術(shù)的發(fā)展，如今科學(xué)家們可以用多種方法進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。從通量方面，可將現(xiàn)有的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)分為三類：①一次檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞，如RNA轉(zhuǎn)錄5’末端轉(zhuǎn)換機(jī)制2（switching mechanism at 5’end of RNA template 2，SMART-seq2）；②一次檢測(cè)100個(gè)左右的細(xì)胞，如Fludigm C1；③一次檢測(cè)上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，如基于分割池連接的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（split pool ligation-based tranome sequencing,SPLiTseq）、10×Genomics等。在選擇使用哪種測(cè)序技術(shù)用于特定研究之前，需要重點(diǎn)考慮的是該研究的實(shí)驗(yàn)規(guī)模、每種方法的成本和靈敏度以及要回答的生物學(xué)問(wèn)題。基于液滴的微流控體系可以在一次實(shí)驗(yàn)中對(duì)數(shù)千個(gè)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)分析[1-2]。該方法非常適用于發(fā)現(xiàn)稀有細(xì)胞類型或篩選具有高度異質(zhì)性的細(xì)胞群體。然而，這些技術(shù)降低了每個(gè)細(xì)胞的靈敏度，可能無(wú)法識(shí)別細(xì)胞之間微妙的轉(zhuǎn)錄差異。基于微流控芯片的測(cè)序方法如Fluidigm C1，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行深度剖析，但實(shí)驗(yàn)成本會(huì)大幅增加[3]，更適用于研究單細(xì)胞之間的隨機(jī)變異性，或發(fā)現(xiàn)“同質(zhì)”細(xì)胞群中微妙的轉(zhuǎn)錄差異?；?0×Genomics最新Chromium系統(tǒng)利用油包水的微反應(yīng)體系，通過(guò)序列標(biāo)簽（cell barcode）區(qū)別群體中不同細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄本，能夠獲得單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜，實(shí)現(xiàn)數(shù)千甚至上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞群體的分析，10×Genomics的Chromium系統(tǒng)利用8通道的微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)，將含有標(biāo)簽的凝膠珠、細(xì)胞和酶的混合物、油三者混合，形成油包水的微反應(yīng)體系（gel bead in emulsion，GEM）。GEM形成后，細(xì)胞裂解，凝膠珠自動(dòng)溶解釋放出大量的標(biāo)簽序列，隨后mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有10×barcode的互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），構(gòu)建出精準(zhǔn)的測(cè)序文庫(kù)。通過(guò)上述方法，可解決常規(guī)RNA-seq方法在通量、擴(kuò)展性、準(zhǔn)確性、效率性方面存在的不足。

β細(xì)胞異質(zhì)性研究進(jìn)展

細(xì)胞異質(zhì)性是生物組織的普遍特征，常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)需要上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，所測(cè)的結(jié)果為細(xì)胞基因表達(dá)的平均值，較難鑒別細(xì)胞之間的異質(zhì)性。scRNA-seq技術(shù)的分辨率能夠精確至單個(gè)細(xì)胞，為辨別異質(zhì)性群體中各類型的轉(zhuǎn)錄組提供有力的證據(jù)。β細(xì)胞是胰島中最豐富的內(nèi)分泌細(xì)胞[4]。Li等[5]通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選儀 （fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS）分離并通過(guò)SMART-seq2處理了64種人胰腺細(xì)胞，并采用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定出12個(gè)β細(xì)胞亞型。以上64種人胰腺細(xì)胞在DLK1（delta drosophila homolog-like 1）基因轉(zhuǎn)錄組中存在異質(zhì)性。Wang等[6]應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量胰島β細(xì)胞中主要的胰島激素、增殖標(biāo)志物，并在單細(xì)胞分辨率下計(jì)數(shù)參與增殖的信號(hào)通路數(shù)量，借此對(duì)β細(xì)胞分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)個(gè)體內(nèi)有3個(gè)主要的β細(xì)胞簇，而增殖的β細(xì)胞僅屬于其中2個(gè)簇。

當(dāng)研究者在設(shè)計(jì)和進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)時(shí)，往往會(huì)在被檢查的細(xì)胞數(shù)量、每個(gè)細(xì)胞的測(cè)序深度和實(shí)驗(yàn)成本之間權(quán)衡。需要大量細(xì)胞和深入的測(cè)序來(lái)充分識(shí)別并準(zhǔn)確描述罕見(jiàn)的β細(xì)胞亞群。Li等[5]首次在人類胰島上進(jìn)行scRNA-seg研究。研究只篩選了70個(gè)細(xì)胞，驗(yàn)證了之前在單細(xì)胞水平上所描述的標(biāo)記基因，并確定了在所有類型胰島細(xì)胞中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。雖然本次研究發(fā)現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性提供了早期證據(jù)，但由于所捕獲的細(xì)胞數(shù)量太少，無(wú)法透徹描述不同細(xì)胞類型中的亞群差異。之后越來(lái)越多的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表了關(guān)于2型糖尿病胰島細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)結(jié)果。Xin等[7]確定了約250個(gè)在2型糖尿病中具有差異表達(dá)的基因，其中92%的基因與胰島細(xì)胞功能或生長(zhǎng)無(wú)關(guān)。Muraro等[8]報(bào)道，決定β細(xì)胞異質(zhì)性的主要基因是硫氧還蛋白（sulfiredoxin，SRXN1）、泛素結(jié)合蛋白核自噬受體（sequestosome 1，SQSTM1）和3個(gè)鐵蛋白亞基鐵蛋白重鏈1鐵蛋白重鏈 （ferritin heavy chain 1，F(xiàn)TH1）假基因3（ferritin heavy chain 1 pseudogene 3，F(xiàn)TH1P3）、FTH1和 鐵 蛋 白 輕 鏈 （ferritin light chain，F(xiàn)TL）都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）和氧化應(yīng)激有關(guān)[9]。Baron等[10]和Segerstolpe等[11]發(fā)現(xiàn)，某些基因的表達(dá)變化與β細(xì)胞功能[如尿皮質(zhì)素3（urocortin 3，UCN3）]和ER應(yīng)激同型半胱氨酸誘導(dǎo)ER應(yīng)激誘導(dǎo)的泛素樣結(jié)構(gòu)域1蛋白（homocysteine inducible ER protein with ubiquitin like domain 1,HERPUD1）、熱休克蛋白A5（heat shock protein A5，HSPA5）和DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（DNA damage-inducible transcript 3，DDIT3）相關(guān)。有趣的是，由于機(jī)體對(duì)胰島素分泌的高需求，從而加強(qiáng)了β細(xì)胞ER應(yīng)激，最終使得人和鼠的β細(xì)胞更有增殖的可能[12-13]。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了人類導(dǎo)管細(xì)胞群體中的亞結(jié)構(gòu)；已知導(dǎo)管細(xì)胞有2種形態(tài)，一種形成末端導(dǎo)管，另一種與腺泡（中心腺泡細(xì)胞）相連。通過(guò)免疫染色，證明了與轉(zhuǎn)錄組分析相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞類型之間的空間分離關(guān)系。

本團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了20月齡與3周齡C57BL/6小鼠胰島β細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序，同樣發(fā)現(xiàn)了β細(xì)胞的異質(zhì)性。在20月齡的老年小鼠與3周齡的年輕小鼠胰島β細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)具有較低胰島素表達(dá)量的β樣細(xì)胞。并且發(fā)現(xiàn)老年鼠β細(xì)胞具有較強(qiáng)的線粒體活性，且脂質(zhì)代謝功能減退，推測(cè)隨著年齡增長(zhǎng)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生增多，自身抗氧化機(jī)制的失衡和脂質(zhì)的堆積將導(dǎo)致β細(xì)胞受氧化應(yīng)激、脂毒性和ER應(yīng)激的影響[14]。

基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的β細(xì)胞內(nèi)源性再生研究

內(nèi)源性再生療法的目的是刺激有潛力的細(xì)胞亞群分化，從而起到補(bǔ)償喪失功能的β細(xì)胞群的作用。其中去分化的β細(xì)胞能夠在疾病狀態(tài)下存活很長(zhǎng)時(shí)間，引起了研究人員的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，在1型糖尿病患者中，少量有功能的β細(xì)胞可以保留多年并逃脫免疫攻擊[13]。同樣，在2型糖尿病患者中，并不是所有β細(xì)胞均死亡。其中小部分β細(xì)胞倒退到更不成熟的狀態(tài)，形成1個(gè)前體細(xì)胞池，具有重新分化的潛力[15]。此外，在疾病早期，仍有功能正常的β細(xì)胞可通過(guò)誘導(dǎo)使其增殖，導(dǎo)致細(xì)胞存活、死亡或增殖的分子機(jī)制差異仍然難以琢磨。因此，為了直接針對(duì)特定的β細(xì)胞亞群并觸發(fā)其增殖和（或）功能成熟，破譯β細(xì)胞的異質(zhì)性并確定其潛在的分子機(jī)制至關(guān)重要。

一、觸發(fā)β細(xì)胞增殖

胰島具有能夠迅速適應(yīng)環(huán)境變化的功能靈活性，可通過(guò)β細(xì)胞的大量擴(kuò)增和胰島素分泌的增強(qiáng)而迅速適應(yīng)環(huán)境的變化。因此可以利用自然增殖來(lái)增加疾病狀態(tài)下的β細(xì)胞數(shù)量。β細(xì)胞增殖高峰在出生后早期，在此期間β細(xì)胞質(zhì)量被確定。Wang等[6]和Qiu等[16]的研究結(jié)果顯示，根據(jù)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，小鼠出生后第3天有25%的β細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。然而，從第9天開(kāi)始，增殖迅速下降，成年后β細(xì)胞更新率很小且穩(wěn)定（在小鼠中低于1%）。了解促使出生后早期β細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，促進(jìn)成熟后β細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其細(xì)胞周期停滯，可能是糖尿病治療的新方向。最近的2項(xiàng)scRNA-seq研究旨在重建胰腺β細(xì)胞的發(fā)育軌跡，以深入了解出生后β細(xì)胞增殖和成熟的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。Zeng等[17]利用mIns1-H2B-mCherry鼠系分離β細(xì)胞，而Qiu等[16]利用Ins1-RFP、GCG-Cre和Rosa-RFP鼠系分離β細(xì)胞和α細(xì)胞。在這2項(xiàng)研究中，對(duì)從出生后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)分離的β細(xì)胞排序，根據(jù)轉(zhuǎn)錄相似性重建β細(xì)胞成熟軌跡。Qiu等[16]的研究成果分別報(bào)道了664個(gè)基因和448個(gè)基因在β細(xì)胞和α細(xì)胞成熟過(guò)程中受到動(dòng)態(tài)調(diào)控。研究結(jié)果表明，β細(xì)胞的成熟主要通過(guò)基因上調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn)。相反，α細(xì)胞似乎通過(guò)基因下調(diào)來(lái)使α細(xì)胞成熟。此外，通過(guò)擬時(shí)序分析揭示了未成熟、增殖β細(xì)胞的特征，以及調(diào)控氨基酸攝取和代謝、線粒體呼吸和ROS產(chǎn)生的基因在出生后β細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的相關(guān)表達(dá)變化。Zeng等[17]的研究結(jié)果表明，由于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因下調(diào)而導(dǎo)致的氨基酸剝奪，以及β細(xì)胞成熟過(guò)程中ROS水平的降低和血清應(yīng)答因子（serum response factor，SRF）及其靶基因的下調(diào)，可能導(dǎo)致出生后β細(xì)胞增殖能力下降。因此靶向ROS/SRF/促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）/血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）通路和氨基酸的激活可能會(huì)重新刺激成人β細(xì)胞增殖。在妊娠或肥胖等高代謝需求下觀察到β細(xì)胞增殖的促進(jìn)，出生后早期β細(xì)胞增殖調(diào)控有關(guān)的通路在這些條件下是否被重新激活將有待進(jìn)一步研究。

二、觸發(fā)β細(xì)胞成熟

有效恢復(fù)代謝動(dòng)態(tài)平衡的前提是實(shí)現(xiàn)新生成β細(xì)胞全部功能的成熟。在β細(xì)胞自然的細(xì)胞周期中，β細(xì)胞在成年期預(yù)計(jì)會(huì)經(jīng)歷類似于不同分化狀態(tài)的一系列變化[18]。成熟的β細(xì)胞表型通常與高水平的胰島素和β細(xì)胞特異性葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（glucose transporter 2，GLUT2）以及轉(zhuǎn)錄因子肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A，MafA）和Nkx6.1的表達(dá)有關(guān)。相反，在小鼠未成熟β細(xì)胞中，早期β細(xì)胞發(fā)育所需的基因MafB、配對(duì)盒基因（paired box gene 4，Pax4）、Pax6和UCN3表達(dá)升高和胰島素分泌減少，即在未成熟β細(xì)胞中失去了β細(xì)胞功能正常所需的關(guān)鍵成熟因子[19]。在人和小鼠成年胰島中仍存在未成熟的β細(xì)胞。Szabat等[20]檢測(cè)到2個(gè)穩(wěn)定的胰十二指腸同源框（pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX1）陽(yáng)性β細(xì)胞亞群，但其胰島素水平不同。人和小鼠β細(xì)胞中有25%是PDX1陽(yáng)性，但是胰島素水平較低并且表達(dá)譜不成熟，這群細(xì)胞隨著復(fù)制速率的增加，胰島素分泌會(huì)隨之減少。此外，在培養(yǎng)過(guò)程中，這些細(xì)胞中部分會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)楦墒斓臓顟B(tài)。有研究進(jìn)一步證實(shí)了未成熟或前β細(xì)胞的存在，并將活躍的Wnt/平面細(xì)胞極性（planar cell polarity，PCP）信號(hào)與β細(xì)胞成熟聯(lián)系起來(lái)[21]。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Wnt/PCP途徑的下游效應(yīng)因子flattop（Fltp）在小鼠胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞中特異性表達(dá)，并將β細(xì)胞細(xì)分為Fltp陰性的增殖細(xì)胞（20%）和Fltp陽(yáng)性的代謝活性細(xì)胞（80%）[21]。Wnt和MAPK信號(hào)在未成熟的出生后β細(xì)胞和FVR陰性的內(nèi)分泌細(xì)胞中都高度表達(dá)。Arda等[22]證明SIX2和SIX3轉(zhuǎn)錄因子能增加幼年未成熟β細(xì)胞的胰島素含量和胰島素分泌，提示SIX2和SIX3在β細(xì)胞成熟過(guò)程中起關(guān)鍵作用。因此，雖然轉(zhuǎn)錄水平上的差異很小，但翻譯后的Wnt/PCP信號(hào)對(duì)于觸發(fā)成熟的β細(xì)胞表型至關(guān)重要。同樣，許多單細(xì)胞研究報(bào)告了胰島素調(diào)節(jié)和β細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的異質(zhì)性。Segerstolpe等[11]檢測(cè)到2組血清視黃醇結(jié)合蛋白4（retinol binding protein 4，RBP4）和G蛋白耦聯(lián)受體120（Gprotein coupled receptor 120，GPR120）[也稱為游離脂肪酸受體4（free fatty acid receptor 4，F(xiàn)FAR4）]水平較高。綜上，單細(xì)胞分析確定了成熟β細(xì)胞新的潛在標(biāo)志物。為了從分子上剖析β細(xì)胞的異質(zhì)性，更好地理解和推動(dòng)β細(xì)胞成熟的機(jī)制研究，尚需更多關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子等調(diào)控元件的信息，這些調(diào)控元件的表達(dá)量很低，但可能對(duì)細(xì)胞的周期和狀態(tài)有很大的影響。

三、α細(xì)胞到β細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化

α細(xì)胞分泌胰高血糖素，誘導(dǎo)糖原分解以提高血糖水平。重要的是，α細(xì)胞比β細(xì)胞更能抵抗代謝應(yīng)激，1型糖尿病和2型糖尿病患者中數(shù)量無(wú)明顯變化[6,11,23-25]。Collombat等[26]通過(guò)異位過(guò)表達(dá)Pax4單基因操作足以誘導(dǎo)α細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)UCN3陰性胰島素陽(yáng)性的β細(xì)胞（占所有β細(xì)胞的1%～2%）在轉(zhuǎn)錄上[如葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基-2（glucose-6-phosphatase catalytic subunit，G6PC2）、Eroib和GLUT2表達(dá)確實(shí)]和功能上（無(wú)法感知葡萄糖）不成熟，表明自然發(fā)生的α細(xì)胞到β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是維持自體胰島穩(wěn)態(tài)的一部分[27]。譜系追蹤研究表明，這些細(xì)胞既代表了α細(xì)胞向成熟的β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的中間階段，也代表了從β細(xì)胞向有功能α細(xì)胞的反向轉(zhuǎn)變。其他研究也報(bào)道了在人類胰島中同時(shí)表達(dá)α和β細(xì)胞標(biāo)志的中間狀態(tài)細(xì)胞，并且在胰島α細(xì)胞和δ細(xì)胞能向β細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)換[28]。α細(xì)胞可以相對(duì)容易地轉(zhuǎn)分化為β細(xì)胞，從表觀遺傳學(xué)上解釋其可塑性。α細(xì)胞在發(fā)育基因上有數(shù)百個(gè)存在激活性和抑制性的二價(jià)組蛋白標(biāo)記，與人類胚胎干細(xì)胞的組蛋白修飾圖極為相似，表明α細(xì)胞存在未分化的多能表觀基因組狀態(tài)[29]。此外，與β細(xì)胞相比，α細(xì)胞有更多開(kāi)放的染色質(zhì)區(qū)域，其中許多與β細(xì)胞標(biāo)記基因有關(guān)。同時(shí)失活α細(xì)胞調(diào)節(jié)因子Arx和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）足以促進(jìn)α細(xì)胞快速轉(zhuǎn)化為能夠產(chǎn)生和分泌胰島素的β細(xì)胞。這證實(shí)除了細(xì)胞類型特異性調(diào)控因子的調(diào)節(jié)外，轉(zhuǎn)換過(guò)程還涉及表觀遺傳的變化。scRNA-seq和功能評(píng)估顯示，轉(zhuǎn)化β細(xì)胞和天然β細(xì)胞間的差別非常小，但未被覆蓋的細(xì)胞保留了α細(xì)胞的特征，這表明并不是所有α細(xì)胞都同樣易被重新編輯[30]。通過(guò)相當(dāng)簡(jiǎn)單的遺傳和表觀遺傳操作或藥物治療可以誘導(dǎo)α細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，并且α細(xì)胞具有較高的增殖率，具有發(fā)育基因位點(diǎn)的二價(jià)組蛋白修飾和與β細(xì)胞相似的基因中開(kāi)放的染色質(zhì)區(qū)，這使得α細(xì)胞可能成為未來(lái)1型糖尿病和2型糖尿病臨床治療的新方向，并表明α細(xì)胞除了能分泌胰高血糖素外，還可能具有其他重要的功能。

β單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)所存在的不足

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析在臨床上可以連續(xù)且動(dòng)態(tài)追蹤疾病基因表達(dá)、病程變化，并能預(yù)測(cè)疾病預(yù)后。但scRNA-seq仍然存在一些問(wèn)題，如覆蓋率低、特異性差；另一方面即使是在非糖尿病情況下，胰島細(xì)胞組成也是高度可變，β細(xì)胞百分比變動(dòng)于25%～80%，而α和β細(xì)胞分別占比2%～67%和5%～25%[31]。因此，β細(xì)胞（或其他胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞）中發(fā)生的小范圍變化則會(huì)被相關(guān)細(xì)胞類型對(duì)總胰島RNA貢獻(xiàn)的mRNA變化所掩蓋。

表面標(biāo)記方法可用于研究α和β細(xì)胞基因特征及與其表觀基因組標(biāo)記的相關(guān)性，但該方法也存在一些弊端，如分選方案不允許富集稀有內(nèi)分泌細(xì)胞類型如D細(xì)胞和胰多肽細(xì)胞。通過(guò)大量RNA分析只能提供細(xì)胞系中每個(gè)基因的平均表達(dá)值，而scRNA-seq可在所分析的細(xì)胞中捕獲更豐富的基因表達(dá)參數(shù)集。因此，scRNA-seq除了發(fā)現(xiàn)和描述假定的特定生物狀態(tài)如β細(xì)胞或細(xì)胞亞型外，還可以確定由代謝疾病驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)變異性的變化。在scRNA-seq研究中，每個(gè)細(xì)胞中只有小部分轉(zhuǎn)錄本被測(cè)序。這會(huì)導(dǎo)致對(duì)低表達(dá)或中度表達(dá)的基因進(jìn)行不可靠的量化，從而阻礙下游分析。因此許多科學(xué)家為了提高scRNA-seq的準(zhǔn)確性，開(kāi)發(fā)了許多新的統(tǒng)計(jì)及檢測(cè)方法，如準(zhǔn)確而穩(wěn)定地估算出scRNA-seq數(shù)據(jù)中丟失的sclmpute統(tǒng)計(jì)法[32]、一種基于獨(dú)特分子標(biāo)記的scRNA-seq數(shù)據(jù)的表達(dá)恢復(fù)方法SAVER[33]。

ScRNA-seq新技術(shù)大大提高了檢測(cè)的分辨率，從而提高了轉(zhuǎn)錄組分析的能力，該技術(shù)可捕獲單一基因發(fā)生的活性變化。雖然這些變化可能只存在于小部分細(xì)胞中，但這對(duì)于理解疾病進(jìn)展可能更為重要。隨著mRNA捕獲和cDNA合成技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，研究的樣本量將會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大，再加上計(jì)算分析方法的進(jìn)步，scRNA-seq和相關(guān)的研究方法將大大提高我們對(duì)理解胰島細(xì)胞在1型糖尿病和2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用，從而探索出新的治療模式。