李韋瑤 秦立剛

摘要 蔥屬植物是百合科具有較高的飼用、食用及觀賞等經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的重要植物資源，開發(fā)利用及深入研究?jī)r(jià)值潛力巨大。總結(jié)分析了蔥屬植物組培快繁過(guò)程中出現(xiàn)的關(guān)鍵問(wèn)題，詳細(xì)闡述了蔥屬植物組培過(guò)程中從外植體選擇、培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、生根培養(yǎng)和煉苗移栽等環(huán)節(jié)的研究現(xiàn)狀，并對(duì)存在的問(wèn)題及發(fā)展前景進(jìn)行了展望，為蔥屬植物的組培體系構(gòu)建、優(yōu)化及其深入研究提供參考。

關(guān)鍵詞 蔥屬植物;組織培養(yǎng);外植體;生根培養(yǎng);植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑;再生體系

中圖分類號(hào) S633? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）22-0029-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.006

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research Progress on Tissue Culture Regeneration System of Allium L.

LI Wei-yao，QIN Li-gang （College of Animal Science，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030）

Abstract Allium L.is an important family of Liliaceae plant with high economic and ecological value，such as edible，medicinal and ornamental，which has great potential for development，utilization and in-depth research.This article summarized and analyzed the key problems in the process of tissue culture and rapid propagation of Allium L..The research status of explant selection，medium，plant growth regulating substances，rooting culture and seedling refining and transplanting in the process of Allium L. tissue culture were reviewed in detail，and the existing problems and development prospects were prospected，in order to provide references for the construction，optimization and further study of the tissue culture system of Allium L..

Key words Allium L.;Tissue culture;Explant;Rooting culture;Plant growth regulator;Regeneration system

蔥屬植物（Allium L.）為百合科多年生草本植物，是單子葉植物綱百合科中最大的屬之一[1]。全球約有660個(gè)種，大多數(shù)種分布于季節(jié)性干旱地區(qū)，廣泛分布于北半球，亞洲居多，部分分布于非洲和中南美洲[2]。在我國(guó)，蔥屬植物共包括138個(gè)種、23個(gè)變種及2個(gè)亞種[3]，主要分布在東北、華北、西北和西南地區(qū)的高山平原、草甸、草原、荒漠、沙丘等環(huán)境[2]，并且其適應(yīng)性較強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抗旱性，可在干旱半干旱地區(qū)的植被恢復(fù)中進(jìn)行廣泛應(yīng)用[4]。蔥屬植物資源豐富、形態(tài)多樣，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可作為飼料作物、調(diào)料作物、草藥作物和裝飾用植物[5]。

一直以來(lái)，蔥屬類植物多被作為蔬菜、藥用和飼草飼料，在農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)及醫(yī)藥業(yè)方面均具有重要作用。有研究表明，蔥屬植物活性成分具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[6]，如蔥屬植物中的許多生物活性成分（多糖、黃酮、類黃酮和多酚）具有較好的清除自由基的作用，從而能夠表現(xiàn)出良好的抗氧化功能[7-9]。蔥屬植物還有抑制病菌的功能，如埃及紅蔥的甲醇提取物、乙酸乙酯提取物和丁醇提取物對(duì)成人血吸蟲曼氏蠕蟲具有顯著的抑制作用，表現(xiàn)出較好的抗血吸蟲功效[10]，并且與其他植物間套作可以降低植物病蟲害發(fā)生，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[11]。蔥屬植物中的不少品種也可以藥用，如大蒜可以增強(qiáng)仔豬的免疫力，并減少腹瀉[12];洋蔥皮乙醇提取物可以改善血糖和葡萄糖的餐后峰值，延緩碳水化合物的吸收[13]。蔥屬植物功能性成分可以通過(guò)免疫器官、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，維持機(jī)體生理動(dòng)態(tài)平衡與相對(duì)穩(wěn)定[14]。

鑒于蔥屬植物資源功能作用豐富，國(guó)內(nèi)外部分學(xué)者對(duì)蔥屬植物的組培體系建立方面也進(jìn)行了一定的探索和試驗(yàn)。筆者通過(guò)對(duì)蔥屬植物組培過(guò)程中外植體選擇、培養(yǎng)基選擇、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及煉苗移栽等方面進(jìn)展進(jìn)行綜述，對(duì)其組織培養(yǎng)體系的研究進(jìn)展進(jìn)行了初步整理，以期為蔥屬植物組織培養(yǎng)、開發(fā)利用及分子生物學(xué)研究提供依據(jù)。

1 外植體

1.1 外植體選擇

植物組織培養(yǎng)主要基于植物細(xì)胞全能性和再生理論，在培養(yǎng)過(guò)程中，由于分化程度不同植物不同組織的脫分化恢復(fù)分裂能力和形成愈傷組織的再分化能力也有所差別[15]。不同的外植體對(duì)再生體系的建立具有重要影響，主要是由于外植體的生長(zhǎng)部位、生理狀態(tài)具有顯著的差異，進(jìn)而造成了愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和不定芽生根等過(guò)程中的結(jié)果差異巨大。因此，在蔥屬植物組織培養(yǎng)體系建立的過(guò)程中，選擇合適的外植體是體系建立成功與否的關(guān)鍵因素。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)愈傷組織僅在根尖分生組織區(qū)域形成[16-19]，也有研究表明愈傷組織的形成和芽再生均勻分布在根段[20-21]。已有研究發(fā)現(xiàn)，蔥屬植物的莖段、葉片、鱗莖、根、莖尖等部位均可以作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。

莊丹[22]以寒蔥的根、莖、葉分別作為外植體進(jìn)行增殖、繼代及生根，發(fā)現(xiàn)寒蔥的莖是生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的最佳外植體。在對(duì)薤白的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，組織培養(yǎng)植物在根中表現(xiàn)出的活性比在葉中觀察到的活性更高[23]。胡小京等[24]以大蒜莖尖為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芽的增殖并獲得了較好的效果，表明莖尖可作為大蒜快速繁殖的有效外植體。而在大蒜的組織培養(yǎng)研究中，分生組織外植體比莖尖外植體更成功[25]。高行英[26]使用韭菜胚根尖的不同部位誘導(dǎo)愈傷組織分化，結(jié)果表明胚根尖為誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體。王立科等[27]研究發(fā)現(xiàn)以蒙古韭鱗莖部位為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，只有靠近綠色葉片的一端可以誘導(dǎo)愈傷組織，并不是兩端都可以生長(zhǎng)愈傷組織。何林玉等[28]以洋蔥鱗莖盤、種子、未開花薹、未開花蕾為外植體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鱗莖盤和花薹愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%，而且鱗莖盤和花薹的污染率也較低。

1.2 外植體消毒

在植物組織培養(yǎng)中，獲得無(wú)菌外植體是成功的重要前提。為獲得無(wú)菌外植體，消毒是必要環(huán)節(jié)，通常可采用75%乙醇、升汞、次氯酸鈉等試劑對(duì)外植體進(jìn)行消毒。次氯酸鈉一般用于一些較軟或者較幼嫩的組織消毒，消毒時(shí)間一般在5～30 min。升汞滅菌效果最好，一般用于種子、塊根、塊莖及較硬組織的滅菌，但其殘留液很難去除，而且對(duì)植物組織的傷害也較大，因而必須嚴(yán)格控制好時(shí)間，并且要進(jìn)行多次沖洗[29]。通常為75%乙醇和0.1%升汞交叉使用對(duì)外植體進(jìn)行滅菌[30-31]。75%乙醇能夠順利滲入到細(xì)菌體內(nèi)，吸收細(xì)菌蛋白水分，使其脫水變性凝固而失去功能，達(dá)到殺菌目的。0.1%升汞能使蛋白質(zhì)變性，達(dá)到滅菌作用[32]。在洋蔥組培試驗(yàn)中，對(duì)外植體鱗莖盤使用75%乙醇處理50 s和0.1%升汞處理7 min，可控制污染率至2%，并使轉(zhuǎn)綠率達(dá)85%;對(duì)莖尖用75%乙醇處理50 s和0.1%升汞處理5 min，可控制污染率至7%，轉(zhuǎn)綠率達(dá)86%[33]。在對(duì)寒蔥外植體消毒時(shí)，首先使用自來(lái)水沖洗外植體5 min，后用75%乙醇浸洗30 s，然后利用0.1%升汞滅菌10 min，最后用蒸餾水沖洗4～5次，可以達(dá)到最佳的消毒效果[22]。孔素萍[34]在大蒜的組培快繁研究中對(duì)外植體進(jìn)行消毒的過(guò)程為：將大蒜鱗莖內(nèi)健康的鱗芽去皮，經(jīng)自來(lái)水沖洗0.5～1.0 h后，在無(wú)菌條件下先用75%乙醇消毒1 min，再用0.1%次氯酸鈉溶液消毒3 min，最后用無(wú)菌水沖洗3遍。李勇等[35]在韭菜的組培快繁研究中，先用清水洗凈韭薹上的塵土，再用毛筆蘸肥皂水將其洗干凈，流水沖洗2～4 h后，在超凈工作臺(tái)上使用75%乙醇浸泡30 s消毒，再用0.1%的升汞溶液浸洗8 min，最后無(wú)菌水沖洗6～8次。眾多研究表明，雖然消毒時(shí)間及具體操作有所差別，但采用75%乙醇和0.1%升汞交叉消毒是蔥屬植物外植體消毒最常用的方法。

2 培養(yǎng)基

植物組織生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)均由培養(yǎng)基提供，植物組織在不同培養(yǎng)階段有不同的營(yíng)養(yǎng)需求，而各種培養(yǎng)基所含無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)物不同，其種類和成分直接影響組培苗的生長(zhǎng)[36]，因此選擇合適的培養(yǎng)基對(duì)植物組織培養(yǎng)有重要意義。蔥屬植物的常用培養(yǎng)基有Murashige and Skoog（MS）、1/2MS、Knudson C（KC）、Gamborg（B5）等（表1）。

不同種的蔥屬植物不同部位的最適培養(yǎng)基不同，這可能是與植物種不同有關(guān)。但常用培養(yǎng)基多為MS培養(yǎng)基，其對(duì)蔥屬植物愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖有較好效果。另外，F(xiàn)ereol等[42]研究發(fā)現(xiàn)每14 d更新一次培養(yǎng)基是細(xì)胞繁殖和胚進(jìn)一步再生的最佳條件。

3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)芽、根誘導(dǎo)和增殖分裂起關(guān)鍵作用[43]。蔥屬植物再生體系建立中通常使用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有吲哚丁酸（Indole-3-butytric acid，IBA）、6-芐基腺嘌呤（6-Benzyladenine，6-BA）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、萘乙酸（Naphthalene acetic acid，NAA）、 4-二氯苯氧乙酸（ 4-dichloro phenoxyacetic acid， 4-D）和激動(dòng)素（Kinetin，KT）等。IBA、IAA、NAA和 4-D屬于生長(zhǎng)素類，在組織培養(yǎng)中被用于誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化。6-BA和KT為細(xì)胞分裂素類，其作用主要是促進(jìn)細(xì)胞分裂和使愈傷組織分化或器官分化不定芽。生長(zhǎng)素單獨(dú)使用或與細(xì)胞分裂素配合使用可以有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖和持續(xù)生長(zhǎng)，從而更利于形成愈傷組織。莊丹[22]在寒蔥的組培研究中發(fā)現(xiàn)NAA濃度與誘導(dǎo)率成正比，NAA濃度為1.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率最高，高于此濃度則抑制誘導(dǎo)率;在此NAA濃度下，配合使用6-BA且濃度為2.0 mg/L時(shí)可進(jìn)一步提高誘導(dǎo)率并達(dá)到最高，因此，寒蔥莖部誘導(dǎo)愈傷組織的最適合的激素組合為2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA。張松等[44]研究發(fā)現(xiàn)韭菜在MS培養(yǎng)基上，添加1 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，不定芽誘導(dǎo)頻率最高，平均出芽數(shù)也最多。野生蒙古韭的鱗莖作為外植體接入誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基MS+1 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA中，經(jīng)培養(yǎng)可萌發(fā)愈傷組織和叢生芽[27]。Monemi等[45]對(duì)韭菜的組織培養(yǎng)研究表明，葉片外植體愈傷組織形成的最佳培養(yǎng)基激素組合為0.5 mg/L ?4-D+0.1 mg/L 6-BA。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA時(shí)分蘗洋蔥組培苗可獲得最佳效果[46]。洋蔥愈傷分化叢生芽的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;在MS+1.5 mg/L IBA+0.01 mg/L NAA培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出白色健壯根[47]。當(dāng) 4-D濃度為1 mg/L時(shí)，大蒜鱗芽誘導(dǎo)率隨NAA濃度的增加而降低，當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)率隨 4-D濃度的增加而增加，但 4-D濃度超過(guò)1.25 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率反而不再上漲[48]。同時(shí)有研究表明洋蔥根與 4-D接觸時(shí)間較長(zhǎng)會(huì)有中毒的趨勢(shì)[49]。在大蒜的離體再生中，根尖外植體最適合在添加5.0 mg/L 6-BA和0.5 mg /L NAA的MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)[50]，當(dāng)NAA和KT濃度相同時(shí)NAA誘導(dǎo)率較高，說(shuō)明KT和NAA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)有協(xié)同作用，并且相關(guān)數(shù)據(jù)表明，KT比6-BA更適合誘導(dǎo)不定芽[51]。

不同種的蔥屬植物，最佳培養(yǎng)基激素組合及比例都不相同，這可能是與植物種不同有關(guān)，但常用的組合及比例為MS+1 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA。雖然這是一個(gè)比較常用的組合比例，針對(duì)不同蔥屬不同種，在構(gòu)建組培體系時(shí)，仍需要進(jìn)行激素的種類和比例的摸索，找到適宜于該種或者品種的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合及含量比例。

4 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)最主要是把不定芽從增殖改成不增殖，從而分化不定根，這個(gè)階段必須創(chuàng)造一個(gè)適于根的發(fā)生和生長(zhǎng)的條件，主要措施是降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)離子的濃度及加入生長(zhǎng)素[52]。相對(duì)其他植物而言，蔥屬植物通常易于生根和馴化[1 53-55]。植物組織培養(yǎng)中，組培苗能否生根是再生體系能否建立的關(guān)鍵，影響組培苗生根的因素很多，植株的生理狀態(tài)、培養(yǎng)基、植物激素和環(huán)境因子等，激素是其中最重要的調(diào)節(jié)因子，植株生根常用的生長(zhǎng)激素有NAA、IAA、IBA等[56]。趙麗華[57]在洋蔥組培快繁技術(shù)研究中采用1/2MS培養(yǎng)基加IBA進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有加IBA的1/2MS培養(yǎng)基雖然有不定根形成，但加IBA培養(yǎng)基的平均生根率及平均生根數(shù)都優(yōu)于不加IBA的培養(yǎng)基，且在IBA濃度為1.0、1.5 mg/L時(shí)最高，表明適當(dāng)濃度的生長(zhǎng)素可以促進(jìn)側(cè)根的生長(zhǎng)。在分蘗洋蔥組培苗生根率的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加0.01 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA+0.1 mg/L多效唑（PP333）分蘗洋蔥組培苗生根率最高，表明低濃度NAA和一定濃度配比IBA、PP333的組合最有利于分蘗洋蔥組培苗的生根[47]。在韭菜植株生根培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，與MS培養(yǎng)基相比，在1/2MS培養(yǎng)基中生根較早，當(dāng)采用NAA和IAA作為外源激素添加時(shí)，在含NAA的培養(yǎng)基中，韭菜根系均呈現(xiàn)短粗狀態(tài)，而在含IAA的培養(yǎng)基中，植株進(jìn)行生根的條數(shù)與形態(tài)最佳[56]。

5 煉苗移栽

煉苗和移栽是影響組培苗成活率的關(guān)鍵因素，種苗大小、育苗基質(zhì)等都影響組培苗的成活率。楊瑤君等[58]在細(xì)香蔥幼苗移栽前，先煉苗7 d，然后在適宜溫度和時(shí)間內(nèi)移入珍珠巖中;利用生根粉150 mg/L+細(xì)土100 g/L的溶液進(jìn)行移栽，移栽后7 d內(nèi)進(jìn)行50%～70%遮陰;緩苗后定期追施1/2MS大量元素的水溶液，移栽成活率可達(dá)90%以上。在大蒜的組培苗煉苗移栽過(guò)程中，可將再生的小鱗莖在24 ℃和80%相對(duì)濕度的生長(zhǎng)室條件下馴化7 d后轉(zhuǎn)移至溫室中含有泥炭蘚的盆中能獲得較好的成活率[50]。不同基質(zhì)及其組合對(duì)再生植株的生長(zhǎng)也有不同程度的影響。胡永軍等[59]在壽光馬藺韭再生苗移栽的研究中將園田土分別與河沙、蛭石、棉籽皮混合配制成混合基質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)獲得的再生植株中，以移栽在園田土中或園田土與河沙混配的基質(zhì)中長(zhǎng)勢(shì)最好。也可采用草炭及田土處作為混合育苗基質(zhì)，同時(shí)進(jìn)行覆膜保濕，能有效提高分蘗洋蔥組培苗的成活率至95%以上[60]。在對(duì)野韭試管生根苗移栽研究中，以泥炭、珍珠巖、園田土、棉籽皮、進(jìn)口泥炭土為基質(zhì)，同時(shí)進(jìn)行單一基質(zhì)和混合基質(zhì)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)如果采用單一基質(zhì)，則園田土最佳，如果采用混合基質(zhì)，則泥炭土2份+珍珠巖1份處理最佳[61]。

6 展望

蔥屬類植物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著較大作用，如在養(yǎng)殖業(yè)中可以作為飼料添加劑，可以與其他植物合理套作提高農(nóng)作物產(chǎn)量，還有些蔥屬物種可以藥用。采用分子生物學(xué)手段對(duì)蔥屬植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和分子育種研究，更有利于對(duì)其優(yōu)良性狀的深度發(fā)掘和優(yōu)良品種的選育。因而，建立和優(yōu)化科學(xué)合理的組織培養(yǎng)體系對(duì)于其產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)和分子生物學(xué)研究是十分必要的。但目前，通過(guò)組織和器官培養(yǎng)技術(shù)，僅在少數(shù)幾種蔥屬植物上建立起了離體再生體系，所以對(duì)蔥屬植物組培快繁體系還需進(jìn)行更加廣泛且深入的研究。

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