何日升，徐藝，崔云甫

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院膽胰外科，黑龍江 哈爾濱 150086

胰腺癌預后差，這與胰腺癌發(fā)病較其他腫瘤更為隱匿、病程早期即有組織侵犯和遠處轉(zhuǎn)移、手術方式的選擇有限以及該病對輔助治療反應較差有關，這幾項因素導致病人的5年生存率極低，經(jīng)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)只有8%，如果胰腺癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，這個比率則進一步下降，只有3%[1-2]。盡管我們可以通過CA19-9水平、影像學資料如CT以及MRI等獲得初步診斷依據(jù)，但對這些檢查的準確性仍不十分滿意，尤其是在病程早期階段，很多檢查可能為陰性結果[3]。此外，腫瘤細胞內(nèi)基因和蛋白質(zhì)表達水平改變以及腫瘤微環(huán)境中細胞間相互作用為侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥創(chuàng)造了條件，但其具體機制仍需進一步研究[4]。目前胰腺癌診治面臨的主要障礙是缺乏早期特異性診斷的生物標志物和治療靶點，迄今為止，盡管已經(jīng)有很多人在胰腺癌方面進行了大量的相關研究，但其發(fā)病率和死亡率每年仍有上升的趨勢，而且胰腺癌在年輕病人中的發(fā)病率每年也有上升的趨勢。手術切除腫瘤和轉(zhuǎn)移性病變是目前唯一可治愈該疾病的方法，術后病人常接受輔助化療，如吉西他濱，然而僅有30%的病人對西吉他濱治療方案有效，更糟糕的是許多胰腺癌病人從患病、病情發(fā)展到晚期都沒有明顯的癥狀，導致錯過了診療的最佳時間[2,5]。這些錯過最佳治療時間的病人往往只能行保守治療如化療或者手術方式下行改道從而解除腫瘤壓迫產(chǎn)生的相關癥狀，而且到達這個階段的病人其日常生活水平和生存時間往往都不盡如人意。所以尋找一種簡便有效的確診方法和治療策略迫在眉睫。最近許多環(huán)狀RNA(circRNA)被發(fā)現(xiàn)參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括胰腺癌，并有望成為潛在的診斷標志物和治療靶點，這為胰腺癌病人帶來了希望，將有助于解決胰腺癌早期診斷困難和治療方式局限這兩個困擾我們多年的問題。本文對circRNA及其在胰腺癌中的研究進展作一綜述。

一、circRNA

circRNA是一種于20世紀70年代首先在病毒中觀察到的共價封閉環(huán)狀非編碼RNA，這是一類特殊的RNA，circRNA功能與其他非編碼RNA(如miRNA、lncRNA、snRNA、piRNA和siRNA)類似，雖然目前的研究發(fā)現(xiàn)通常情況下circRNA不能被翻譯成蛋白質(zhì)，但是它可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的修飾[6]。與線性RNA有差別的是，circRNA是由pre-mRNA轉(zhuǎn)錄物反向剪接而成，其5′端和3′端相互連接形成一個封閉的環(huán)，它沒有5′帽結構和3′多聚A尾，這使得circRNA不易被核糖核酸酶降解，因此circRNA可以維持穩(wěn)定的細胞內(nèi)表達。由于其獨特的結構，circRNA在哺乳動物中非常穩(wěn)定，在進化上高度保守，在表達方面具有一定的組織特異性和時間特異性。最近這幾年隨著RNA純化技術、生物信息學分析、高通量RNA測序技術以及對各種circRNA研究工具的發(fā)展，目前測得的circRNA已經(jīng)超過3萬個，發(fā)現(xiàn)其在真核生物體內(nèi)廣泛分布[7]。以下就circRNA的功能作一簡要的介紹。

1.circRNA的微小RNA(miRNA)海綿功能 circRNA主要通過經(jīng)典的circRNA-miRNA-信使RNA(mRNA)軸影響并調(diào)控腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、增殖和化療耐藥性的基因表達水平。在生物體內(nèi)circRNA主要是充當miRNA的海綿來發(fā)揮其作用，miRNA與mRNA的3′-UTR結合后會使得與這個mRNA有關的基因表達受限制，然而circRNA通常包含一個或多個miRNA響應元件，miRNA響應元件則可以與相應的miRNA結合，使miRNA失去功能，從而導致miRNA下游基因的表達恢復[8]。考慮到miRNA靶向基因的不同功能，有些miRNA的靶向基因的表達對腫瘤有促進作用，而另一些miRNA的靶向基因的表達對腫瘤則具有抑制作用。因此在腫瘤進展過程中，circRNA根據(jù)其特殊功能可分為促進腫瘤和抑制腫瘤兩種類型。ciRS-7是一種典型的miRNA海綿，它包含70多個miR-7結合位點，可通過argonaute(AGO)蛋白與miR-7的結合發(fā)揮作用[6]。然而由于circRNA的表達程度較低和長度較短，一些circRNA不能作為miRNA海綿，這表明miRNA海綿活性可能并不是所有circRNA都具有。雖然只有部分circRNA具有miRNA海綿活性，但是由于circRNA數(shù)量龐大，隨著研究深入，在不同疾病中仍然不缺乏具有海綿活性的circRNA，對這些circRNA的進一步研究可能為疾病的確診和治療提供方法。

2.circRNA的蛋白質(zhì)海綿功能 除了對miRNA的海綿作用外，circRNA還可以充當?shù)鞍踪|(zhì)的海綿來調(diào)節(jié)細胞行為。有研究發(fā)現(xiàn)circ-Amotl1可以與心肌細胞中的丙酮酸脫氫酶激酶1和蛋白激酶B1(protein kinase B1，AKT1)相結合，導致AKT1磷酸化并將其轉(zhuǎn)運到細胞核中保護心肌免受損傷[9]。此外也有報道circ-Amotl1可以與信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)相結合并將它運送到細胞核中，這導致細胞的增殖加速并具有侵襲傾向，也導致腫瘤的發(fā)生概率增大[10]。因此我們可以得出circ-Amotl1有作為靶向治療靶點的潛質(zhì)。一些circRNA也可以用作“支架”以結合兩種不同的蛋白質(zhì)，介導它們之間的相互作用。例如，circFoxo3可以與細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)和細胞周期調(diào)節(jié)因子p21的復合物相結合形成一個三聯(lián)體，從而加速CDK2和p21的解離，使細胞周期蛋白A(cyclinA)和細胞周期蛋白E(cyclinE)磷酸化，促進細胞周期的轉(zhuǎn)變[11]。以上這些研究和發(fā)現(xiàn)均證實了circRNA在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)海綿功能，相信在這一領域的深入研究可以為某些疾病的靶向治療提供了新的方法。

3.circRNA可翻譯成蛋白質(zhì) 由于circRNA沒有5′端的帽結構以及3′端的多聚A尾，它是一個環(huán)形結構，因此與線性RNA不同，circRNA通常不能被翻譯成蛋白質(zhì)。然而，證據(jù)表明circRNA可能不是一種真正的非編碼RNA，至少它們其中某些circRNA是可以被翻譯的，體外研究表明，一些含有開放閱讀框和內(nèi)部核糖體進入位點元素的circRNA具有結合內(nèi)源性核糖體并被翻譯成蛋白質(zhì)的能力[12]。circRNA可以被翻譯成蛋白質(zhì)的典型例子是在丁型肝炎病毒中，當丁型肝炎病毒感染宿主細胞后，其circRNA則被翻譯成D-hepatic抗原[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，circ-ZNF609包含從起始密碼子開始的開放閱讀框，和線性轉(zhuǎn)錄本相似，它以框內(nèi)的終止密碼子結束以形成一個循環(huán)，這種circRNA通過依賴剪切的方式而不需要依賴帽結構就可以翻譯成特定的蛋白質(zhì)，控制成肌細胞增殖[14]。此外，含有內(nèi)部核糖體進入位點的circFBXW7和circSHPRH可以編碼含F(xiàn)-框WD重復域蛋白7-185aa(FBXW7-185aa)和SNF2組蛋白連接分子PHD解旋酶-146aa(SHPRH-146aa)，敲除內(nèi)部核糖體進入位點序列可導致膠質(zhì)瘤細胞中這些circRNA失活，從而下調(diào)FBXW7-185aa和SHPRH-146aa[15-16]。然而，circRNA編碼的蛋白是否可作為腫瘤治療靶點或腫瘤生物學標志物目前仍然存在爭議[16]。

4.circRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)制器功能 保留內(nèi)含子的circRNA可與U1小核RNA、親本基因啟動子以及RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNA pol Ⅱ)之間產(chǎn)生某些作用，使其在細胞核中積累并通過促進轉(zhuǎn)錄作用從而提高親本基因的表達。然而，內(nèi)含子circRNA，例如circANKRD52和circsirt7，可以與RNA pol Ⅱ產(chǎn)生某些反應，從而阻礙親本基因的表達[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，編碼基因可以通過典型剪接轉(zhuǎn)錄形成線性RNA，也可以通過非典型剪接轉(zhuǎn)錄形成環(huán)狀RNA，由于對公共外顯子的需求，這兩種選擇在表達上存在相互競爭，從而導致兩者之間的動態(tài)平衡[18]。許多circRNA包含一個起始密碼子，有時甚至是相關線性轉(zhuǎn)錄物的標準AUG，因此，circRNA的表達增加可使相關線性RNA的翻譯失效，這種“選擇性剪接”形式可以調(diào)控同源結構域相互作用蛋白激酶2/3等基因的表達[18]。

二、circRNA與胰腺癌

許多證據(jù)表明circRNA與自噬、凋亡、細胞周期和增殖關系密切，提示它們在各種疾病中可能發(fā)揮作用，如神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病，以及癌癥等。因為circRNA的表達和臨床病理參數(shù)之間有顯著的相關性，以及其在體液包括血液、唾液、尿液和胃液等中的普遍表達，識別差異表達的circRNA對腫瘤的早期診斷和預后預測不僅安全、微創(chuàng)，而且較其他檢查便宜。目前circRNA靶向治療的基本策略是通過基因敲除、反義寡核苷酸和小干擾RNA(siRNA)抑制促進腫瘤的circRNA的表達，或者轉(zhuǎn)染人工抑瘤circRNA等[19]。雖然我們已經(jīng)對circRNA在腫瘤進展中的作用進行了大量的研究，例如circRNA在肺癌、胃癌、肝癌、膽管癌、卵巢癌和宮頸癌等疾病中的作用，我們課題組前段時間就發(fā)現(xiàn)在膽管癌中，circ-CCAC1可以加速腫瘤進展[20]，但是只有少數(shù)研究集中于circRNA在胰腺癌中的作用，尤其是在中國，這類研究最近幾年才剛剛開始。

1.circRNA與胰腺癌的增殖 大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中某些circRNA會出現(xiàn)表達程度的異常，這可能與腫瘤的增殖有關。hsa_circ_0006215/miR-378a-3p/SERPINA4信號軸在胰腺癌進展中的作用得到了大量研究證實，circ_0006215通過對miR-378a-3p的海綿作用，減弱其對促癌靶基因SERPINA4的抑制，進而促進胰腺癌細胞的增殖，這項研究首次證明circRNA可用作胰腺癌的miRNA海綿，調(diào)節(jié)腫瘤相關基因的表達[21]。在此基礎上，有實驗研究通過高通量芯片分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000977在胰腺癌組織中異常上調(diào)，這也得到了qRT-PCR的驗證，沉默hsa_circ_0000977后可以通過增強miR-874-3p的作用和抑制PLK1的表達來抑制胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)細胞的增殖，并使細胞周期阻滯，抑制其在體內(nèi)生長，在許多癌癥中，PLK1的過表達常與更差的預后有關[22]。Hao等[23]也發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞中上調(diào)circ_0007534可促進其增殖，并通過對miR-625和miR-892b的海綿作用抑制細胞凋亡，其機制可能是通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2的表達實現(xiàn)。絲氨酸蛋白酶3(PRSS3)作為一種致癌基因，在胰腺癌中顯著上調(diào)，研究表明circ-ADAM9通過對miR-217的海綿作用，減輕了miR-217對PRSS3的抑制作用，提高PRSS3的表達水平，從而激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/血管內(nèi)皮生長因子(ERK/VEGF)信號通路，低miR-217或高circ-ADAM9表達的病人比高miR-217或低circ-ADAM9表達的病人生存時間短，circ-ADAM9沉默或miR-217過表達明顯延緩了腫瘤的生長，兩者的聯(lián)合對腫瘤的致瘤性具有抑制作用[24]。另一項研究[10]表明circ_100782在胰腺癌中上調(diào)，并通過與miR-124結合增加下游白細胞介素6受體(IL-6R)和非受體型酪氨酸激酶2(JAK2)和STAT3的表達，從而促進胰腺癌BxPC-3細胞的增殖。此外，hsa_circ_001653在PDAC中上調(diào)，通過RNA干擾沉默PDAC細胞中的hsa_circ_001653可以抑制細胞活力、細胞周期進展、體外血管生成等，表現(xiàn)出促凋亡作用，其機制為沉默hsa_circ_001653可以通過增強miR-377抑制同源框C6功能的能力來抑制PDAC的進展[25]。比較特殊的是，hsa_circ_0001649在胰腺癌細胞系中表達下調(diào)，且其低表達常伴較高的腫瘤分期和較差的組織分級，外源性給予hsa_circ_0001649可以抑制胰腺癌細胞的增殖能力，說明其可作為外源性腫瘤治療藥物[26]。

2.circRNA與胰腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移 胰腺癌中有些circRNA出現(xiàn)表達程度的異?？赡芘c侵襲及轉(zhuǎn)移有關。Yang等[27]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0006988在胰腺癌組織和血漿中顯著升高，其在胰腺癌組織中的表達水平與腫瘤血管浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移以及T分期密切相關，其在血漿中的表達水平與CA19-9水平、N分期、血管浸潤及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關，hsa_circ_0006988的表達水平越高往往提示更差的預后；此外，胰腺癌病人早期hsa_circ_0006988表達水平就有升高，hsa_circ_0006988與CA19-9這兩項指標聯(lián)合在胰腺癌的早期診斷中有較高應用價值。研究[28]表明，hsa_circRNA_0007334可能作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，通過吸附hsa-miR-144-3p調(diào)節(jié)MMP7，提高其表達水平，在PDAC中發(fā)揮重要作用，并在體外試驗中得到證實，先前的研究發(fā)現(xiàn)MMP7的高表達與轉(zhuǎn)移性PDAC密切相關[28]。有研究[29]分析了circ-ASH2L在胰腺癌臨床組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-34a可在多種腫瘤中調(diào)控Notch1的表達，Notch1信號通路可在包括PDAC在內(nèi)的多種腫瘤中促進侵襲、遷移或血管生成,而circ-ASH2L通過對miR-34a的海綿作用，調(diào)控Notch 1的表達，circ-ASH2L增加了Notch 1的表達，而miR-34a降低了Notch 1的表達，并且在Capan-1與Aspc-1這兩種細胞系中，circ-ASH2L可以恢復miR-34a介導的抑制作用,最后，該研究還發(fā)現(xiàn)circ-ASH2L高表達與淋巴浸潤以及更高的TNM分期有關[29]。上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變最初被描述為上皮細胞獲得遷移特性的過程，其特征是上皮標志物的抑制和間充質(zhì)特性的出現(xiàn)，上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可以在成人中作為對刺激(如損傷)的反應而被重新激活，也可以在器官纖維化和癌癥進展期間被激活，發(fā)生EMT的細胞不僅具備了遷移的能力，而且還伴隨著細胞周期的退出和對凋亡的抵抗而發(fā)生了許多變化，以實現(xiàn)分離和遠端器官的定植。研究[30]發(fā)現(xiàn)，circBFAR通過對miR-34b-5p的海綿作用，上調(diào)了EMT激活轉(zhuǎn)錄因子(EMT-TFs)的表達，在很多癌癥中EMT-TFs信號通路經(jīng)常發(fā)生失調(diào)，既往研究表明，EMT-TFs經(jīng)常過度表達，并在PDAC的進展中發(fā)揮重要作用，circBFAR的過度表達增加了EMT-TFs的表達，使下游的AKT(Ser 473)磷酸化，進一步激活了MET/PI3K/Akt信號通路，最終促進了PDAC的轉(zhuǎn)移，抑制EMT已成為一種有前途的胰腺癌治療方法[30]。外泌體可由腫瘤細胞分泌并可作為細胞間傳遞信號的信使，Li等[31]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌病人血漿外泌體富含circ-PDE8A，與腫瘤進展及預后相關，此外，一項深入的研究發(fā)現(xiàn)circ-PDE8A可以通過競爭性結合miR-338激活MACC/MET/ERK信號通路，促進腫瘤轉(zhuǎn)移。比較特殊的是，Zhang等[32]發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_001587在胰腺癌細胞系中表達下調(diào)，而miR-223高表達，研究表明，hsa_circRNA_001587通過對mir-223的海綿作用，解除后者介導的溶質(zhì)載體家族4成員4抑制作用，抑制胰腺癌的細胞遷移、侵襲、血管生成和腫瘤發(fā)生，然而hsa_circRNA_001587的低表達則起相反作用。

3.circRNA與胰腺癌的耐藥 circRNA也可能在胰腺癌對化學藥物的耐藥性方面起到舉足輕重的作用。吉西他濱耐藥是目前晚期胰腺癌化療的主要問題，耐藥被認為是由藥物代謝改變或癌細胞凋亡減少引起的，Xu等[33]證實了circRNA在對吉西他濱有抗性的和正常的胰腺癌細胞系中表達譜存在差異，他們認為circRNA可能作為miRNA海綿影響絲裂原活化蛋白激酶和雷帕霉素靶蛋白信號通路，從而使得胰腺癌產(chǎn)生耐藥。同時，Shao等[34]在胰腺癌中構建了對吉西他濱有抗性的細胞系(PANC-1-GR)，分析了PANC-1-GR和PANC-1的circRNA表達譜差異，鑒定了兩組間差異最大的兩種circRNA(chr14:101402109-101464448 +，chr4:52729603-52780244 +)，這兩種circRNA可能通過吸附miR-19a-3p和miR-145-5p使后兩者表達下調(diào)而起作用，發(fā)現(xiàn)沉默它們的表達可以恢復胰腺癌耐藥細胞株的敏感性，而過表達則會降低敏感性。近期有證據(jù)表明，RAS相關結構家族基因1(ras association family member1，RASSF1)參與了凋亡信號傳導、微管穩(wěn)定和有絲分裂進展等多種生物學過程，并且RASSF1在對西吉他濱有抗性的胰腺癌組織中表達升高，研究發(fā)現(xiàn)，circHIPK3通過對miR-330-5p的海綿作用，降低后者與RASSF1 3′-UTR的結合使RASSF1表達升高來調(diào)控腫瘤發(fā)生，并提升胰腺癌對西吉他濱的抗性[35]。

三、總結與展望

circRNA因其擁有共價閉環(huán)的穩(wěn)定結構，比線性RNA更加穩(wěn)定，且廣泛分布在真核生物體內(nèi)，且其在進化上高度保守，在表達方面具有一定的組織特異性和時間特異性，使得其具有成為各種疾病包括腫瘤在內(nèi)的標志物和靶向治療作用位點的潛質(zhì)。最近關于circRNA的研究逐漸揭示了它們在腫瘤進展中的各種作用。circRNA最常見和重要的功能是作為miRNA海綿，通過circRNA-miRNA-mRNA軸上調(diào)或下調(diào)基因表達，影響腫瘤進展。circRNA在胰腺癌診斷和治療中的研究剛剛起步，并獲得了一定的進展。此外，深入研究表明，circRNA在胰腺癌中可以與miRNA結合，通過多種信號軸上調(diào)或下調(diào)miRNA下游靶基因的表達水平，從而調(diào)控胰腺癌腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐受等行為。這表明circRNA在胰腺癌中發(fā)揮著多種作用，此外，對這些信號通路的研究可以成為尋找胰腺癌治療靶點的基礎。然而，circRNA在胰腺癌中的研究領域，目前仍缺乏有說服力的動物實驗和臨床研究來證實circRNA在臨床治療中的作用。因此，circRNA在胰腺癌中發(fā)揮的作用及其機制仍需深入研究。我們相信，在不久的將來，circRNA將有利于胰腺癌的早期診斷和靶向治療。