茍喜蘭，魏 芬，王嗣岑(西安交通大學藥學院，西安 710061)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由β屬單鏈包膜RNA病毒引起的嚴重呼吸道綜合征，因其極強的傳染性已成為全球性的公共健康問題。對COVID-19的治療，目前主要包括小分子藥物、生物類藥物、疫苗和植物藥[1]。小分子藥物主要以傳統抗病毒藥物如利巴韋林、瑞德西韋等為主，源于病毒基因組的相似性，小分子藥物具有良好的臨床療效，但其生物安全性數據缺乏，在治療過程中存在QT間期延長(QT指心室除極和復極激動時間)、慢性腎損傷等不良反應[2-3]。生物類藥物以單克隆抗體和恢復者血漿抗體為代表，托珠單抗通過靶向抑制白細胞介素-6(IL-6)受體活性而阻斷炎癥反應，減輕患者的心血管損傷、淋巴細胞綜合征等，高滴度抗體血清能明顯改善患者的疾病進程，但單克隆抗體的持續(xù)使用會增加菌血癥感染風險，同時高滴度抗體血漿較難滿足[4-6]。疫苗是由滅活病毒誘導機體免疫系統早發(fā)性產生抗體等免疫物質進而降低疾病發(fā)生率的一種治療方式，目前已有包括輝瑞、國藥以及科興等不同醫(yī)藥公司的疫苗投入市場，考慮到病毒基因組的不斷變異，其有效性和安全性有待評估。

植物藥具有悠久的用藥歷史，衍生出了包括中醫(yī)、阿育吠陀、漢方醫(yī)學和韓醫(yī)學在內的多個分支，其對于傳染病的治療可追溯至周朝，植物藥具有完整的理論體系和豐富的臨床經驗[7]。在COVID-19疫情防治中，植物藥如蓮花清瘟膠囊、血必凈注射液以及清肺排毒湯、麻杏石甘湯等被應用于COVID-19的治療，取得了良好的治療效果。然而，植物藥成分復雜，作用機制不明確，安全性隱患制約了其進一步的應用和推廣[8-9]。同時，植物藥中化學物質具有結構新穎及獨特藥理作用等特點，為發(fā)現新的候選藥物提供了巨大而寶貴的資源。因此，從植物藥中篩選先導化合物，兼具有效性和安全性，對抗COVID-19創(chuàng)新藥物的研發(fā)具有重要意義。目前對于COVID-19中植物藥的研究以網絡藥理學、分子對接、分子動力學和成藥性評價等多種篩選方法與蛋白印跡、空斑實驗和細胞活性測試等藥理方法相結合為主，集中在物質基礎的解析和治療機制的闡釋等方面[10-13]，旨在尋找能有效治療COVID-19的先導化合物。

1 以生物活性蛋白質為基礎的藥物篩選

蛋白質相互作用如酶-底物、受體-配體、抗原-抗體等在生物體的新陳代謝、信息交流以及生長發(fā)育中具有重要作用，是機體維持內穩(wěn)態(tài)的重要條件。在COVID-19的發(fā)生發(fā)展中，新型冠狀病毒與靶細胞的相互作用，是疾病診斷和治療的基礎，新型冠狀病毒的黏附、滲透以及釋放都直接影響疾病進程，是藥物研發(fā)的重要靶標。

1.1以病毒抗原為靶標的藥物篩選 對新型冠狀病毒進行病原學解析，其主要有刺突蛋白S蛋白，衣殼蛋白E蛋白，膜蛋白M蛋白以及核蛋白N蛋白。S蛋白主要與靶細胞ACE2受體結合可進一步解析為負責識別的S1片段和負責跨膜融合的S2片段[14]，是目前研究最多的病毒蛋白。芳香療法利用藥物的氣味進行疾病的治療，在印度具有漫長的應用歷史。最近有一項研究以病毒S蛋白為靶點，利用分子對接的手段，對揮發(fā)油類物質進行篩選得到了如百里香酚等多種酚類小分子物質，后者具有消毒殺菌作用，由于空氣傳播和接觸傳播是新型冠狀病毒蔓延的重要途徑，篩選得到的化合物有望以空氣清洗劑、消毒劑等多種形式用于COVID-19的預防[15]。此外，對黃酮類化合物以S蛋白為靶標進行分子對接的虛擬篩選，得到了以槲皮苷為代表的多個化合物，分子對接模型表明，其可與S蛋白的多個殘基成鍵，推測槲皮苷類黃酮化合物可能通過預先結合S蛋白而阻礙S蛋白對靶細胞的識別而發(fā)揮抗病毒效應[16]。

1.2以病毒酶為靶點的藥物篩選 新型冠狀病毒是包膜的單鏈RNA病毒，隸屬于β冠狀病毒屬，盡管其基因組與其他冠狀病毒如重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS CoV)享有較高同源性，但致病能力和傳播速度卻相距甚遠，基因的變異和病毒的多樣化切割是導致這一現象的主要原因。酶是參與病毒蛋白質切割的重要活性物質，通過將多蛋白進行不同位點的切割產生功能不同的非結構蛋白，后者參與病毒RNA的復制、翻譯以及病毒顆粒的組裝等多個過程。M蛋白酶即3 CL蛋白酶(糜蛋白樣蛋白酶)，主要作用于亮氨酸-谷氨酰胺(絲氨酸-丙氨酸-甘氨酸)位點，與RNA剪接翻譯、加工及細胞調控等多個過程相關，在生理條件下還能對宿主蛋白進行切割，通過干擾宿主的轉錄翻譯等促進自身增殖，是藥物研發(fā)的重要靶點[14]。以M蛋白酶為靶標建模對不同數據庫進行篩選，Gurung A B等[17]得到了萜類化合物bonducellpin D和caesalmin B，而Aanouz I等[18]得到了地高辛、β-桉葉油脂、藏紅花素等化合物，證明M蛋白酶是篩選治療COVID-19活性化合物的有效靶點；進一步結合分子動力學模擬，Tahir Ul Qamar M等[19]在篩選了32 297個化合物后列出了結合力較強的包括楊梅苷、迷迭香酸甲酯在內的9個活性化合物。除M蛋白酶外，RNA聚合酶也可作為藥物篩選的有效靶點，Singh S等[20]利用此靶點對天然多酚類化合物進行篩選，得到了沒食子酸酯、茶黃素苷等8個活性化合物。Lung J等[21]篩選得到了茶黃素，并進一步計算得到茶黃素對RNA聚合酶的鍵合自由能為-9.11 kcal·mol-1，提示其有望成為治療COVID-19的先導化合物。

1.3以靶細胞受體為靶點的藥物篩選 新型冠狀病毒以血管緊張素轉化酶2(ACE2)受體為靶點，通過自身S刺突蛋白對其特異性識別，進一步失去刺突蛋白S1片段而與靶細胞細胞膜融合，在跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)跨膜蛋白的介導下進入細胞內，實現病毒體的復制與增殖。同時，由于ACE2受體在機體不同器官和組織的廣泛分布，新冠病毒可引起如心臟、脾臟等多器官的功能性損傷，導致心血管損害、淋巴細胞減少癥等多種嚴重并發(fā)癥，惡化疾病進程和預后[22-23]。因此，研發(fā)ACE2與TMPRSS2的抑制劑是COVID-19治療藥物研究的有效策略。以ACE2受體為靶點，利用分子對接，對來自阿爾及利亞西北部的輪葉金雞菊進行篩選，得到了異麝香草酚，對黑種草進行篩選，得到了對苯二酚，進一步對得到的候選化合物進行藥代動力學、生物利用度等分析，發(fā)現兩者均對ACE2具有較高的結合活性和穩(wěn)定性，有望成為治療COVID-19的先導化合物[24-25]。醉茄酮和醉茄素A是以TRANSS2蛋白為靶點，通過分子對接、分子動力學篩選南非醉茄而得到的2種化合物，將其與表達有TMPRSS2的人乳腺癌(MCF7)發(fā)生作用，發(fā)現醉茄酮不僅能占據TMPRSS2的催化位點，阻止病毒粒子的黏附，還可以下調TMPRSS2蛋白的表達量而正向循環(huán)抑制病毒對靶細胞的入侵[26]。

2 以類藥性為基礎的藥物篩選

類藥性是指化合物成為藥物的可能性，一般用Lipinski′s于1997年提出的五原則衡量：相對分子質量≤500道爾頓，lgP(P為化合物在正丁醇和水體系中的油水分配系數)≤5，氫鍵供體≤5，氫鍵受體≤10，化合物的可旋轉鍵數量≤10。相較同一類化合物的數據庫篩選，類藥性原則的使用在對化合物結構差異較大的數據庫進行篩選時具有明顯的優(yōu)勢，可有效節(jié)約時間和成本，比如直接排除某些親水性差的化合物諸如石油醚類、鞣質類等[16-17]。在一項通過文獻挖掘尋找靶向新型冠狀病毒M蛋白酶的研究中，類藥性的使用可直接將候選化合物從38個排除到10個，顯著縮短了篩選時間[17]。此外，在對黑胡椒、丁香和姜篩選抗新型冠狀病毒化合物時，類藥性原則的應用以已有的化合物阿巴卡韋和羥氯喹為基準，有效避免了對某些化合物如阿魏酸的誤判，同時，將3種植物中總的候選化合物種類降到20種[27]，大幅度降低了后期藥理活性實驗的成本。

3 以代謝安全性為主的藥物篩選

藥物在體內的代謝過程直接影響藥物作用的效果，化合物的吸收、分布、代謝、排泄(absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME)是決定其成藥性的關鍵。ADME通常以人結腸腺癌-2細胞系(Caco2)的通透性和人腸道吸收值(HIA)對藥物的體內生物利用度進行衡量。以槲皮素為例，篩選發(fā)現其對新型冠狀病毒S蛋白具有潛在效應，通過ADME預測發(fā)現，口服槲皮素后體內血藥濃度明顯低于鼻噴霧給藥后，故推薦給藥方式為噴霧劑會獲得更好的療效[28]。穿心蓮內酯是一種對病毒M蛋白具有潛在活性的化合物，通過ADME分析發(fā)現，其對細胞色素P450等多種代謝酶無作用，不與抗糖尿病藥物、心血管疾病藥物發(fā)生相互作用，有望用于患有慢性疾病的COVID-19患者的治療[29]。ADME測試除可用于后期化合物類藥性測試外，還可參與先導化合物的前期篩選。在一項以病毒蛋白酶M為靶點的虛擬篩選中，通過文獻搜索建立抗病毒化合物數據庫，得到115個潛在的抗病毒化合物，經ADME預測后，排除102個不符合代謝安全要求的化合物，使候選化合物數量降低到13個，極大降低了時間和精力成本，即ADME是一種有效的藥物篩選方法[30]。

4 以結合穩(wěn)定性為主的篩選

動力學模擬(molecular dynamics，MD)通過計算機虛擬靶標在不同構象下與目標化合物的結合狀態(tài)并計算結合能，可用于判斷化合物與靶標的結合方式，推測化合物-靶標/化合物-活性靶標殘基的穩(wěn)定性構象。通過計算候選化合物與靶標蛋白的結合能，一定程度上可以推斷結合力的強弱并對化合物的靶標效應進行預測。在對COVID-19的候選化合物進行分析時，動力學模擬可被用于判斷或驗證目標化合物的結合位點，如在考察地高辛與病毒E蛋白的作用機制時，其結合復合物骨架C原子的位置在20 ns時不再變化而保持穩(wěn)定，且在形成復合物時E蛋白的氨基酸殘基二級構象波動小于0.25 nm，可推測地高辛對病毒E蛋白具有較高的結合穩(wěn)定性，且其結合方式為與Thr35形成氫鍵，與其他研究結果一致[31]。同時，動力學模擬還可用于藥物設計，利用臨床有效藥物尋找可能的靶標結合位點，通過結合能大小對靶標進行網絡化篩選，可以得到潛在的具有藥理活性的靶標官能團，為基于活性基團的藥物設計提供依據；當活性靶標確定后，通過系列化合物對其進行結合能分析，可以進行基于結構的藥物設計和開發(fā)。此外，密度泛函理論(DFT)以化合物的分子軌道能量受到其結合狀態(tài)影響為理論基礎，通過計算靶標在結合不同化合物后的分子軌道能量變化，進而對化合物的結合活性進行預測，在藥物篩選方面有廣闊的應用前景[15]。

5 體外藥理學篩選

由于COVID-19的突發(fā)性和傳播迅猛的特點，前期的研究大都以虛擬篩選和計算機輔助為主要手段，雖高效快速地得到了例如茶黃素、槲皮素等潛在先導化合物，但缺乏體內外藥理實驗，限制了其臨床的進一步使用[21]。在后期的研究中，一些體外藥理實驗例如Western blot、MTT、劃痕愈合實驗和空斑形成實驗等被廣泛應用于COVID-19的藥物研發(fā)[26，32]。在闡明麻杏石甘湯預防性治療COVID-19的機制中，前期采用網絡藥理學方法篩選得到了105個活性化合物、83個潛在靶標和63個相關通路，進一步結合IL-6誘導的小鼠肺表皮細胞損傷程度分析和Western blot蛋白表達狀況分析，推測得到了苦杏仁苷對主要靶標通路如IL-6相關的JAK-STAT等具有抑制作用，有望成為治療COVID-19的活性化合物[33]。此外，在對連花清瘟膠囊和熱毒寧注射液的臨床效果進行評價時，均采用了vero E6細胞結合蛋白含量分析的方法，為其臨床實驗奠定了基礎[32，34]。盡管體外實驗相對虛擬篩選具有更高的藥理學應用價值，但考慮到實驗周期長、影響因素多及成本高等特點，其多用于化合物的后期藥理活性驗證。

6 臨床實驗篩選

COVID-19與非典型性肺炎、中東呼吸綜合征等在病原體、臨床癥狀上的相似性為其早期經驗性治療奠定了基礎，瑞德西韋、氯喹及地塞米松等先前用于其他病毒的藥物直接進入了不同規(guī)模的臨床試驗階段[2]。在一項涉及多地區(qū)的包含1 062個COVID-19患者的隨機雙盲試驗中，服用瑞德西韋的患者較對照組表現出更慢的疾病進程、更短的住院時間以及更低的死亡率，推測得到瑞德西韋治療COVID-19的有效性[35]。氯喹是一類具有悠久歷史的抗病毒藥，對其進行結構改造后的磷酸氯喹具有較低的心血管不良反應率，當其用于COVID-19患者的治療時，患者肺部損傷明顯改善，核酸檢測病毒轉陰率提高，住院時間顯著縮短，已被納入COVID-19臨床治療指南(第八版)。地塞米松作為一種糖皮質激素類免疫抑制劑，在抑制細胞因子風暴方面效果明顯，當其應用于治療COVID-19時，可明顯降低需要體外膜肺氧合(ECMO)等機械通氣患者的死亡率，被有條件地納入美國食品藥品管理局(FDA)重癥COVID-19患者的治療方案[36-37]。臨床試驗是篩選COVID-19治療藥物最為直接有效的方式，但其需要以候選藥物具有高度的安全有效性數據為基礎，常作為藥物大規(guī)模上市之前的人體安全性和有效性考察。

7 其他方法

除上述方法外，還有包括Meta分析、數據挖掘等文獻計量學方法可用于快速的靶標化合物篩選，如姜黃素的抗病毒效果可通過文獻計量學得到，而清肺排毒湯中的多糖被認為是有效成分則源于對多糖的藥理學研究[38-39]。

COVID-19是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的以下呼吸道嚴重感染為主要癥狀的復雜疾病，其流行病學調查顯示，年齡、慢性疾病、機體營養(yǎng)狀態(tài)均是感染的促進因素[40-41]，而心血管疾病、免疫系統損傷是常見的并發(fā)疾病[42-45]，COVID-19疾病進程的復雜性要求系統性、綜合性的治療方案。植物藥具有悠久的用藥歷史，多成分、多靶點的物質基礎優(yōu)勢和系統性、整體性的治療優(yōu)勢使其成為復雜疾病治療的有效策略和優(yōu)選方案[46]。在抗COVID-19藥物的研發(fā)中，以植物藥為基礎進行候選藥物的發(fā)掘和優(yōu)化具有重要意義。本文綜述了植物藥用于COVID-19藥物研發(fā)的幾種主要策略，以生物活性蛋白為靶標的藥物篩選，基于化合物類藥性、成藥性、體內代謝安全性和化合物對靶標的結合穩(wěn)定性為基礎的藥物篩選，以體外藥理實驗為基礎的藥物篩選和臨床實驗篩選等多種藥物篩選手段，旨在為從植物中發(fā)掘得到高效、安全的治療COVID-19藥物提供一定的思路和方法。