劉保宏

大連大學(xué)，遼寧省大連市 116622

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是臨床老年智力障礙中最常見(jiàn)的類(lèi)型，是一種不可逆的神經(jīng)退行性的疾病，隨著老齡人口的逐年增多，其發(fā)病率也在逐年升高。AD的病因仍不明確，因此對(duì)其臨床的早期診斷仍具有一定的困難。目前被大家廣泛認(rèn)可的β-淀粉樣蛋白(Amyloidβ-proein，Aβ)級(jí)聯(lián)假說(shuō)認(rèn)為Aβ 蛋白代謝失衡、沉積形成老年斑是誘發(fā)AD 的重要因素[1]。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過(guò)β和γ分泌酶的蛋白水解作用生成的含有39～43個(gè)氨基酸的多肽。當(dāng)其在腦中的代謝發(fā)生失衡時(shí)，聚集和形成的低聚物和纖維體會(huì)沉積于腦中，即使少量也具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，可引起腦部病變[2]。因此針對(duì)Aβ蛋白的檢測(cè)對(duì)于AD的診斷、干預(yù)、治療有重要意義。

1 Aβ蛋白引發(fā)AD的機(jī)制

Aβ蛋白引發(fā)AD的機(jī)制主要表現(xiàn)為Aβ蛋白代謝失衡后引發(fā)氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、海馬區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)抑制以及 Aβ降解酶活性受損等反應(yīng)，以上因素均可誘導(dǎo)AD發(fā)病或加重病情。

1.1 Aβ蛋白引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激是由于氧化劑與抗氧化劑之間的作用不平衡，導(dǎo)致氧化還原信號(hào)和相關(guān)氧化分子被破壞，使腦部在氧化還原反應(yīng)中更傾向于氧化[3]。然而過(guò)量的氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物活性氧(ROS)將導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)生物大分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA 及RNA 的過(guò)度氧化損傷[4]。同時(shí)相關(guān)研究表明，Aβ及其前體APP的N端的金屬結(jié)合域中含有銅和鋅等金屬離子的高親和力結(jié)合位點(diǎn)，銅離子能高效介導(dǎo)羥基自由基的氧化，因此當(dāng)人體內(nèi)Aβ蛋白大量異常沉積時(shí)，引起老年斑中大量的銅離子聚集參與氧化，導(dǎo)致AD患者腦中氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，進(jìn)一步加劇了腦部損傷使病情加速進(jìn)展[5]。

根據(jù)研究證實(shí)大量的ROS會(huì)反作用促進(jìn)Aβ蛋白的沉積[6]，且氧化應(yīng)激相關(guān)氧化標(biāo)記物如丙二醛(MDA)、4-羥基壬烯醛(4-HNE) 可以增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞膜上鈣離子通道的開(kāi)放，加速鈣離子的內(nèi)流，神經(jīng)細(xì)胞興奮性增強(qiáng),使得蛋白激酶過(guò)度的活化，促使Tau蛋白的過(guò)度磷酸化，加重病情[7-8]。

同時(shí)近期研究表明Aβ蛋白的聚集可影響神經(jīng)細(xì)胞的線粒體，從而導(dǎo)致線粒體的損傷[9]。過(guò)度的氧化應(yīng)激不僅能阻礙線粒體電子的傳遞，同時(shí)會(huì)造成線粒體DNA和相關(guān)突觸的損傷[10]。當(dāng)線粒體損傷達(dá)到一定程度時(shí)會(huì)進(jìn)一步加速相關(guān)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，使病情惡化[11]。

1.2 Aβ蛋白刺激引發(fā)神經(jīng)炎癥 沉積的Aβ蛋白本身作為一種炎癥刺激因子直接刺激神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥[12]。同時(shí)Aβ蛋白能夠活化老年斑周?chē)男∧z質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，引起TNFα或IL-1-β等促炎性細(xì)胞因子的釋放[13]，長(zhǎng)時(shí)間的神經(jīng)炎癥會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)突觸的功能障礙加速神經(jīng)元的變性，加劇腦部損傷引起病變[14]。Aβ蛋白沉積可以誘導(dǎo)Toll樣受體4(TLR4)的活化，使神經(jīng)炎癥得到進(jìn)一步發(fā)展[15]。同時(shí)有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞被誘導(dǎo)激活而釋放多種炎癥因子，其中部分因子能夠降低Aβ清除效率，如胰島素降解酶等，在炎癥的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加劇了Aβ蛋白的沉積[16]。隨著炎癥的發(fā)生，可溶性的Aβ蛋白會(huì)促進(jìn)炎癥相關(guān)的趨化因子(C-X-C基序)配體中(CXCL)8、CCL2和CCL3的水平的增加，這些配體會(huì)引發(fā)Aβ蛋白認(rèn)知障礙，使得Aβ的清除障礙加劇，病情加重[17]。

1.3 Aβ蛋白對(duì)海馬區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)抑制 目前，有研究明確海馬區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)與神經(jīng)元突觸的可塑性直接相關(guān)，而神經(jīng)元突觸的可塑性又與學(xué)習(xí)記憶能力息息相關(guān)，可以通過(guò)測(cè)定海馬區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)是否被抑制來(lái)反映患者學(xué)習(xí)記憶能力衰退程度[18]。經(jīng)證實(shí)當(dāng)Aβ蛋白沉積時(shí)，會(huì)影響作用于海馬區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)效應(yīng)的蛋白質(zhì)從而抑制其誘導(dǎo)過(guò)程，減低患者的學(xué)習(xí)記憶能力[19]。當(dāng)海馬區(qū)的Aβ蛋白沉淀并進(jìn)入CA1區(qū)時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)70%神經(jīng)元的丟失和錐體神經(jīng)元的變形，加重海馬區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)抑制，導(dǎo)致AD患者失憶、意識(shí)障礙等癥狀更嚴(yán)重[20]。更有相關(guān)研究證明，Aβ蛋白可以在分子和突觸水平上改變海馬體CA1區(qū)的G蛋白門(mén)控的內(nèi)向整流鉀通道(GirK)通道，抑制其誘導(dǎo)而降低了海馬區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的效應(yīng)，對(duì)AD患者的認(rèn)知水平造成損害。除沉積的Aβ蛋白外，可溶性的Aβ寡聚體也可以激活NR2B基因和N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA受體)來(lái)抑制LTP。

1.4 Aβ降解酶活性受損 Aβ蛋白的沉積是由于其代謝失衡，而Aβ蛋白的降解酶的活性受損和喪失在代謝失衡中發(fā)揮著重要的作用，目前研究表明能夠識(shí)別和分解Aβ蛋白單體和寡聚體的酶主要是腦啡肽酶(NEP)和胰島素降解酶 (IDE)。NEP是一種膜結(jié)合的中性鋅內(nèi)肽酶，可在被激活的小膠質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞激活過(guò)度或細(xì)胞損傷缺失時(shí)，則會(huì)引起NEP的分泌相對(duì)或絕對(duì)不足，造成Aβ蛋白的沉積。IDE則作為一種胞質(zhì)蛋白酶發(fā)揮降解Aβ的作用，其分泌本身與年齡呈負(fù)相關(guān)，隨著年齡的增加，其分泌的量降解Aβ蛋白的能力不足以和生成能力保持平衡，因而老年人中阿爾茲海默癥發(fā)病更為常見(jiàn)。部分相關(guān)研究也表示，當(dāng)人體尤其是腦中膽固醇的水平升高時(shí)，可通過(guò)消耗線粒體中的谷胱甘肽(mGSH)，來(lái)刺激氧化應(yīng)激，而NEP、IDE均可作為氧化的底物被消耗導(dǎo)致含量減少，引起Aβ的降解障礙，導(dǎo)致AD發(fā)病。

2 Aβ蛋白及其相關(guān)產(chǎn)物的檢測(cè)方法

2.1 Aβ蛋白檢測(cè) 目前認(rèn)為腦中的淀粉樣變性已經(jīng)成為AD的決定性特征，因此β-淀粉樣蛋白的聚集被作為診斷的標(biāo)準(zhǔn)，并且研究表明AD患者腦中和血液中Aβ蛋白的水平與正常人比較存在顯著差異。關(guān)于腦中Aβ蛋白的沉積，通常利用以11C-匹茲堡復(fù)合物B和18F為示蹤劑的正電子發(fā)射體層成像(PET)來(lái)進(jìn)行測(cè)定，是目前臨床確診AD和預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)歸的重要手段。近期在針對(duì)血清中可溶性Aβ低聚物的測(cè)定研究中，發(fā)現(xiàn)一種利用Aβ蛋白N端的表位重疊抗體捕獲和檢測(cè)血漿中Aβ多聚體和寡聚體的技術(shù)：多聚體檢測(cè)系統(tǒng)(MDS)，是一個(gè)特異性較強(qiáng)的新型酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，對(duì)于輔助AD的早期診斷具有重要意義。除針對(duì)Aβ蛋白的定量測(cè)量外，Aβ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化也是AD患者血液中重要的生物標(biāo)志物，Nabers等研究表明一種基于抗體免疫的紅外傳感器，可觀察Aβ肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，且靈敏性和特異性均較好，能為AD診斷提供良好的證據(jù)。

2.2 Aβ蛋白相關(guān)基因檢測(cè) 目前臨床的基因研究中普遍認(rèn)為，載脂蛋白E(ApoE)基因的多態(tài)性是老年癡呆典型的遺傳易感因素，ApoE可從多種機(jī)制引發(fā)AD。其中ApoE4基因作用最為顯著，在抑制Aβ蛋白分解的同時(shí)增加其在老年斑內(nèi)的神經(jīng)毒性。ApoE基因可利用PCR反應(yīng)來(lái)進(jìn)行多態(tài)性分析，并使用基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)(SNaPshot反應(yīng))來(lái)確定其位點(diǎn)的遺傳變異情況。對(duì)于ApoE的基因檢測(cè)可間接反映Aβ蛋白的沉積現(xiàn)象，使得AD的早期診斷成為可能。

IDE基因是否表達(dá)與Aβ蛋白的沉積聯(lián)系十分密切， IDE的蛋白質(zhì)水平與Aβ蛋白的沉淀有定量指標(biāo)的作用，可利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot)來(lái)進(jìn)行定量分析，對(duì)判斷AD患者病情的嚴(yán)重性具有重要意義。

除此之外還有β淀粉狀蛋白前體蛋白(突變APP)、早老素1(PSEN1)、早老素2(PSEN2)等顯性遺傳基因均會(huì)增加AD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，可利用基因測(cè)序技術(shù)來(lái)進(jìn)行早期的預(yù)測(cè)，對(duì)評(píng)價(jià)AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有重大意義。

2.3 血清中神經(jīng)炎性介質(zhì)的檢測(cè) 經(jīng)研究表明與Aβ沉積密切相關(guān)的神經(jīng)炎性因子有TNFα和IL-1-β，除了常規(guī)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法外，還可利用免疫熒光顯微鏡技術(shù)、共聚焦顯微鏡技術(shù)對(duì)該神經(jīng)炎性介質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。顯微鏡觀察腦組織切片反映小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷程度與炎性細(xì)胞因子含量成正相關(guān)，因此檢測(cè)血清或腦脊液中TNFα和IL-1-β的基因表達(dá)水平對(duì)AD患者治療和病情進(jìn)展具有指導(dǎo)作用。根據(jù)Startin等的研究表明血清中的TNFα和IL-1-β也可用靈敏度是ELISA 1 000倍左右的超靈敏Simoa免疫測(cè)定法來(lái)進(jìn)行測(cè)定，能極大程度提高細(xì)胞因子的準(zhǔn)確性，有利于判斷神經(jīng)炎癥的嚴(yán)重程度。

2.4 氧化應(yīng)激相關(guān)的測(cè)定 腦脊液中Cu離子的失代償會(huì)促進(jìn)氧化應(yīng)激，因此可通過(guò)測(cè)定腦脊液中Cu離子的濃度來(lái)反映氧化應(yīng)激發(fā)生的程度。近年來(lái)McQuade等發(fā)明出一種Cu配合物的熒光探針技術(shù)，可與腦脊液中的Cu高特異性結(jié)合，使腦脊液中Cu離子濃度變化成像成為可能，同時(shí)也使觀察Cu離子變化程度來(lái)監(jiān)測(cè)腦中氧化應(yīng)激的程度，來(lái)判斷腦部損傷成為可能?；钚匝?ROS)作為氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，Tang等利用與活性氧OH自由基發(fā)生反應(yīng)的熒光分子探針技術(shù)對(duì)活體腦進(jìn)行檢測(cè)、成像分析，使得直觀觀察出活體腦中ROS的濃度成為可能 。Connolly等利用原代神經(jīng)元培養(yǎng)技術(shù)復(fù)制離體且生物性狀相同的腦神經(jīng)元，使用四甲基羅丹明甲酯(TMRM)作為分子探針，來(lái)檢測(cè)離體神經(jīng)元線粒體膜電位的變化情況，膜電位變化能極好地反映出線粒體膜功能損傷的嚴(yán)重程度與活性氧含量的相關(guān)性?；钚匝鯘舛鹊臏y(cè)定對(duì)于研判AD病情的嚴(yán)重程度具有重要價(jià)值。

3 Aβ蛋白相關(guān)檢測(cè)方法仍存在的問(wèn)題

3.1 取材問(wèn)題 對(duì)于AD患者臨床診斷，主要是依據(jù)對(duì)于腦脊液的介入性測(cè)定Aβ蛋白表型來(lái)進(jìn)行確診。雖準(zhǔn)確率可達(dá)80%～90%，但腦脊液的采取會(huì)對(duì)患者造成創(chuàng)傷，對(duì)老年體質(zhì)較弱患者具有相當(dāng)?shù)南拗菩?，不適于臨床推廣。

3.2 檢測(cè)方法問(wèn)題 目前Aβ沉淀的檢測(cè)多利用PET、MRI等影像學(xué)技術(shù)。據(jù)研究，成像技術(shù)對(duì)于Aβ蛋白異常積累的檢測(cè)有一定的滯后性，顯示結(jié)果明顯慢于腦脊液(CSF)分析。同時(shí)11C-匹茲堡復(fù)合物B用作標(biāo)記物其半衰期較短，導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程成本高。且PET的放射性示蹤劑和熒光分子探針中的放射性物質(zhì)，會(huì)造成腦中的放射性同位素的暴露，造成腦部細(xì)胞不同程度的損傷。而多聚體檢測(cè)系統(tǒng)(MDS)、超靈敏Simoa免疫測(cè)定法、抗體免疫的紅外傳感器等技術(shù)雖然具有較高的靈敏度和特異性，但時(shí)間成本、技術(shù)成本和技能要求也更高，因此具有相當(dāng)?shù)木窒扌裕贿m于臨床的普及。同時(shí)對(duì)于ApoE基因的檢測(cè)由于RT-PCT在ApoE變體的時(shí)候會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果，可能出現(xiàn)一定程度的誤差。

3.3 檢測(cè)結(jié)果的問(wèn)題 對(duì)于Aβ蛋白的PET檢測(cè)由于生物標(biāo)記物的類(lèi)型不同、標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果參考范圍和統(tǒng)計(jì)方法的差距導(dǎo)致了檢測(cè)結(jié)果依舊存在不確定性。研究表明利用ELISA方法測(cè)定血清相關(guān)的炎性介質(zhì)時(shí)，由于其量少且易受機(jī)體新陳代謝、炎性細(xì)胞及分泌物的影響所以會(huì)造成測(cè)量誤差較大、診斷標(biāo)準(zhǔn)不明確等問(wèn)題。同時(shí)由于Aβ沉積是多基因的作用結(jié)果，單基因ApoE的測(cè)定僅能為確診提供一定的支持條件，并不能對(duì)患者進(jìn)行直接確診。

綜上所述，腦脊液相關(guān)檢測(cè)存在相當(dāng)?shù)木窒扌?，而血清中Aβ蛋白生物標(biāo)志物的檢測(cè)和相關(guān)基因測(cè)序在未來(lái)AD的臨床檢測(cè)中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)外已研究出很多Aβ蛋白相關(guān)生物標(biāo)志物和相關(guān)基因，而明確其與AD發(fā)病率相關(guān)性的研究很少。因此明確其相關(guān)性后，研究出針對(duì)生物標(biāo)記物高效、高靈敏度、廉價(jià)的檢測(cè)方法對(duì)于AD早期的篩查和診斷有至關(guān)重要的作用。