孫綺思，蘇中靜，2

(1．汕頭大學醫(yī)學院組胚教研室，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學醫(yī)學院廣東省感染與免疫重點實驗室，廣東 汕頭 515041)

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是引起新型冠狀病毒肺炎流行的病原菌，感染SARS-CoV-2的患者可能引發(fā)嚴重的急性呼吸窘迫綜合征[1-2]。約翰斯·霍普金斯大學的疫情追蹤數(shù)據(jù)顯示，截至2021年6月4日，全球累計新型冠狀病毒肺炎確診病例超17 000萬例，累計死亡超360萬例。SARS-CoV-2病毒的感染在全球范圍內(nèi)對人類的生活和生產(chǎn)造成了重大影響，因此研究SARS-CoV-2感染人體的機制以及病毒與人體細胞的相互作用備受關(guān)注和重視。

SARS-CoV-2屬于正鏈RNA β型冠狀病毒，核酸長度約為30 kb，其轉(zhuǎn)錄本有5′帽和3′端多聚A尾結(jié)構(gòu)。SARSCoV-2正鏈RNA至少編碼29種蛋白質(zhì)，其中包含刺突蛋白、小包膜蛋白、膜蛋白和核衣殼蛋白4種結(jié)構(gòu)蛋白，16種非結(jié)構(gòu)蛋白以及9個假定的輔助蛋白。SARS-CoV-2的正鏈RNA需要宿主細胞的組件來完成其蛋白質(zhì)的翻譯和運輸，并組裝和分泌病毒顆粒，這些蛋白幫助病毒轉(zhuǎn)錄本占據(jù)宿主細胞內(nèi)蛋白表達主導地位，抑制宿主細胞的正常轉(zhuǎn)錄與翻譯[3-4]。

選擇性剪接指同種mRNA前體通過不同的剪接方式產(chǎn)生多種亞型的過程，所形成的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可有不同的結(jié)構(gòu)特性和功能。以往研究發(fā)現(xiàn)淋巴細胞中約60%的基因表達不同的剪接亞型，提示初始mRNA的選擇性剪接廣泛參與了免疫細胞的分化和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)[5-6]。近期的研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2進入宿主細胞的同時伴隨著眾多選擇性剪接事件，它們不僅幫助病毒進行高效的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，還使病毒有效地躲避機體的免疫反應(yīng)[7-8]。本文綜述選擇性剪接在SARS-CoV-2入侵宿主、宿主細胞免疫反應(yīng)以及病毒逃避免疫過程中的調(diào)控作用等的相關(guān)研究。

1 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的選擇性剪接可能干預(yù)SARS-CoV-2的入侵

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是Ⅰ型跨膜蛋白，宿主細胞ACE2與刺突蛋白S1亞基上的受體結(jié)合域結(jié)合，引發(fā)了刺突蛋白的裂解，誘發(fā)膜融合和感染[9]。生物信息學預(yù)測ACE2基因的5′端、3′端和內(nèi)含子區(qū)域存在可能參與選擇性剪接的假定外顯子，這些外顯子或可取代SARS-CoV-2入侵宿主所需的ACE2結(jié)構(gòu)域，同時保留ACE2在人體內(nèi)的生理功能。剪接開關(guān)寡核苷酸(splice-switching antisense oligonucleotides，SSOs)是一種可與核內(nèi)前體mRNA的靶序列進行堿基配對的短合成反義序列，ACE2基因的選擇性剪接模型實驗提示有可能通過SSOs的作用，調(diào)控ACE2序列中SARS-CoV-2識別相關(guān)的選擇性剪接外顯子的表達，從而干預(yù)SARS-CoV-2對宿主細胞的感染[10]。

2 非結(jié)構(gòu)蛋白16調(diào)控宿主mRNA的選擇性剪接

冠狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein，Nsp)通常參與病毒遺傳物質(zhì)的翻譯及其產(chǎn)物的折疊和運輸，并調(diào)控宿主的蛋白表達和免疫應(yīng)答[11]。Nsp16是一個2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，它在Nsp10的協(xié)助下促進病毒mRNA帽2′-O甲基化，提高病毒翻譯效率，抑制宿主的mRNA[12-13]。Banerjee等[14]發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2基因組編碼的Nsp16與snRNA U1的5′端剪接位點識別序列和U2的分支點識別位點結(jié)合，從而導致宿主細胞的mRNA剪接缺陷。Nsp16作為宿主毒力因子，通過觸發(fā)異常剪接來破壞全局內(nèi)源性mRNA的加工，最終造成宿主細胞mRNA和蛋白水平的衰退。

3 病毒基因組結(jié)合宿主細胞RNA結(jié)合蛋白調(diào)控選擇性剪接

RNA結(jié)合蛋白可以結(jié)合mRNA并調(diào)控mRNA的剪接加工或翻譯過程[15]。Srivastava等[16]通過轉(zhuǎn)錄物剪接的復(fù)制多變量分析方法發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2感染細胞中發(fā)生選擇性剪接事件的基因存在大量跳躍和互斥的外顯子事件，并發(fā)現(xiàn)大量RNA結(jié)合蛋白編碼基因表達選擇性剪接亞型，它們可能會改變宿主細胞的轉(zhuǎn)錄后下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。SRSF1、RNPS1和hnRNP A1都是參與選擇性剪接的RNA結(jié)合蛋白，SRSF1缺失導致的基因組失穩(wěn)可通過RNPS1的過度表達來糾正[17-18]。Rogan等[18]通過模型預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)SRSF1、RNPS1和hnRNP A1在SARS-CoV-2 RNA上存在許多結(jié)合位點，宿主感染后和病毒基因組之間存在著對這些RNA結(jié)合蛋白的競爭，可能會改變宿主細胞全基因組的選擇性剪接。

4 宿主miRNA和病毒miRNA形成雙重機制參與選擇性剪接

基因組經(jīng)過選擇性剪接生成的多種異構(gòu)體miRNA主要與mRNA 3′端互補結(jié)合、調(diào)控蛋白水平。Sa?ar等[19]預(yù)測出30個靶向1 367個人類基因的病毒成熟miRNA樣序列。Yu等[20]研究發(fā)現(xiàn)病毒miR-200c-3p靶向細胞ACE2mRNA的3′UTR。SARS-CoV-2感染細胞中存在大量可能改變轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的選擇性剪接事件，宿主來源的miRNA作為調(diào)節(jié)因子與病毒基因組相互作用參與這些剪接過程[16]。一些人類miRNA可以靶向SARS-CoV-2基因組各區(qū)域，例如，hsamiR-17-5p、hsa-miR-20b-5p和hsa-miR-323a-5p靶向可讀框1ab區(qū)域[21]，miR-374a-3p靶向刺突蛋白基因[16]。7個與病毒mRNA完全互補的人類miRNA已被鑒定，其中miR-3611、miR-3691-3p和miR1468-5p在可讀框1a上，miR-5197和miR-3934-3p在S區(qū)上，miR-8066和miR-1307-3p在N區(qū)上[22-23]。

病毒來源的miRNA靶向宿主多個特定通路，劫持宿主miRNA，保護病毒mRNA免受降解，抑制細胞凋亡與自噬。而細胞來源的miRNA吸附病毒mRNA的3'-UTR，導致這些miRNA與宿主mRNA的結(jié)合減少，改變了宿主基因的表達。兩種來源的miRNA形成作用網(wǎng)絡(luò)對SARS-CoV-2產(chǎn)生了雙重作用[24]，它們在感染細胞選擇性剪接過程中的具體作用機制還有待進一步研究。

5 選擇性剪接調(diào)控干擾素刺激基因網(wǎng)絡(luò)的抗病毒作用

有證據(jù)表明，SARS-CoV-2對干擾素敏感[25]。干擾素與其誘導的干擾素刺激基因(interferon stimulated genes，ISGs)為機體建立抗病毒狀態(tài)，ISGs在宿主細胞內(nèi)的選擇性剪接可改變ISGs蛋白的定位和活性[26-27]。Banerjee等[14]模擬經(jīng)干擾素信號介導的堿性磷酸酶報告基因，發(fā)現(xiàn)該干擾素應(yīng)答基因在Nsp16的表達和添加干擾剪接體組裝的小分子時受到強烈抑制。此外，SARS-CoV-2的mRNA 3′端有大量CpG位點，ISGs編碼的鋅指抗病毒蛋白可靶向這些CpG位點，也可通過產(chǎn)生不同長度的鋅指抗病毒蛋白亞型來限制病毒基因組的表達[28]。

6 小結(jié)

自新冠病毒被鑒定后，許多研究證明了病毒與宿主細胞之間通過各種相互作用增加其各自的蛋白表達形式并調(diào)控對方的基因表達。病毒Nsp、miRNA、宿主蛋白相互作用調(diào)控宿主基因表達的多個剪接環(huán)節(jié)，發(fā)揮協(xié)助病毒感染和增強宿主抗病毒免疫反應(yīng)的作用。目前，備受關(guān)注的是干擾素刺激的下游靶基因網(wǎng)絡(luò)通過選擇性剪接作用抑制病毒的入侵和復(fù)制。在SARS-CoV-2感染過程中，探索這些RNA剪接事件有利于為未來開發(fā)新的治療方法與防控新型冠狀病毒肺炎提供新的思路。