秦萬強(qiáng)

（貴州省務(wù)川仡佬族苗族自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防監(jiān)測(cè)中心，貴州 務(wù)川 564300）

1 ELISA實(shí)驗(yàn)室診斷方法概述

酶聯(lián)免疫吸附法 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一種特殊的試劑分析方法，在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫檢測(cè)技術(shù)。ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的非放射性標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)，其試劑易于保存、結(jié)果判斷較為客觀，具有敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果的影響因素

2.1 試劑盒的選擇

試劑盒的質(zhì)量直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前市面上生產(chǎn)試劑盒的廠家較多，不同廠家的試劑敏感性、特異性不盡相同，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果就會(huì)有一定的差別，目前我們使用的試劑盒購(gòu)自武漢科前有限公司、深圳康百得有限公司和深圳真瑞有限貴公司，不同試劑盒各有優(yōu)缺點(diǎn)，但主要成分是相同的。

試劑盒使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫(20～25℃)，搖勻、結(jié)晶溶解后方可使用，顯色液不要暴露于強(qiáng)光和接觸氧化劑，不同品種、不同批號(hào)的試劑盒組分不得混用，這是為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。不同試劑使用時(shí)應(yīng)防止交叉污染，所有廢棄物在丟棄之前應(yīng)進(jìn)行高壓滅菌。

2.2 前期樣品處理

首先是待檢樣品的預(yù)處理對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定的影響，樣品須血液凝固析出血清后進(jìn)行血清分離，一部分血清未析出需用離心機(jī)進(jìn)行血清分離，盡量取上清液，如果混濁會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定的干擾；其次是溶血，溶血時(shí)紅細(xì)胞破裂釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，干擾試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)而影響對(duì)結(jié)果的判斷，因此對(duì)于采集來的全血需及時(shí)進(jìn)行血清分離，發(fā)現(xiàn)溶血的樣品應(yīng)棄之不用，短期內(nèi)（3天內(nèi)）可將待檢血清樣品保存于2～8℃；若長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于-20℃以下環(huán)境中，避免反復(fù)凍融；最后，就是保證待檢樣品有足夠試驗(yàn)的用量，有些血清，尤其是雞、牛血清在秋冬季節(jié)室外溫度過低時(shí)容易出現(xiàn)凝膠狀態(tài)，這樣就無法吸取，應(yīng)在試驗(yàn)前對(duì)待檢樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)募訜崽幚?，以保證其融化。

2.3 移液器的使用

應(yīng)使用準(zhǔn)確性高的微量移液器且定期進(jìn)行校準(zhǔn)，對(duì)于使用時(shí)間過長(zhǎng)取液不準(zhǔn)確的移液器應(yīng)及時(shí)淘汰，使用移液器時(shí)應(yīng)注意加樣的規(guī)范性，在吸取試劑或樣品時(shí)應(yīng)按在移液器的第一檔，不能按在第二檔，不然會(huì)造成吸取液體多而結(jié)果不準(zhǔn)確，吸取待檢樣品時(shí)不可速度過快，以免將樣品吸入移液器內(nèi)，造成交叉污染，影響試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)完成后應(yīng)及時(shí)將移液器調(diào)回量程范圍內(nèi)的最大值，并及時(shí)用酒精棉對(duì)整個(gè)移液器進(jìn)行擦拭消毒。

2.4 加樣與稀釋

一部分試劑盒所需待檢樣品僅為5 uL，比如深圳康百得生產(chǎn)的羊小反芻試劑盒、豬口蹄疫試劑盒、雞H5亞型抗體檢測(cè)試劑盒等，多加或少加1 uL即有20%的誤差，為了保證加樣的準(zhǔn)確性，需要將5 uL血清進(jìn)行倍比稀釋，即用樣品稀釋液對(duì)待檢樣品進(jìn)行1：100倍的稀釋，稀釋好后再?gòu)闹腥?00 uL待檢樣品進(jìn)行試驗(yàn)，這樣做一定程度上減少了誤差。加樣時(shí)應(yīng)垂直將樣本準(zhǔn)確加入微孔底部，避免吸頭碰到包被板的邊緣，移液時(shí)盡量準(zhǔn)確，慢吸快放，防止濺出或產(chǎn)生氣泡，避免液體外濺殘留在反應(yīng)孔的上部。每次吸樣需更換吸頭，做到一樣一吸頭，避免交叉污染。加樣品稀釋液、酶標(biāo)結(jié)合物、底物液、顯色液及終止液時(shí)可采用多道移液器，迅速完成加液過程。

在稀釋過程中，如果待檢血清過多時(shí)，應(yīng)先稀釋完所有的待檢血清，再加到抗原包被板上，使反應(yīng)時(shí)間一致；另外，每個(gè)試劑盒都有相應(yīng)的洗滌次數(shù)，需嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，洗滌次數(shù)過多或偏少都會(huì)使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重偏差，洗滌時(shí)每孔需按操作加入等量的洗滌液，防止因洗滌不充分造成非特異性顯色。

2.5 溫度與時(shí)間的控制

溫育是 ELISA至關(guān)重要的一步。只有在適宜的溫度下抗體和抗原才能充分反應(yīng)結(jié)合，每個(gè)試劑盒都有規(guī)定的溫育溫度，一般溫育溫度是37℃。不同的溫育環(huán)境對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響，在試驗(yàn)開始之前應(yīng)提前將電熱恒溫箱開啟，并按照試劑說明書上的要求設(shè)置好溫育溫度，以確保能在規(guī)定的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)不要反復(fù)開關(guān)恒溫箱門，以免溫度過低影響酶的反應(yīng)，從而影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。除此之外，溫育時(shí)間也是影響檢測(cè)結(jié)果的一大因素，在ELISA檢測(cè)中，要嚴(yán)格按照說明書的要求控制好溫育時(shí)間[1]。

2.6 洗板

洗板是否合格直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板分人工洗板和洗板機(jī)洗板，人工洗板人為主觀因素影響較大，所以在用移液器加樣時(shí)一定要保證移液器的準(zhǔn)確性和減少人為的誤差。使用洗板機(jī)洗板一定程度上可避免環(huán)境污染，提高工作效率。目前，務(wù)川縣獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室采用的是人工洗板方式。洗板時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)：一是洗滌液應(yīng)嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行稀釋，不能將洗滌液溢出到孔外以免交叉污染；二是倒掉洗滌液應(yīng)垂直甩板，不可斜著倒，洗板結(jié)束后將板拍干，應(yīng)垂直將板扣在備好干凈的吸水紙上，且注意每次拍板更換干凈的吸水紙。

2.7 顯色

顯色底物分為A、B兩種液體，加樣時(shí)A、B液提前應(yīng)恢復(fù)至室溫，避免強(qiáng)光照射，按順序依次加入不能顛倒，間隔最好不超過1 min，如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合。注意避光顯色，顯色是最后一步溫育反應(yīng)，酶將無色底物催化反應(yīng)呈有色。顯色的時(shí)間和溫度均是影響結(jié)果的重要因素，一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，但陽性孔會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而顯色加強(qiáng)，顯色時(shí)間不宜過短，因?yàn)橐恍┑偷味瓤贵w可能不會(huì)及時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)，造成假陰性結(jié)果；顯色時(shí)間過長(zhǎng)，對(duì)照值偏高或非特異性顯色概率增加，因此顯色時(shí)間一定要控制在說明書上規(guī)定的范圍內(nèi)。目前我們使用的 ELISA試劑盒顯色溫度一般為37℃或室溫（20～25℃），顯色溫度不同，檢測(cè)出來的結(jié)果就不相同，當(dāng)溫度過低時(shí)會(huì)導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)速率變慢，顯色不充分，造成低值陽性結(jié)果的漏檢，所以操作過程中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度。

2.8 波長(zhǎng)設(shè)置及讀數(shù)

讀數(shù)時(shí)將酶標(biāo)分析儀置于光源較好的地方，光源不充足不能及時(shí)讀取試驗(yàn)數(shù)據(jù)，在設(shè)置波長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)根據(jù)說明書最好設(shè)置雙波長(zhǎng)，通常為630 nm和450 nm。由于雙波長(zhǎng)可以消除同一塊板上不同孔之間的差異，同時(shí)還可消除試樣的背景吸收干擾和混濁干擾，所以會(huì)減少試驗(yàn)數(shù)據(jù)的誤差[2]。終止反應(yīng)后的時(shí)間對(duì)OD值結(jié)果有明顯影響，10～15 min陽性結(jié)果的OD值逐漸下降，陰性結(jié)果的OD值有所上升，所以必須嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，最好在加入終止液后10 min內(nèi)完成上機(jī)讀數(shù)。

2.9 結(jié)果判定

在數(shù)據(jù)出來后，首先看陽性對(duì)照和陰性對(duì)照是否滿足說明書上的要求，如果其中一項(xiàng)不滿足條件，則證明試驗(yàn)不成立，需重新進(jìn)行試驗(yàn)，如果都成立，再根據(jù)公式計(jì)算出試驗(yàn)結(jié)果。

3 其他因素

實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境也是影響試驗(yàn)結(jié)果的一大因素，合理調(diào)控實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)。實(shí)驗(yàn)室的溫度及濕度可使用空調(diào)加以控制，濕度控制在60%左右，注意實(shí)驗(yàn)室的消毒及衛(wèi)生清潔工作，避免對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成污染。在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)先核對(duì)試劑盒是否在有效期范圍，對(duì)于未使用完的試劑盒應(yīng)及時(shí)放入2～8℃保鮮室內(nèi)。另外要加強(qiáng)工作人員專業(yè)理論知識(shí)的學(xué)習(xí)，在工作中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)、不斷積累，減少人為因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，減少假陰性、假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。