魏海霞 馬玉珍 劉德璽 李永濤 王莉莉 周健 楊慶山

(山東省林業(yè)科學(xué)研究院，濟(jì)南，250014)

豆梨(PyruscalleryanaDecne.)為薔薇科梨屬落葉喬木，被認(rèn)為是最古老的梨屬種之一[1-2]，為我國(guó)原生樹種，是集觀花、觀葉為一體的優(yōu)良彩色景觀樹種[3]，廣泛分布于山東、河南、江蘇、浙江、江西、安徽、湖北、湖南、福建、廣東、廣西等省區(qū)。豆梨作為我國(guó)原生梨屬植物，其生長(zhǎng)適應(yīng)性、抗病性較強(qiáng)，常作栽培梨樹的嫁接砧木。除此之外，豆梨利用價(jià)值較多，具有材用、藥用、食用、園林綠化價(jià)值[4-5]。近年來(lái)，我國(guó)林業(yè)工作者開始重視豆梨資源，并將原產(chǎn)于我國(guó)的豆梨由美國(guó)反引了一些觀賞品種[6-8]，但這些品種資源的種植和推廣還未獲得普及，城鄉(xiāng)綠化建設(shè)中應(yīng)用較少。截至目前本土選育的豆梨新品種、良種未見報(bào)道。

種子萌發(fā)，是植物生活史的關(guān)鍵階段，也是植物抗逆性最弱的時(shí)期，決定著植物的繁殖及種群持續(xù)、擴(kuò)繁和恢復(fù)，具有重要的生物學(xué)和生產(chǎn)實(shí)踐意義[9]；種子萌發(fā)，也是植物引種、育苗的前提和主要環(huán)節(jié)。鹽脅迫會(huì)造成種子發(fā)芽慢、發(fā)芽受阻、種苗生長(zhǎng)畸形等問(wèn)題[10]，種子萌發(fā)期，耐鹽性評(píng)價(jià)對(duì)引種、耐鹽品種選育具有重要指導(dǎo)意義。

關(guān)于對(duì)種子耐鹽萌發(fā)的研究，已有研究成果主要集中在針對(duì)作物[11-13]、草本[14-16]及易萌發(fā)種子的研究[17-18]，而對(duì)有休眠期的木本植物種子耐鹽萌發(fā)的研究較少。為此，本研究在對(duì)野生豆梨種質(zhì)資源進(jìn)行引進(jìn)調(diào)查的基礎(chǔ)上，以豆梨進(jìn)口栽培品種‘紅塔’種子為試材，采用6個(gè)濃度的NaCl脅迫處理，測(cè)定鹽脅迫后豆梨種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、培養(yǎng)1～5 d的胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)；以進(jìn)口栽培品種‘首都’種子為對(duì)照，以7份野生豆梨種子為試材，采用濃度為200 mmol/L的NaCl脅迫處理，測(cè)定鹽脅迫后豆梨種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)。應(yīng)用隸屬函數(shù)法、系統(tǒng)聚類分析法對(duì)種子耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，分析鹽脅迫對(duì)豆梨種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響。旨在為耐鹽豆梨品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試豆梨種子于2019年采自日照嵐山、日照九仙山、臨沂蒙山(見表1)。將采集的豆梨果實(shí)歸堆漚制，沖洗后去雜，于干燥通風(fēng)處晾干備用。

表1 供試種子及種源信息

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年3月份在山東省林業(yè)科學(xué)研究院東營(yíng)分院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將調(diào)制好的種子進(jìn)行沙藏處理50 d，取出后洗凈，高錳酸鉀浸泡消毒，試驗(yàn)備用。

在洗凈烘干的培養(yǎng)皿中放入2層濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿加5 mL鹽溶液，選取大小一致、籽粒飽滿的進(jìn)口豆梨品種‘紅塔’種子(HT)，沖洗干凈，整齊放入培養(yǎng)皿中。每皿放置30粒種子，試驗(yàn)分別設(shè)置6個(gè)NaCl濃度梯度，即0(對(duì)照)、50、100、200、300、400 mmol/L。定時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)的水分，保持鹽溶液的濃度，每處理重復(fù)3次，置于(溫度28 ℃、濕度75%、光照12 h)恒溫培養(yǎng)箱中。

另選取進(jìn)口豆梨品種‘首都’種子(SD)為對(duì)照，和7個(gè)野生豆梨種質(zhì)的種子(J2、J8、J10、M6、M13、M15、M24)，用濃度為200 mmol/L的NaCl溶液進(jìn)行處理，測(cè)定各種質(zhì)種子的耐鹽萌發(fā)情況。方法同上。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)量方法

以芽點(diǎn)突破種皮為發(fā)芽標(biāo)志，每天定時(shí)記錄每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)種子萌發(fā)數(shù)量，每皿隨機(jī)抽取10粒種子，用測(cè)量尺測(cè)量胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)，計(jì)算發(fā)芽勢(shì)=[(培養(yǎng)2 d發(fā)芽數(shù))/供試種子數(shù)]×100%、發(fā)芽率=[(培養(yǎng)3 d發(fā)芽數(shù))/供試種子數(shù)]×100%。

采用隸屬函數(shù)法對(duì)豆梨種質(zhì)進(jìn)行芽期耐鹽堿性綜合評(píng)價(jià)，計(jì)算隸屬函數(shù)值。U(Xij)=(Xij-Xij,max)/(Xij,max-Xij,min)；式中的U(Xij)為i種質(zhì)j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值、Xij為i種質(zhì)j指標(biāo)的實(shí)測(cè)值、Xij,max為i種質(zhì)j指標(biāo)的最大值、Xij,min為i種質(zhì)j指標(biāo)的最小值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2010和SPSS Statistics19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、利用DPS9.50軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和耐鹽性系統(tǒng)聚類分析、采用鄧肯(Duncan)多重比較檢驗(yàn)不同處理之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl處理對(duì)‘紅塔’種子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，種子最早突破種皮的是胚根，試驗(yàn)的前3 d內(nèi)，可見白色的胚根逐漸增長(zhǎng)。

由表2可見：隨著NaCl溶液濃度逐漸增大，種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)均受到抑制而降低，各處理間胚根長(zhǎng)均具有顯著差異(P<0.05)。濃度為50 mmol/L的NaCl溶液處理的種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率，與對(duì)照相比差異不顯著，說(shuō)明濃度為50 mmol/L的NaCl溶液處理對(duì)種子的萌發(fā)影響較??；但是，濃度為100 mmol/L及以上的NaCl溶液處理，對(duì)種子萌發(fā)均有顯著抑制。濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理的種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)，顯著高于濃度為300 mmol/L的NaCl溶液處理的種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)(P<0.05)。當(dāng)NaCl溶液濃度為300、400 mmol/L時(shí)，胚根在2～3 d間生長(zhǎng)基本停滯，甚至萎蔫，因此處理3 d后，只測(cè)量NaCl溶液濃度小于等于200 mmol/L的胚根、胚芽生長(zhǎng)狀況(見表3)。

隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到4～6 d時(shí)，嫩綠色胚芽逐漸出現(xiàn)。由表3可見：隨著NaCl溶液濃度的增高，處理間胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)均顯著低于對(duì)照(P<0.05)；隨著NaCl溶液濃度的降低，胚芽的生長(zhǎng)速度高于胚根。

供試品種進(jìn)口豆梨品種‘紅塔’，生長(zhǎng)表現(xiàn)佳、抗性強(qiáng)，以此為例進(jìn)行種子耐鹽試驗(yàn)具有代表性。隨著處理液鹽濃度的增高，種子發(fā)芽、生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制。由表2、表3可見：當(dāng)NaCl溶液濃度大于等于200 mmol/L時(shí)，種子的發(fā)芽、生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。說(shuō)明濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理，是篩選豆梨種子耐鹽性的關(guān)鍵濃度節(jié)點(diǎn)，在進(jìn)行大量種質(zhì)種子耐鹽性比較時(shí)，可直接選擇濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理，測(cè)定種子的耐鹽萌發(fā)及生長(zhǎng)能力。

表2 不同濃度鹽脅迫時(shí)‘紅塔’種子萌發(fā)狀況及處理1～3 d時(shí)間種子胚根生長(zhǎng)狀況

表3 不同濃度鹽脅迫4～6 d時(shí)‘紅塔’種子胚芽、胚根生長(zhǎng)狀況

2.2 8種豆梨種子耐鹽萌發(fā)的比較

用濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理8個(gè)豆梨種質(zhì)的種子，測(cè)得發(fā)芽1、3 d時(shí)胚根長(zhǎng)(見表4)。M15種子，發(fā)芽1 d時(shí)胚根長(zhǎng)為2.1 mm，比其他種質(zhì)高出46.9%～100.0%；發(fā)芽3 d時(shí)胚根長(zhǎng)為4.2 mm，高出其他種質(zhì)61.5%～127.0%，顯著高于其他種質(zhì)(P<0.05)。其他種質(zhì)之間，胚根長(zhǎng)差異不顯著(P>0.05)。

在種子發(fā)芽2 d時(shí)測(cè)算發(fā)芽勢(shì)、種子發(fā)芽3 d時(shí)測(cè)算發(fā)芽率(見表4)。由表4可見：M15種子的發(fā)芽勢(shì)為44.4%，顯著高于SD、M24、M13、J10、J2種子的發(fā)芽勢(shì)(P<0.05)，與J8、M6種子的發(fā)芽勢(shì)差異不顯著(P>0.05)。M15種子的發(fā)芽率為58.8%，顯著高于SD、M24、J10、J2種子的發(fā)芽率(P<0.05)，與M13、J8、M6種子的發(fā)芽率差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明M15的耐鹽萌發(fā)能力最強(qiáng)，J8和M6次之，其他種質(zhì)耐鹽萌發(fā)能力較弱，且各種質(zhì)之間差異不顯著(P>0.05)。

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，種子的胚根逐漸增長(zhǎng)，但是增長(zhǎng)速率逐漸減小，當(dāng)生長(zhǎng)到4 d，可見種子的綠色胚芽均突出種皮，胚芽的生長(zhǎng)速度高于胚根。測(cè)算生長(zhǎng)5 d時(shí)的胚芽、胚根生長(zhǎng)情況(見表4)，由表4可見：M15種子的胚根長(zhǎng)，顯著高于其他種質(zhì)種子的胚根長(zhǎng)(P<0.05)；其次是J8種子的胚根長(zhǎng)；再次是SD、M24種子的胚根長(zhǎng)。M15種子的胚芽長(zhǎng)，顯著高于其他種質(zhì)種子的胚芽長(zhǎng)(P<0.05)；其次是M6種子的胚芽長(zhǎng)；再次是J2、J10、M24種子的胚芽長(zhǎng)。對(duì)照品種‘首都’(SD)為美國(guó)引進(jìn)的彩葉豆梨品種，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)均顯著低于M15(P<0.05)，胚根長(zhǎng)顯著低于M15、J8(P<0.05)，胚芽長(zhǎng)顯著低于M15、M6、J2、J10、M24(P<0.05)，耐鹽萌發(fā)能力屬于中等水平。

表4 各種質(zhì)在濃度為200 mmol/L的鹽脅迫時(shí)種子萌發(fā)狀況

2.3 豆梨種質(zhì)耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)8種豆梨種質(zhì)種子耐鹽能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(見表5)。由表5可見：平均隸屬函數(shù)值的分布范圍為0.09～1.00，數(shù)值越大說(shuō)明耐鹽能力越強(qiáng)；隸屬函數(shù)值的分布可以看出，各種質(zhì)之間的耐鹽性差異較大。由各種質(zhì)的平均隸屬函數(shù)值可看出，耐鹽能力最強(qiáng)的是M15，它的各項(xiàng)指標(biāo)均最高。隸屬函數(shù)值在0.42～0.52之間的是M6、J8，耐鹽能力中等。耐鹽能力較弱的為M24、SD、M13、J10、J2，共5份種質(zhì)，其隸屬函數(shù)值在0.09～0.29之間，其中M13綜合耐鹽能力最弱。

表5 豆梨種質(zhì)各指標(biāo)隸屬函數(shù)值及綜合排序

2.4 豆梨種質(zhì)耐鹽性的聚類分析

依據(jù)歐氏距離，采用離差平方和法，對(duì)8種豆梨種質(zhì)的耐鹽性進(jìn)行聚類分析(圖1)。在歐式距離3.00處，可將參試材料分為三大類群：第Ⅰ類(Ⅰ級(jí))為M15，屬于高耐鹽種質(zhì)，占供試材料的12.5%；第Ⅱ類(Ⅱ級(jí))有2份種質(zhì)材料，包括M6、J8，為中等耐鹽種質(zhì)，占供試材料的25%；第Ⅲ類(Ⅲ級(jí))有5份種質(zhì)材料，包括M24、SD、M13、J10、J2，為弱耐鹽種質(zhì)，占供試材料的62.5%。結(jié)果與各種質(zhì)平均隸屬函數(shù)值反映的耐鹽能力一致。

圖1 豆梨種質(zhì)聚類分析圖

3 討論

鹽脅迫對(duì)豆梨種子的萌發(fā)有抑制作用，且隨著鹽濃度的升高，抑制作用越強(qiáng)，種子萌發(fā)和生長(zhǎng)也越困難。但有的植物在低鹽濃度時(shí)，能夠促進(jìn)萌發(fā)[20]或者生長(zhǎng)，萌發(fā)不受影響[21-22]。本研究中‘紅塔’種子在不同濃度NaCl脅迫時(shí)，生長(zhǎng)均受到顯著抑制，說(shuō)明豆梨種子在萌發(fā)期對(duì)NaCl溶液處理比較敏感，鹽脅迫導(dǎo)致滲透脅迫和離子毒害，進(jìn)而影響種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)。

種子萌發(fā)的耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)，主要有發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、苗鮮質(zhì)量等，為綜合評(píng)價(jià)種子耐鹽性，往往采用其中多個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)法進(jìn)行耐鹽評(píng)價(jià)。李培英等[23]研究發(fā)現(xiàn)，偃麥草種子萌發(fā)后的鮮質(zhì)量，與鹽濃度間無(wú)相關(guān)關(guān)系；朱建峰等[17]認(rèn)為，非鹽生植物適宜選取根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)等生長(zhǎng)指標(biāo)，鹽生植物適宜選取發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等萌發(fā)指標(biāo)。本研究選取了發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，以各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值和各種質(zhì)隸屬函數(shù)均值為依據(jù)，評(píng)價(jià)種質(zhì)的耐鹽萌發(fā)能力；根據(jù)各指標(biāo)值，依據(jù)歐氏距離，采用離差平方和法進(jìn)行了聚類分析；將8份種質(zhì)的耐鹽性劃分三類，結(jié)果與各種質(zhì)4項(xiàng)指標(biāo)平均隸屬函數(shù)值反映的耐鹽能力一致。

鹽脅迫時(shí)，種子的發(fā)芽率受其耐鹽性和種子活力的影響[20]，在正常條件下發(fā)芽率高的種子在鹽脅迫時(shí)的發(fā)芽率也高。生活力的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種質(zhì)種子生活力差異不顯著(見表1)，故本研究只采用濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理供試的8份豆梨種子，未進(jìn)行清水對(duì)照的設(shè)定。一方面，本研究選用的豆梨種子，是經(jīng)過(guò)沙藏層積，解除休眠后的種子，其已經(jīng)充分吸脹，飽滿且發(fā)育良好，鹽脅迫后耐鹽萌發(fā)能力能夠說(shuō)明該種質(zhì)的萌發(fā)期耐鹽性；另一方面，野生種質(zhì)采集過(guò)程中，當(dāng)材料種量較少，為節(jié)省種子用量，可直接選擇濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理，測(cè)定種子的耐鹽萌發(fā)；第三，在進(jìn)行大量種質(zhì)種子耐鹽性比較時(shí)，也可實(shí)現(xiàn)快速測(cè)定。通過(guò)‘紅塔’種子在不同濃度鹽處理時(shí)的萌發(fā)情況可知，濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理為篩選豆梨種子耐鹽性的關(guān)鍵濃度節(jié)點(diǎn)，也是檢測(cè)豆梨耐鹽性的閾值，這個(gè)鹽處理的濃度與多種植物的耐鹽閾值相吻合[15，22-23]。

種子萌發(fā)期的耐鹽能力，在一定程度上可以反映種子的耐鹽性，可以作為早期鑒定種質(zhì)耐鹽性的一個(gè)方法。種子的萌發(fā)還受到溫度、水分及種子儲(chǔ)藏物質(zhì)等條件的影響。萌發(fā)期的耐鹽性，有時(shí)與生長(zhǎng)期的耐鹽性并不完全一致，萌發(fā)期種子胚根的生長(zhǎng)受根尖生長(zhǎng)點(diǎn)分裂速度的影響，當(dāng)外界條件不利于根尖細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，萌發(fā)受到抑制；而鹽脅迫對(duì)植株生長(zhǎng)期的影響，包含對(duì)地下部根和地上部植株兩部分的影響，當(dāng)高鹽脅迫發(fā)生時(shí)，離子富集產(chǎn)生離子毒害，并引起體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)水平失衡，而造成地上部的幼苗生長(zhǎng)受到抑制，此時(shí)地下部根為了躲避鹽脅迫，會(huì)通過(guò)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和吸水來(lái)減少脅迫傷害。本研究會(huì)在后續(xù)繼續(xù)觀測(cè)幼苗的耐鹽生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)比幼苗期耐鹽能力的不同，探究萌發(fā)期與幼苗期耐鹽性的異同。

4 結(jié)論

本研究確定了處理豆梨種子的NaCl溶液濃度閾值為200 mmol/L，可應(yīng)用于材料稀缺和種質(zhì)數(shù)量大的耐鹽萌發(fā)快速測(cè)定。

豆梨種子萌發(fā)對(duì)NaCl溶液處理敏感，隨著濃度增加種子萌發(fā)受到顯著抑制，本研究將8份豆梨種質(zhì)劃分為高耐鹽(M15)、中度耐鹽(J8、M6)、鹽敏感(SD、M24、M13、J10、J2)3種類型。