王繼龍，馮曉莉，魏舒暢*，陳方圓，藺興遙，劉曉霞

敦煌古醫(yī)方大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC指紋圖譜及多指標(biāo)成分測(cè)定研究

王繼龍1, 2，馮曉莉1, 2，魏舒暢1, 2*，陳方圓3，藺興遙2，劉曉霞1

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，甘肅 蘭州 730000 2. 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730207

建立敦煌古醫(yī)方大補(bǔ)腎湯（Dabushen Decoction，DD）標(biāo)準(zhǔn)煎液的HPLC指紋圖譜及指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，并探尋其量值傳遞規(guī)律。制備15批DD標(biāo)準(zhǔn)煎液，建立其HPLC指紋圖譜，明確相似度及峰歸屬，測(cè)定指標(biāo)成分5-羥甲基糠醛、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、五味子醇甲的含量、全方出膏率及其轉(zhuǎn)移率，分析飲片-標(biāo)準(zhǔn)煎液間的量值傳遞關(guān)系。15批DD標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜的相似度均大于0.9，標(biāo)定了28個(gè)共有峰，并指認(rèn)5個(gè)色譜峰（5-羥甲基糠醛、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、五味子醇甲）。指標(biāo)成分5-羥甲基糠醛為1.173～1.404 mg/g，轉(zhuǎn)移率為36.09%～40.79%；甘草苷為2.159～3.413 mg/g，轉(zhuǎn)移率為31.91%～37.41%；肉桂酸為0.317～0.614 mg/g，轉(zhuǎn)移率為32.74%～40.64%；甘草酸為4.175～6.559 mg/g，轉(zhuǎn)移率為20.95%～28.48%；五味子醇甲為0.225～0.275 mg/g，轉(zhuǎn)移率為3.52%～4.29%；出膏率為22.24%～26.75%，轉(zhuǎn)移率為93.14%～111.01%。采用指紋圖譜、多指標(biāo)含量及出膏率相結(jié)合的評(píng)價(jià)模式對(duì)DD標(biāo)準(zhǔn)煎液進(jìn)行量值傳遞分析，科學(xué)合理，系統(tǒng)全面，可為后續(xù)DD的制劑開發(fā)和質(zhì)量控制提供參考。

大補(bǔ)腎湯；標(biāo)準(zhǔn)煎液；HPLC；指紋圖譜；量值傳遞；敦煌古醫(yī)方；5-羥甲基糠醛；甘草苷；肉桂酸；甘草酸；五味子醇甲；出膏率；轉(zhuǎn)移率

敦煌古醫(yī)方大補(bǔ)腎湯（Dabushen Decoction，DD）出自敦煌遺卷《輔行訣臟腑用藥法要》，由熟地黃、淡竹葉、鹽澤瀉、醋五味子、桂枝、干姜、炙甘草7味中藥組成。熟地黃滋陰降火，淡竹葉清心瀉火，鹽澤瀉淡滲利濕，醋五味子益金生水，桂枝溫通經(jīng)脈、散寒止痛，干姜溫脾益氣，炙甘草調(diào)和諸藥，全方“治精氣虛少，腰痛，骨痿，不可行走，虛熱沖逆，頭目眩，小便不利，脈軟而快者”[1]?，F(xiàn)代臨床將其廣泛用于治療腎陰虛型糖尿病、慢性泄瀉及眩暈患者（“腦動(dòng)脈供血不足”“后循環(huán)缺血”“腦梗死”“高血壓病”等疾?。┑难灠Y狀等，療效顯著，服用安全，開發(fā)前景良好[2-9]。

目前，關(guān)于大補(bǔ)腎湯的研究多集中于臨床應(yīng)用療效評(píng)價(jià)方面，主要以傳統(tǒng)湯劑給藥，尚未被開發(fā)成現(xiàn)代制劑，且未見其質(zhì)量控制方面的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究借鑒中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑研制中“標(biāo)準(zhǔn)煎液”“量值傳遞”等概念[10-14]，通過對(duì)敦煌古醫(yī)方大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的指紋圖譜、多指標(biāo)成分的含量及出膏率進(jìn)行研究，并對(duì)其飲片-標(biāo)準(zhǔn)煎液的量值傳遞關(guān)系進(jìn)行分析，以期為后續(xù)大補(bǔ)腎湯的制劑開發(fā)和質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀，包括G1312A泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315B DAD檢測(cè)器，G1316A柱溫箱，美國(guó)Agilent公司；BT125D型十萬(wàn)分之一分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PX5202ZH型百分之一電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；Elix Essential 5超純水系統(tǒng)，美國(guó)默克密理博公司；SONOREX DIGITEC DT1028H超聲波清洗機(jī)，德國(guó)班德林電子有限公司；HH-S28S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠。

1.2 試藥

對(duì)照品5-羥甲基糠醛（批號(hào)111626-202013，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、甘草苷（批號(hào)111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-202021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%）、23-乙酰澤瀉醇B（批號(hào)111846-202006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%）、桂皮醛（批號(hào)110710-202022，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、肉桂酸（批號(hào)110786-200503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%）、五味子醇甲（批號(hào)110857-201815，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；地黃苷D（批號(hào)040005-202101，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），上海鴻永生物科技有限公司；色譜純乙腈，Sigma-Aldrich公司；色譜純甲醇、磷酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠；水為自制超純水。

熟地黃（厚片）、鹽澤瀉、炙甘草、醋五味子、淡竹葉、桂枝、干姜（厚片）飲片各10批均由企業(yè)提供，具體信息見表1。經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉(cāng)主任藥師鑒定為玄參科植物地黃Libosch.的干燥塊根、澤瀉科植物東方澤瀉(Sam.) Juzep.的干燥塊莖、豆科植物甘草Fisch.的干燥根、木蘭科植物五味子(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)的炮制加工品，禾本科植物淡竹葉Brongn.的干燥莖葉、樟科植物肉桂Presl的干燥嫩枝、姜科植物姜Rose.的干燥根莖，均符合《中國(guó)藥典》2020年版一部要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備

《輔行訣臟腑用藥法要》記載的大補(bǔ)腎湯處方及制法為“地黃、竹葉、甘草各三兩，澤瀉、桂枝、干姜、五味子各一兩，上七味以長(zhǎng)流水一斗，煮取四升，溫分四服，日三、夜一服”。經(jīng)文獻(xiàn)考證[15]，東漢時(shí)期1兩相當(dāng)于今之15.4 g，1斗相當(dāng)于2000 mL，1升相當(dāng)于200 mL。取處方量各飲片共200.2 g，加純水2000 mL浸泡1 h，回流提取1 h后300目藥篩趁熱濾過，藥液常壓水浴濃縮至體積為800 mL，即得大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液，標(biāo)準(zhǔn)煎液飲片隨機(jī)組合，見表2。同法制備各單味藥及其陰性煎煮液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜的建立

2.2.1 供試品溶液的制備 精密量取大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液5 mL置于10 mL量瓶中，加入甲醇5 mL使甲醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理10 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，冷藏24 h，上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液。同法制備各單味藥供試品溶液和各陰性對(duì)照溶液。

表1 大補(bǔ)腎湯飲片信息

表2 15批標(biāo)準(zhǔn)煎液飲片組合信息

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取各對(duì)照品適量，加50%甲醇制成含5-羥甲基糠醛116.55 μg/mL、甘草苷147.61 μg/mL、肉桂酸20.24 μg/mL、甘草酸銨223.57 μg/mL、五味子醇甲6.93 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，5%乙腈；5～45 min，5%～47%乙腈；45～65 min，47%～73%乙腈；65～70 min，73%～5%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫35 ℃；體積流量0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取同一標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以甘草酸為參照峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別小于0.5%、1.8%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一標(biāo)準(zhǔn)煎液按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以甘草酸為參照峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別小于1.0%、3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、6、12、18、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，以甘草酸為參照峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別小于1.0%、3.0%，表明標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 取15批大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液，分別按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版本）”，以S15為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1 min，平均數(shù)法生成對(duì)照譜圖，采用多點(diǎn)校正和Mark峰匹配計(jì)算相似度。結(jié)果15批大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液（S1～S15）指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜（R）的相似度分別為0.990、0.989、0.988、0.987、0.992、0.994、0.992、0.991、0.979、0.981、0.988、0.987、0.989、0.987、0.990，均大于0.9，表明15批標(biāo)準(zhǔn)煎液整體相似性均較好，其指紋圖譜疊加圖見圖1。

2.2.8 色譜峰指認(rèn)與歸屬 標(biāo)準(zhǔn)煎液在210 nm波長(zhǎng)下有28個(gè)共有峰，通過與各單味藥供試品溶液、陰性對(duì)照溶液和混合對(duì)照品溶液圖譜的比較，峰7、8、13、14（甘草苷）～16、18、23（甘草酸）、25歸屬于甘草，峰2、10、11歸屬于淡竹葉，峰17、20（肉桂酸）、21歸屬于桂枝，峰26歸屬于干姜，峰27（五味子醇甲）歸屬于五味子，峰3（5-羥甲基糠醛）為地黃和五味子所共有，見圖2、3?？梢姴捎谩?.1”項(xiàng)下工藝制備大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液時(shí)其主要成分從飲片-標(biāo)準(zhǔn)煎液形成較為完整的傳遞，且歸屬關(guān)系較為清晰。

圖1 15批大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC指紋圖譜(S1～S15)與對(duì)照?qǐng)D譜(R)

2.3 指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 色譜條件 檢測(cè)波長(zhǎng)采用280 nm（5-羥甲基糠醛、甘草苷、肉桂酸）和250 nm（甘草酸、五味子醇甲）雙波長(zhǎng)切換法，其他條件同“2.2.3”項(xiàng)。

2.3.2 系統(tǒng)適用性及專屬性 分別取混合對(duì)照品溶液、標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液和各陰性對(duì)照溶液按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果5-羥甲基糠醛、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、五味子醇甲與其相鄰成分之間的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以甘草酸計(jì)不低于740 000，陰性對(duì)照溶液在測(cè)定成分出峰時(shí)間處均無(wú)干擾，表明該方法系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性良好。

3-5-羥甲基糠醛 14-甘草苷 20-肉桂酸 23-甘草酸 27-五味子醇甲，圖3同

圖3 大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液與各單味藥陰性樣品對(duì)照?qǐng)D譜

2.3.3 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用50%甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果分別為5-羥甲基糠醛＝96 417－127.23，＝0.999 9，線性范圍11.65～116.55 μg/mL；甘草苷＝17 995－29.92，＝0.999 9，線性范圍14.76～147.61 μg/mL；肉桂酸＝103 845－24.547，＝0.999 9，線性范圍2.02～20.24 μg/mL；甘草酸＝7 875.3－17.513，＝0.999 9，線性范圍22.36～223.57 μg/mL；五味子醇甲＝32 079－3.873 3，＝0.999 8，線性范圍0.69～6.93 μg/mL；結(jié)果表明，5-羥甲基糠醛、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、五味子醇甲在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算5-羥甲基糠醛、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、五味子醇甲峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.19%、1.15%、1.29%、1.72%、1.28%，RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)煎液S4的供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別于制備后室溫放置0、6、12、18、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算5-羥甲基糠醛、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、五味子醇甲峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.56%、1.81%、2.34%、2.06%、2.79%，RSD均小于3.0%，表明標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)煎液S4，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算5-羥甲基糠醛、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、五味子醇甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD，結(jié)果分別為2.12%、0.83%、2.05%、1.87%、2.36%。RSD均小于2.5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取9份已測(cè)定各指標(biāo)成分含量的標(biāo)準(zhǔn)煎液（S4）2.5 mL置于10 mL量瓶中，各補(bǔ)加超純水2.5 mL，分別以指標(biāo)成分含量的50%、100%、150%加入對(duì)照品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各質(zhì)量濃度平行制備3份。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算5-羥甲基糠醛、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、五味子醇甲的加樣回收率，結(jié)果5種成分的平均加樣回收率分別為99.25%、98.34%、103.77%、102.15%、96.55%，RSD分別為1.70%、2.02%、2.55%、2.27%、2.97%，各指標(biāo)的平均加樣回收率在96.0%～104.0%，RSD均小于3.0%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)煎液指標(biāo)成分含量測(cè)定及量值傳遞關(guān)系研究

按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定15批大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液中5個(gè)指標(biāo)成分的含量，各飲片按《中國(guó)藥典》2020年版進(jìn)行含量測(cè)定[16]，根據(jù)公式轉(zhuǎn)移率＝標(biāo)準(zhǔn)煎液對(duì)應(yīng)飲片中指標(biāo)成分實(shí)際提取量/對(duì)應(yīng)批次飲片中指標(biāo)成分含量，計(jì)算各指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，15批標(biāo)準(zhǔn)煎液中指標(biāo)成分5-羥甲基糠醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.173～1.404 mg/g，平均為1.265 mg/g，轉(zhuǎn)移率為36.09%～40.79%，平均轉(zhuǎn)移率為38.53%；甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.159～3.413 mg/g，平均為2.943 mg/g，轉(zhuǎn)移率為31.91%～37.41%，平均轉(zhuǎn)移率為34.96%；肉桂酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.317～0.614 mg/g，平均為0.436 mg/g，轉(zhuǎn)移率為32.74%～40.64%，平均轉(zhuǎn)移率為36.59%；甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.175～6.559 mg/g，平均為5.498 mg/g，轉(zhuǎn)移率為20.95%～28.48%，平均轉(zhuǎn)移率為25.17%；五味子醇甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.225～0.275 mg/g，平均為0.248 mg/g，轉(zhuǎn)移率為3.52%～4.29%，平均轉(zhuǎn)移率為3.93%。15批標(biāo)準(zhǔn)煎液中5個(gè)指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率均在均值的70%～130%，說(shuō)明在大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備過程中，其指標(biāo)成分從飲片到標(biāo)準(zhǔn)煎液的傳遞較為穩(wěn)定，前期把控好投料飲片的質(zhì)量，可保證標(biāo)準(zhǔn)煎液中指標(biāo)成分含量的小的批間波動(dòng)，滿足批間質(zhì)量基本一致的要求。

2.5 出膏率及其傳遞關(guān)系

分別取“2.1”項(xiàng)下大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液及對(duì)應(yīng)各單味藥煎液，水浴濃縮至稠膏，60 ℃真空干燥，測(cè)得全方標(biāo)準(zhǔn)煎液實(shí)際出膏率和單味飲片出膏率。按公式（理論出膏率＝∑單味飲片出膏率×單味飲片投料量/全方總投料量）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)煎液理論出膏率，以實(shí)際出膏率與理論出膏率的比值作為標(biāo)準(zhǔn)煎液的出膏轉(zhuǎn)移率，見表4。結(jié)果15批大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的實(shí)際出膏率整體上略高于理論出膏率，出膏率為22.24%～26.75%，均值為24.22%，RSD為4.41%；出膏率的轉(zhuǎn)移率為93.14%～111.01%，均值為102.96%。出膏率及其轉(zhuǎn)移率均在均值的±30%范圍內(nèi)波動(dòng)，說(shuō)明大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備工藝較為穩(wěn)定，且不同產(chǎn)地、批次來(lái)源投料飲片對(duì)標(biāo)準(zhǔn)煎液出膏率的影響較小。

表3 飲片-標(biāo)準(zhǔn)煎液中指標(biāo)成分的含量和轉(zhuǎn)移率

表4 標(biāo)準(zhǔn)煎液的出膏率和轉(zhuǎn)移率

3 討論

3.1 流動(dòng)相、柱溫、體積流量的考察

本研究比較了乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫的情況，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，出峰情況良好，峰形及分離度最好。同時(shí)，對(duì)柱溫25、30、35 ℃與體積流量0.8、0.9、1.0 mL/min進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在35 ℃、體積流量0.8 mL/min的條件下各色譜峰分離效果較好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜研究中，依據(jù)各單味藥主要質(zhì)控指標(biāo)的檢測(cè)波長(zhǎng)考察了標(biāo)準(zhǔn)煎液在210、237、250、280、334 nm波長(zhǎng)下的圖譜信息，結(jié)果顯示，210 nm波長(zhǎng)下色譜圖中色譜峰最多，237、250、280 nm波長(zhǎng)下色譜峰相對(duì)較少，但是基線穩(wěn)定，而334 nm波長(zhǎng)下色譜峰很少。綜合考慮為反映大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液成分信息的完整概貌，選用210 nm作為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

在標(biāo)準(zhǔn)煎液指標(biāo)成分的含量測(cè)定中，由于指標(biāo)成分5-羥甲基糠醛的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm、甘草苷為275 nm、肉桂酸為280 nm、甘草酸和五味子醇甲為250 nm，單一波長(zhǎng)無(wú)法滿足5個(gè)指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的要求。為提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，本研究采用280、250 nm雙波長(zhǎng)切換法進(jìn)行檢測(cè)，各指標(biāo)成分峰強(qiáng)度高、分離度好，基線平穩(wěn)，其他成分對(duì)指標(biāo)成分的干擾小。

3.3 指標(biāo)成分的含量測(cè)定分析

本研究建立了5-羥甲基糠醛、甘草苷、肉桂酸、甘草酸和五味子醇甲5個(gè)指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法，初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的多指標(biāo)質(zhì)量控制。本研究尚存在不足之處，即在標(biāo)準(zhǔn)煎液中未檢出熟地黃、鹽澤瀉、桂枝的藥典質(zhì)控指標(biāo)。地黃苷D是《中國(guó)藥典》2020年版熟地黃的質(zhì)控指標(biāo)，但在指紋圖譜研究中未指認(rèn)出該成分。

由于5-羥甲基糠醛是熟地黃和醋五味子的潛在質(zhì)量標(biāo)志物[17-18]，因此建立其定量測(cè)定方法用于控制標(biāo)準(zhǔn)煎液中5-羥甲基糠醛的總含量。桂皮醛是《中國(guó)藥典》2020年版桂枝的質(zhì)控指標(biāo)，但由于其難溶于水、易揮發(fā)且不穩(wěn)定，加之桂枝在處方中占比低，在標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜研究中未指認(rèn)出，這與文獻(xiàn)報(bào)道[19]的桂枝水煎液中桂皮醛的量極低相一致。

23-乙酰澤瀉醇B是《中國(guó)藥典》2020年版澤瀉的質(zhì)控指標(biāo)之一，但由于23-乙酰澤瀉醇B為脂溶性成分，水溶性較差且不穩(wěn)定，遇熱易轉(zhuǎn)化成澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A，最終轉(zhuǎn)化成澤瀉醇A[20]，因此在指紋圖譜研究中亦未指認(rèn)出該成分。對(duì)于未檢出的成分，課題組今后將進(jìn)一步深入研究，力求各藥味均有質(zhì)控指標(biāo)。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)煎液量值傳遞研究

15批大補(bǔ)腎湯標(biāo)準(zhǔn)煎液中五味子醇甲的轉(zhuǎn)移率較低，為3.9%左右，而5-羥甲基糠醛、甘草苷和肉桂酸的轉(zhuǎn)移率相對(duì)較高，其原因在于5-羥甲基糠醛、甘草苷和肉桂酸為水溶性物質(zhì)，轉(zhuǎn)移率較高，而五味子醇甲的極性較小，在水中的溶解度差，用水煎煮的方法對(duì)其提取能力較低，故轉(zhuǎn)移率低。

出膏率及其傳遞結(jié)果中，大多批次標(biāo)準(zhǔn)煎液的實(shí)際出膏率略高于理論出膏率，僅少批次略有降低，其原因可能為：合煎與單煎相比較，合煎時(shí)處方中各單味藥所處環(huán)境的水量遠(yuǎn)大于其單煎時(shí)的加水倍量，物質(zhì)溶出更充分。同時(shí)，合煎時(shí)藥物化學(xué)成分更加復(fù)雜，成分之間的助溶、增溶效果可能更明顯。因此，實(shí)際出膏率偏高。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 王淑民. 敦煌石窟秘藏醫(yī)方 [M]. 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社, 1999: 12.

[2] 李愛國(guó), 李應(yīng)存, 孫超. 李應(yīng)存運(yùn)用《輔行訣》大補(bǔ)腎湯驗(yàn)案舉隅 [J]. 湖南中醫(yī)雜志, 2015, 31(2): 83-84.

[3] 梁永瑞, 李應(yīng)存, 李鑫浩, 等. 李應(yīng)存教授運(yùn)用敦煌大補(bǔ)腎湯治療腎虛型糖尿病經(jīng)驗(yàn)介紹 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2018, 14(8): 132-133.

[4] 劉玲, 李應(yīng)存, 李鑫浩, 等. 李應(yīng)存運(yùn)用敦煌大補(bǔ)腎湯治療慢性泄瀉經(jīng)驗(yàn) [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2018, 14(7): 116-117.

[5] 于曉雯, 李國(guó)強(qiáng), 王中琳. 《輔行訣》大補(bǔ)腎湯加減方治療眩暈臨床觀察 [J]. 成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 40(2): 50-52.

[6] 王興鴻, 何淑明, 殷世鵬, 等. 基于“腎藏精主骨”理論運(yùn)用敦煌醫(yī)方大補(bǔ)腎湯治療糖尿病性骨質(zhì)疏松癥經(jīng)驗(yàn) [J]. 中醫(yī)研究, 2021, 34(5): 75-77.

[7] 李萬(wàn)云, 殷世鵬, 王興鴻. 運(yùn)用敦煌醫(yī)方大補(bǔ)腎湯治療肝腎虧虛型腰椎間盤突出癥的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[J]. 中西醫(yī)結(jié)合研究, 2020, 12(6): 416-417.

[8] 康開彪, 顏春魯, 姚貞宇, 等. 敦煌醫(yī)方大補(bǔ)腎湯對(duì)鎘染毒模型大鼠肝組織細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激的影響[J]. 西部中醫(yī)藥, 2018, 31(3): 12-15.

[9] 顏春魯, 劉永琦, 李盛華, 等. 敦煌醫(yī)方大補(bǔ)腎湯對(duì)鎘染毒大鼠骨和腎功能的影響[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2017, 28(5): 1077-1078.

[10] 葛威, 劉小康, 王康宇, 等. 經(jīng)典名方竹葉石膏湯的物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞分析 [J]. 中草藥, 2021, 52(11): 3239-3248.

[11] 齊琪, 趙玥瑛, 張晴, 等. 經(jīng)典名方小承氣湯的物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(10): 2927-2937.

[12] 洪婷婷, 張鈺明, 楊琳潔, 等. 經(jīng)典名方半夏瀉心湯水煎液的HPLC指紋圖譜及黃芩、黃連量值傳遞研究[J]. 中草藥, 2020, 51(20): 5166-5176.

[13] 許金國(guó), 梅茜, 夏金鑫, 等. 經(jīng)典名方當(dāng)歸四逆湯物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞分析[J]. 中草藥, 2021, 52(21): 6501-6509.

[14] 汪莉, 賈妙婷, 孫天雄, 等. 忘憂安神方標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC指紋圖譜建立及4種成分含量測(cè)定[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2021, 23(3): 536-541.

[15] 邱隆. 中國(guó)歷代度量衡單位量值表及說(shuō)明 [J]. 中國(guó)計(jì)量, 2006(10): 46-48,76.

[16] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2020: 69, 90, 293.

[17] 陳素娟, 聶靜, 張旗, 等. 熟地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2018, 33(9): 2173-2177.

[18] 蘇聯(lián)麟, 李昱, 徐禎, 等. 基于多元統(tǒng)計(jì)分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的五味子醋制前后質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析 [J]. 中草藥, 2019, 50(19): 4643-4653.

[19] 劉沖, 劉蔭貞, 樂智勇, 等. 桂枝飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 [J]. 中草藥, 2017, 48(8): 1577-1583.

[20] 劉德文, 鄧哲, 陳莎, 等. 澤瀉飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià) [J]. 中草藥, 2019, 50(4): 860-867.

Study on HPLC fingerprint and multi-component determination of Dabushen standard decoction

WANG Ji-long1, 2, FENG Xiao-li1, 2, WEI Shu-chang1, 2, CHEN Fang-yuan3, LIN Xing-yao2, LIU Xiao-xia1

1. Gansu Engineering Research Center for Chinese Medicine Pharmaceutical Technology, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Key Laboratory of Dunhuang Medicine, Ministry of Education, Lanzhou 730000, China 3. Gansu Health Vocational College, Lanzhou 730207, China

To establish the HPLC fingerprint and multi-component determination for standard decoction of Dabushen Decoction (大補(bǔ)腎湯, DD), explore the law of its quality value transfer.By preparing 15 batches of standard decoction of DD based on ancient medical records, the HPLC fingerprints were established, the similarity and attribution of common peaks were defined. The index components content and transfer rate of liquiritin, cinnamic acid, glycyrrhizic acid and schisandrin were measured, the ointment rate of the whole prescription were determined, and the transfer analysis of decoction pieces to substance benchmark was performed.In the 15 batches of standard decoction of DD, the similarity of fingerprints was greater than 0.9, 28 common peaks were identified and five chromatographic peaks were identified (5-hydroxymethylfurfural, liquiritin, cinnamic acid, glycyrrhizic acid and schisandrin). The content of 5-hydroxymethylfurfural was 1.173—1.404 mg/g, the transfer rate was 36.09%—40.79%. The content of liquiritin was 2.159—3.413 mg/g, the transfer rate was 31.91%—37.41%. The content of cinnamic acid was 0.317—0.614 mg/g, the transfer rate was 32.74%—40.64%. The content of glycyrrhizic acid was 4.175—6.559 mg/g, the transfer rate was 20.95%—28.48%. The content of schisandrin was 0.225—0.275 mg/g, the transfer rate was 3.52%—4.29%. The creaming rate was 22.24%—26.75%, the transfer rate was 93.14%—111.01%.The evaluation model of fingerprint combined with multi-index content determination and creaming rate was used to analyze the quantity value transfer of standard decoction, which was scientific, reasonable and systematic, and could provide reference for the subsequent development and quality control of DD.

Dabushen Decoction; standard decoction; HPLC;fingerprint; quality value transmitting; Dunhuang ancient medical prescription;5-hydroxymethylfurfural; liquiritin; cinnamic acid; glycyrrhizic acid; schisandrin; creaming rate;transfer rate

R286.02

A

0253 - 2670(2021)23 - 7176 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.011

2021-06-22

甘肅省基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項(xiàng)目（1506RJIA034）；甘肅省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（21JR1RA273）；甘肅省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升項(xiàng)目（2019A-079）；甘肅省高等學(xué)校創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2021A-320）；敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（DHYX19-15）

王繼龍，男，講師，博士研究生，從事中藥新劑型、新制劑及制藥新技術(shù)研究。E-mail: wjl8013@163.com

魏舒暢，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新劑型、新制劑及制藥新技術(shù)研究。

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]