黃 楠 綜述，鄧紅彬 審校

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，重慶 400016)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤。在初診時，約有75%的患者被診斷為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)，約25%被診斷為肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)或轉移性膀胱癌。免疫治療在這兩類分期的膀胱癌患者中發(fā)揮了重要作用。對于NMIBC腫瘤切除術后的中高?；颊?，術后行膀胱內卡介苗(BCG)灌注可降低腫瘤復發(fā)風險。而對于MIBC中順鉑不耐受或轉移性膀胱癌的患者，免疫檢查點抑制劑(ICIs)可提高腫瘤客觀緩解率、延長患者生存期，但是仍有大部分患者不能從免疫治療過程中獲益[1-2]。

腫瘤微環(huán)境(TME)由腫瘤細胞、免疫細胞、間質細胞、細胞外基質、細胞分泌的因子組成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移、免疫抑制過程中發(fā)揮重要作用，其中TME內有一組具有免疫抑制表型的免疫浸潤細胞，可通過內在或外在兩種途徑共同調控腫瘤免疫抑制。免疫抑制的內在控制是通過表達抑制性受體介導的，而外在控制是通過細胞間的接觸和(或)分泌抑制因子介導的[3]。為提高膀胱癌患者對免疫治療的反應率及拓寬免疫治療策略提供參考，本文針對膀胱癌TME中的抑制性免疫浸潤細胞，先概述其在多種腫瘤中的免疫調節(jié)功能及機制，再分別對其在膀胱癌微環(huán)境中促癌機制、潛在的治療靶點、對預后的預測價值進行綜述。

1 抑制性免疫浸潤細胞的生物學功能及免疫調節(jié)機制

最近針對TME的研究發(fā)現(xiàn)，幾種免疫浸潤細胞展現(xiàn)出重要的免疫抑制功能，其包括髓樣抑制細胞(MDSCs)、腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)、調節(jié)性T細胞(Tregs)和腫瘤相關中性粒細胞(TANs)。了解這些細胞的生物學功能及其發(fā)揮免疫抑制的作用機制或促癌機制，能夠為逆轉膀胱癌的免疫抑制微環(huán)境提供新的思路。

1.1MDSCs MDSCs是一群異質性的不成熟的髓系細胞，主要由兩個亞群組成：單核性髓樣抑制細胞(M-MDSCs)和粒性髓樣抑制細胞(G-MDSCs)。在慢性炎癥及腫瘤等病理狀態(tài)下，MDSCs相關基因表達水平改變，使得微環(huán)境中活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)水平增加，精氨酸酶(Arg1)、前列腺素E2(PGE2)和一些抗炎細胞因子表達上調，導致免疫抑制，并支持腫瘤的進展和轉移[4]。MDSCs大致通過以下4種機制實現(xiàn)其促癌作用：(1)保護腫瘤細胞免受免疫殺傷；(2)TME的重塑；(3)轉移前微環(huán)境的建立；(4)與腫瘤細胞相互作用促進上皮-間充質轉化(EMT)[5]。

1.2TAMs 巨噬細胞幾乎存在于人體所有組織中。根據環(huán)境中不同的刺激信號，巨噬細胞可以彈性分化為不同的表型，如M1和M2樣巨噬細胞。在病原體感染或炎癥早期，M1樣或經典途徑激活[γ干擾素(IFN-γ)]的巨噬細胞能夠產生促炎細胞因子[白細胞介素-6(IL-6)、IL-12、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等]，表現(xiàn)出殺傷和抗病原體效應。而慢性炎癥時，M2樣或替代途徑激活(IL-4)的巨噬細胞通過產生抗炎細胞因子(IL-10、CCL-22等)、組織修復因子[轉化生長因子β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)等]、促血管化因子[血管生長因子A(VEGF-A)]，抑制免疫反應，并促進組織修復[6]。TAMs中部分表現(xiàn)為M1樣巨噬細胞表型，尤其在腫瘤發(fā)生早期，呈現(xiàn)出抗腫瘤效應，而腫瘤通過對TAMs進行重編程，使得TAMs中絕大多數(shù)表現(xiàn)為M2樣巨噬細胞表型，在促進腫瘤的發(fā)生、進展和轉移過程中發(fā)揮重要的作用[7-8]。

1.3Tregs Tregs首次在小鼠中被描述為抑制性CD4+T細胞，對維持免疫穩(wěn)態(tài)和自我耐受至關重要[9]。Tregs是有著Foxp3和(或)CD25表達的CD4+T細胞，F(xiàn)oxp3能夠抑制炎癥因子的轉錄，CD25為IL-2受體的α鏈。Tregs主要通過以下5種機制實現(xiàn)其免疫抑制功能：(1)釋放抑制性細胞因子，如TGF-β、IL-10；(2)通過免疫檢查點分子的細胞-細胞接觸：如CTLA-4、LAG3；(3)通過穿孔素或顆粒酶誘導細胞溶解；(4)IL-2的消耗導致T細胞的凋亡；(5)通過胞外酶CD39將ATP水解為ADP和AMP，阻斷效應T細胞的ATP供應，并占據T細胞表面A2A腺苷受體而抑制效應T細胞功能[3,10]。

1.4TANs 中性粒細胞是感染初期最重要的免疫防御細胞。但在腫瘤組織中，環(huán)境中的信號因子可調控中性粒細胞的分化及表型，使TANs具有不同的功能。當TME中含有IFN-β或TGF-β通路被抑制時，TANs表現(xiàn)免疫殺傷及抑癌作用的N1表型。當環(huán)境中富含TGF-β時，TANs表現(xiàn)出免疫抑制及促癌作用的N2表型，其細胞內的基因表達模式也發(fā)生變化，如CCL17、Arg1、MMP9上調[11]。N2中性粒細胞主要通過以下5種途徑實現(xiàn)促癌作用：(1)通過產生ROS、NO，導致體細胞DNA失穩(wěn)，促進腫瘤發(fā)生；(2)通過產生前列腺素E2(PEG2)等促進腫瘤細胞生長；(3)通過產生蛋白酶水解組織結構及抗腫瘤因子利于腫瘤細胞轉移；(4)通過釋放Bv8、基質金屬蛋白酶(MMP-9)等促進腫瘤血管生成；(5)通過上調Arg1、PD-1抑制抗腫瘤免疫[11]。

2 膀胱癌TME中的免疫抑制細胞與腫瘤進展

腫瘤進展的標志之一是免疫抑制TME的形成[12]。在此環(huán)境下，腫瘤細胞逃逸免疫系統(tǒng)的殺傷是腫瘤進展的前提條件。同時，腫瘤細胞還需要和TME中的其他細胞相互作用，提供必備的信號分子和通路。若能夠以免疫抑制細胞為中心，通過抑制這些信號通路，可能為抑制膀胱癌的進展提供新的策略。

2.1MDSCs可促進膀胱癌進展 最新的證據表明，膀胱癌微環(huán)境中的腫瘤細胞或其他細胞能夠誘導MDSCs的募集，發(fā)揮免疫抑制作用，從而促進腫瘤進展。對97例膀胱癌患者的腫瘤組織分析發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL2、MIF及MDSCs表面受體CXCR2的表達上調與更晚的臨床分期有關[13]。膀胱癌細胞通過CXCL2/MIF-CXCR2信號通路誘導MDSCs的募集，隨后MDSCs通過上調抑制性介質的表達，如Arg1、iNOS、ROS、PD-L1和P-STAT3，促進免疫抑制環(huán)境的形成及腫瘤進展[13]。CHEVALIER等[14]發(fā)現(xiàn)固有淋巴細胞2組(ILC2)能夠通過分泌IL-13誘導MDSCs的募集，并上調了Arg1、iNOS和C/EBPβ的表達，顯著抑制T細胞增殖，導致腫瘤進展。MDSCs促進膀胱癌進展的作用是較明確的，但目前研究是以回顧性分析為主，或研究對象主要集中于外周血循環(huán)MDSCs,故仍需要有更多的前瞻性研究來驗證。

2.2TAMs能夠促進膀胱癌進展 目前較多的研究表明，TAMs除介導免疫抑制實現(xiàn)腫瘤免疫逃逸外，還參與腫瘤進展的各個階段。研究者對155例NMIBC患者的腫瘤組織分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞表面高表達的CXCL1能夠促進TAMs和癌癥相關成纖維細胞(CAFs)的浸潤，并與腫瘤轉移相關。TAMs及CAFs能通過產生CXCL1促進膀胱癌的侵襲性，促進癌細胞與兩者之間的黏附。TAMs、CAFs及膀胱癌細胞三者共同建立的荷瘤小鼠中，CXCL1的過表達能夠促進腫瘤的生長[15]。MARTNEZ等[16]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌細胞表達的BMP-4參與了巨噬細胞向M2樣表型的分化，而M2樣巨噬細胞通過產生IL-6、TGF-β、VEGFA等因子促進腫瘤的進展。TAKEUCHI等[17]在21例膀胱癌患者的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)大量TAMs和M2樣巨噬細胞分布，并且TAMs計數(shù)與微血管計數(shù)呈正相關，故推測出TAMs能促進腫瘤血管生成。CHEN等[18]發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA——LNMAT1在淋巴結陽性的患者腫瘤中表達上調，并與淋巴結轉移相關。LNMAT1能夠表觀激活趨化因子CCL2的表達和上調，促進TAMs的募集，TAMs通過分泌VEGFC促進膀胱癌淋巴管的生成及淋巴結轉移。WU等[19]發(fā)現(xiàn)TAMs可通過產生CXCL8，刺激膀胱癌細胞分泌MMP-9、VEGF，從而促進腫瘤細胞的侵襲、遷移及內皮細胞管生成。這些研究表明，TAMs通過與腫瘤細胞及其他間質細胞的相互作用，促進膀胱癌細胞的侵襲、黏附和轉移，促進腫瘤血管及淋巴管生成，從而促進膀胱癌的進展。但目前研究大多基于離體實驗，需要進一步的動物實驗來驗證。

2.3Tregs能夠促進膀胱癌進展 Tregs在正常情況下維持機體免疫穩(wěn)態(tài)，但在TME中，通過誘導Tregs募集，發(fā)揮其免疫抑制功能，促進膀胱癌進展。CCR8是腫瘤組織中Tregs表面重要的趨化因子受體。CCR8能夠通過上調轉錄因子Foxo1和c-MAF的表達，穩(wěn)定Tregs表型及免疫抑制功能，塑造MIBC內的免疫抑制環(huán)境，促進膀胱癌進展[20]。在對犬膀胱癌組織的分析中，腫瘤細胞產生的趨化因子CCL17，能夠與Tregs表面的受體CCR4結合，誘導Tregs向腫瘤組織浸潤，實現(xiàn)免疫抑制功能，導致腫瘤進展[21]。盡管Tregs的免疫抑制作用已較為明確，但仍需要有更多的實驗來支持。

2.4TANs可能與膀胱癌進展有關 目前針對TANs的研究主要集中于動物實驗，或人體循環(huán)中性粒細胞。關于人體腫瘤組織中的TANs研究相對較少。細胞共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞通過上調雄激素受體(AR)信號，使得MMP-13在膀胱癌細胞的表達上調，從而促進膀胱癌細胞的侵襲[22]。由于TANs存在抑癌和促癌作用的兩種表型，鑒于目前有限的研究，TANs與膀胱癌進展的關系需要進一步探索。

3 膀胱癌微環(huán)境中的免疫抑制細胞與抗腫瘤治療

通過靶向膀胱癌微環(huán)境中免疫抑制細胞或信號通路，可作為一種潛在的抗腫瘤治療方式。目前研究多針對MDSCs、TAMs、Tregs這3類免疫抑制細胞，而對TANs暫無明確的治療靶點。推測可能是TANs兩種表型鑒定的困難；其次是中性粒細胞作為機體重要的免疫防御細胞，通過靶向該細胞而實現(xiàn)抗腫瘤作用可能給機體造成嚴重的感染。

3.1抑制MDSCs能夠提高化療及免疫治療療效 單獨靶向MDSCs的抗腫瘤效應是有限的，因此多數(shù)研究致力于靶向MDSCs聯(lián)合傳統(tǒng)治療方式，產生協(xié)同增效作用。對荷瘤小鼠聯(lián)合注射順鉑及MDSCs抑制劑(α-Gr1抗體)能夠協(xié)同減少膀胱癌組織中G-MDSCs的數(shù)量，使得 CD8+T細胞含量增加，顯著抑制腫瘤進展[23]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，RS 504393(一種選擇性的CCL2拮抗劑)能夠抑制M-MDSCs募集,克服吉西他濱耐藥，使得荷瘤小鼠的生存延長[24]。當對鉑類耐藥鼠注射MDSCs抑制劑時，MDSCs數(shù)量明顯減少，而CD8+T細胞的浸潤增加，產生抗腫瘤效應。當MDSCs抑制劑與α-PD-L1聯(lián)合作用于耐藥鼠時，觀察到了顯著的抗腫瘤效應，推測可能是由于MDSCs抑制劑通過增強CD8+T細胞的功能從而提高了α-PD-L1的抗腫瘤療效[25]。靶向MSDCs聯(lián)合其他治療方式的臨床研究已在其他腫瘤中開展(NCT03302247、NCT02991196等)，但針對膀胱癌的臨床研究尚少見報道。

3.2TAMs可作為潛在治療靶點 將膀胱癌細胞及巨噬細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，轉錄因子核因子κB (NF-κB )抑制劑BAY11-7082，能夠通過miR-30a/NF-κB/Snail信號通路，抑制巨噬細胞向M2樣表型分化，從而抑制癌細胞的上皮-間充質轉化(EMT)，降低膀胱癌的侵襲及轉移[26]。有研究者分析了一種TAMs亞型——DC-SIGN+TAMs，其在MIBC患者腫瘤組織中大量表達。與M2表型相似，DC-SIGN+TAMs能夠分泌抗炎細胞因子，表現(xiàn)出免疫抑制及促癌作用。當用中和抗體廢除DC-SIGN+TAMs的功能時，其產生抗炎細胞因子的功能被削弱，并且還能增強PD-1抑制劑介導的CD8+T細胞對膀胱癌細胞的免疫殺傷效應[27]。由于目前針對TAMs的研究主要集中于離體實驗，故其作為治療靶點需要更多的活體實驗來證明。

3.3Tregs可作為潛在的治療靶點 如前所述，CCR8能夠穩(wěn)定Tregs表型而實現(xiàn)免疫抑制功能，阻斷CCR8可使Tregs失穩(wěn)并轉變?yōu)榇嘈员硇?，導致抗腫瘤免疫重新被激活，并進一步提高PD-1抑制劑的療效[20]。在另一項研究中，CCL17-CCR4的結合能夠誘導Tregs的浸潤，當用人源化抗體阻斷CCR4后，異種移植小鼠模型中Tregs的浸潤和腫瘤的生長均受到抑制?；加凶园l(fā)性膀胱癌的犬對CCR4阻斷劑同樣可產生療效應答，使其生存率提高[21]。值得注意的是，因為Tregs在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)的關鍵作用，故研究對象應限定為腫瘤組織中的Tregs，如何特異地靶向TME的Tregs將是今后的努力方向。

4 膀胱癌微環(huán)境中的免疫抑制細胞與患者預后

目前的研究證據顯示，膀胱癌微環(huán)境中的某些免疫抑制細胞具有預后價值，這些細胞包括TAMs、Tregs和TANs。多數(shù)的研究結論傾向于高浸潤水平的TAMs及Tregs與患者預后不良相關，而TANs的預后作用具有異質性。膀胱癌微環(huán)境的MDSCs預后作用尚不明確。

4.1TAMs的浸潤與膀胱癌患者的預后相關 較多的證據提示TAMs的浸潤水平與膀胱癌患者的預后呈負相關，但有少數(shù)的研究得出相反的結論。BOSTR?M等[28]對184例手術后膀胱癌患者進行中位時間達6年的隨訪，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內高水平的M2樣巨噬細胞計數(shù)是術后患者的獨立預后風險因子。而在92例全膀胱切除術后的患者中，腫瘤內高水平的TAMs與更短的腫瘤特異性生存(CSS)及總生存率(OS)相關。YANG等[29]對91例T1高級別膀胱癌患者分析發(fā)現(xiàn)，在60個月的中位隨訪時間內，腫瘤組織內高水平的M2樣巨噬細胞患者腫瘤復發(fā)和進展的風險增高，有更短的無復發(fā)生存(RFS)、無進展生存(PFS)和CSS。TAMs的浸潤水平可能與BCG灌注治療后腫瘤復發(fā)風險相關。99例經BCG治療后的NIMBC患者，BCG治療失敗的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)大量的TAMs，并且占主導的M2樣巨噬細胞集中在腫瘤組織的間質區(qū)域，該類患者具有更短的RFS[30]。71例NMIBC患者術后的腫瘤組織中，高含量的TAMs與BCG灌注治療后更短的RFS或PFS相關[31]。與大多數(shù)研究結論相反的是，有研究對103例MIBC患者腫瘤組織分析發(fā)現(xiàn)，在CD163腫瘤細胞的亞組內，M2樣巨噬細胞高浸潤的患者比低浸潤患者出現(xiàn)淋巴結轉移的風險更低、CSS更長。CD163是巨噬細胞的標志分子，在腫瘤細胞上表達的CD163可能是浸潤的TAMs與其雜交所致，這種雜合腫瘤細胞的DNA修復能力增強，故該類腫瘤中TAMs高浸潤的患者預后反而更好[32-33]。盡管TAMs的預后作用似乎比較明確，但研究仍以回顧性分析為主，因此TAMs的預后價值需要更多的前瞻性研究來驗證。

4.2Tregs的浸潤與膀胱癌患者的預后相關 大多數(shù)研究證實Tregs浸潤程度與膀胱癌患者生存率呈負相關。在攜帶自發(fā)性膀胱癌的犬中，腫瘤浸潤性Tregs與預后不良有關[21]。高水平的CCR8+Tregs與患者更差的OS及RFS有關[20]。在115例NMIBC患者腫瘤組織中，發(fā)現(xiàn)高水平Tregs浸潤的患者有更短的RFS，并且是復發(fā)的獨立預測因子[34]。此外，在腫瘤間質內高水平Tregs浸潤也與BCG灌注治療后患者更短的RFS相關[31]。Tregs對膀胱癌預后的影響可能是通過與腫瘤細胞之間的相互作用實現(xiàn)。膀胱癌細胞表面S1P1的表達水平和Tregs浸潤計數(shù)均與預后呈負相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，S1P1蛋白的上調能夠促進膀胱癌細胞分泌TGF-β和IL-10，從而促進Tregs的生成及遷移[35]。但與大多數(shù)關于Tregs的預后作用研究結果相反的是，腫瘤侵襲前緣的低水平Tregs浸潤，與患者更差的預后相關。深入研究提示，Tregs可能通過抑制膀胱癌細胞及TAMs表達侵襲因子MMP-2，從而降低腫瘤細胞的侵襲性，導致了Tregs在膀胱癌中的積極預后作用[36]。與TAMs研究現(xiàn)狀相似，Tregs的預后價值需要更多的前瞻性研究來驗證。

4.3TANs在膀胱癌中的預后價值具有異質性 在102例膀胱癌患者腫瘤組織中，TANs計數(shù)高的患者更易出現(xiàn)腫瘤復發(fā)，并且OS更短[37]。另一項研究納入3個中心共計666例MIBC患者，發(fā)現(xiàn)TANs浸潤水平越高的患者OS越短。對其中405例來自公共數(shù)據庫的轉錄組表達譜進行基因集富集分析提示淋巴細胞和T細胞激活的兩條通路均富集在TANs低浸潤組，TANs的浸潤與CD8+T細胞的浸潤呈負相關，并且TANs低浸潤組更能從輔助化療中獲益，這提示高浸潤的TANs可能通過免疫抑制及化療抵抗影響了膀胱癌患者的預后[38]。盡管部分研究發(fā)現(xiàn)高水平的TANs與不良預后相關，但仍有研究發(fā)現(xiàn)TANs計數(shù)與預后呈正相關。根據膀胱癌表面特征表達分子將MIBC分為腔內型(Lunimal)和基底型(Basal),發(fā)現(xiàn)基底型膀胱癌組織中有更多的CD66+TANs浸潤，并且高浸潤的TANs與患者預后呈正相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)基底型腫瘤組織中表達高水平的促炎細胞因子(CXCL1、CXCL2、CXCL8)，促進TANs趨化作用[39]。推測此時的TANs因展現(xiàn)出N1表型而發(fā)揮抗腫瘤功能。在BCG治療后可誘導膀胱癌組織內中性粒細胞外陷阱(NET)的形成。NET能夠阻止膀胱癌細胞的存活、遷移及誘導細胞凋亡，并能通過攻擊腫瘤細胞和增加免疫細胞浸潤來抑制小鼠腫瘤的生長。故TANs與預后呈正相關的機制之一可能是NET的形成所致[40]。由于對TANs的研究較少，故對其預后價值需要進一步探究。

5 結 語

免疫治療在早期及晚期膀胱癌患者中均占據重要地位。但無論是對NMIBC患者膀胱內注射BCG，還是對晚期膀胱癌患者應用ICIs治療，都存在較高的失敗率。腫瘤內免疫抑制微環(huán)境的形成是免疫治療失敗的重要機制之一，其中抑制性免疫浸潤細胞發(fā)揮主要作用。本文通過對膀胱癌TME內4種抑制性免疫浸潤性細胞的促癌機制及潛在的治療靶點進行闡述，為提高免疫治療應答提供了新的策略。目前靶向這些細胞聯(lián)合免疫治療的方式在膀胱癌的臨床前實驗中取得一定的療效，但其療效需要在臨床試驗中進一步驗證。目前仍有幾個重要問題亟待解決：一是確立這類抑制性免疫浸潤細胞區(qū)別于其他表型的特異分子標志物；二是聯(lián)合免疫治療時，如ICIs，靶向這類細胞的治療時機和最佳策略。因此，未來需要更多的基礎及臨床研究來探討膀胱癌TME中抑制性免疫浸潤細胞的生物學功能，期待有更多的患者能從免疫治療中獲益。