賀碧芳，陳 雪，張淺閱，楊珊珊，龍金金，葉邵兵

（1. 貴州大學醫(yī)學院 貴陽 550025；2. 重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院 重慶 開州區(qū) 405400）

PD-1 是程序性細胞死亡受體1（programmed cell death protein 1, CD279）的 英 文 簡寫；而PDL1（programmed cell death 1 ligand 1, CD274）則是該受體的一型配體。PD-1 屬CD28 家族，主要表達在T 細胞上。PD-L1 屬于B7 家族，在黑色素瘤等幾十種人類腫瘤組織及腫瘤細胞上高表達。文獻[1- 2]的研究表明，阻斷PD-1/PD-L1 信號通路可激活腫瘤抗原特異性T 細胞，對于惡性腫瘤具有較好的治療作用。因此，PD-1 和PD-L1 成為了目前腫瘤免疫治療的熱門靶點，在國內(nèi)外掀起了PD-1/PD-L1通路抑制劑研發(fā)的熱潮。

迄今為止，針對PD-1 靶點的抗體藥物納武單抗（nivolumab）、帕姆單抗（pembrolizumab）和西米普利單抗（cemiplimab）以及針對PD-L1 靶點的抗體藥物阿替利珠單抗（atezolizumab）、阿維魯單抗（avelumab）和度伐利尤單抗（durvalumab）已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市[3-7]，還有許多其他抗體藥物正處于臨床試驗階段[8]。前期研究表明，雖然阻斷PD-1/PD-L1 通路的抗體藥物對于癌癥有一定的治療效果[9]，但存在個體差異大（只對大約20%的患者產(chǎn)生持久反應[10]）、易引發(fā)不恰當?shù)拿庖叻磻猍11]等問題。此外，治療性抗體開發(fā)難度大，生產(chǎn)成本較高[12]，同時抗體療法本身存在一些固有的缺陷，如器官或腫瘤滲透性差、口服生物利用度差等。相較于抗體藥物，多肽藥物在分子質(zhì)量水平上與小分子化學藥物相近，在生物活性上與蛋白質(zhì)藥物相近，集蛋白質(zhì)藥物與傳統(tǒng)化學藥物的優(yōu)點于一身。此外，多肽藥物分子還擁有結構小、易改造、易合成等優(yōu)點。但是，多肽穩(wěn)定性差、半衰期短，這成為了多肽開發(fā)成藥物得到應用的重大限制。但目前已有多種長效多肽藥物方法如改變構型、化學修飾和融合蛋白技術等可用來延長多肽藥物在體內(nèi)的半衰期[13]，因此，有望開發(fā)出治療惡性腫瘤的多肽藥物。

高內(nèi)涵和高通量的表面展示技術（surface display）是一種常用的篩選多肽配體的方法，其中的噬菌體展示技術（phage display）[14]在篩選候選多肽方面具有耗時少、操作簡單等優(yōu)勢。在噬菌體展示淘選實驗中，先將蛋白質(zhì)等靶標（target）[15-16]固定，與噬菌體展示文庫一起溫育，經(jīng)過幾輪選擇和增殖的生物淘選（biopanning）[17]，得到與靶標特異性結合的噬菌體，最終通過測序確定展示的外源多肽序列。在傳統(tǒng)的噬菌體展示實驗中，經(jīng)過幾輪生物淘選后，隨機挑選出幾十或幾百個噬菌體克隆進行第一代DNA 測序。由于噬菌體展示文庫的多樣性，低通量的第一代DNA 測序僅分析了庫容的九牛一毛（＜0.01%）。近10 年間，高通量測序逐漸應用在噬菌體展示領域，形成的二代噬菌體展示技術（nextgeneration phage display, NGPD）可一次性分析幾百萬條序列，保留了文庫的原始多樣性，并能淘選出代表性不足的克隆，這些克隆在傳統(tǒng)噬菌體展示淘選實驗中大多丟失[18-20]。而采用二代噬菌體展示技術篩選靶標特異性結合肽，需要的淘選實驗輪數(shù)更少，可加快發(fā)現(xiàn)與開發(fā)多肽配體的節(jié)奏。此外，二代噬菌體展示技術還能有效抑制靶標無關肽出現(xiàn)在最終的淘選結果中[21]。目前，已報道了一些借助傳統(tǒng)噬菌體展示淘選得到的阻斷PD-1/PD-L1 相互作用的PD-1 結合肽與PD-L1 結合肽[11,22-25]。然而，通過檢索生物淘選數(shù)據(jù)庫BDB[26-27]，發(fā)現(xiàn)還未有研究者采用二代噬菌體展示技術淘選PD-1 結合肽。

本研究為了獲得更多新型的PD-1 結合肽，采用重組人PD-1 蛋白為靶標，分別淘選Ph.D.-7 和Ph.D.-12 噬菌體展示文庫，獲得了400 條潛在的PD-1 結合肽。然后，對獲得的PD-1 結合肽數(shù)據(jù)集進行了聚類分析、氨基酸組成與基于位置的氨基酸偏好性分析，發(fā)現(xiàn)了一些PD-1 結合肽的序列組成特性。通過模擬位點分析，發(fā)現(xiàn)模擬位點殘基與PD-L1 上的真實表位殘基有一定的重疊，揭示了淘選出的PD-1 結合肽可能模擬了PD-L1 蛋白的部分特性。本文結果將對計算機輔助設計PD-1 結合肽有一定的指導意義。淘選出的PD-1 結合肽可作為阻斷PD-1/PD-L1 相互作用的多肽藥物開發(fā)的候選多肽。

1 材料與方法

1.1 PD-1 淘選Ph.D.-.7 和Ph.D.-.12 噬菌體展示文庫

本文采用重組人PD-1 蛋白（北京義翹神州科技有限公司）分別淘選Ph.D.-.7 和Ph.D.-12 噬菌體展示文庫（New England Biolabs），獲得PD-1 結合肽。按照Ph.D.TMPhage Display Libraries Instruction Manual中“ Solution-phase Panning with Affinity Bead Capture”的實驗流程進行兩輪噬菌體展示淘選。在第二輪PD-1 淘選實驗（R2-PD）時，同時進行了2 個對照淘選實驗。在第一個對照淘選實驗中，將經(jīng)過第一輪PD-1 淘選（R1-PD）富集得到的噬菌體克隆與Dynabeads（Cat# 10-103-D, Invitrogen）進行孵育（R2-DB）；在第二個對照淘選實驗中，將第一輪淘選后富集的噬菌體克隆與無關的抗FLAG M2 單克隆抗體（Cat# F3165, Sigma-Aldrich）進行孵育（R2-UF）。隨后，將第1 輪之前（R0）的文庫、兩輪淘選（R1 和R2）后的文庫，送二代測序。

1.2 Illumina 雙末端測序數(shù)據(jù)分析

測序完成后，采用二代噬菌體展示雙末端測序數(shù)據(jù)分析方法分析原始測序數(shù)據(jù)[28]。使用單尾t 檢驗評估多肽在R2-PD 淘選實驗中的拷貝數(shù)比率顯著與否，只有序列在R2-PD 淘選實驗中的拷貝數(shù)相較于各個對照樣本中的拷貝數(shù)比率≥2 且p≤0.05 才被視為PD-1 結合肽。

1.3 聚類分析

BLOSUM62 是生物信息學中應用最廣的氨基酸替換打分矩陣[29]，常用于序列對比。本研究根據(jù)BLOSUM62 打分矩陣分別對來自Ph.D.-7 噬菌體展示文庫的PD-1 結合肽和來自Ph.D.-12 噬菌體展示文庫的PD-1 結合肽進行聚類分析。

1.4 Two Sample Logo

使用Two Sample Logo（TSL）工具來分析多肽序列中特定位置的氨基酸偏好[30]。該工具需要固定長度的多肽序列作為輸入，因此分別使用來自Ph.D.-7 噬菌體展示文庫的PD-1 結合肽和非PD-1 結合肽以及來自Ph.D.-12 噬菌體展示文庫的PD-1 結合肽和非PD-1 結合肽來產(chǎn)生TSL。

1.5 模擬位點分析

采用EpiSearch[31]分別對聚類后的每種類別的PD-1 結合肽進行構象性表位分析，將PD-1 結合肽映射到PD-L1 晶體結構（PDBID: 4ZQK，鏈A）[32]的表面，然后對每種類別中每條肽的映射結果取并集，作為該類別下PD-1 識別的PD-L1 上的模擬位點。最后對每種類別PD-1 結合肽映射結果取并集，作為PD-1 識別的PD-L1 上的模擬位點。將上述得到的模擬位點與PD-L1 上的真實表位進行比較。

2 結果與討論

本研究的實驗流程如圖1 所示，首先進行了二代噬菌體展示淘選實驗，采用重組人PD-1 蛋白為靶標，分別淘選Ph.D.-.7 和Ph.D.-12 噬菌體展示文庫，兩輪淘選后獲得高度結合PD-1 的噬菌體克隆，隨后進行Illumina 高通量測序。第二階段主要是確定PD-1 結合肽，如果多肽序列在第二輪PD-1 淘選后的文庫中的拷貝數(shù)顯著高于各個對照樣本中的拷貝數(shù)，則認為該多肽為PD-1 結合肽。第三階段主要是對PD-1 結合肽數(shù)據(jù)集進行聚類、氨基酸組成、基于位置的氨基酸偏好性分析以及模擬位點分析。

圖1 本研究的實驗流程示意圖

2.1 二代噬菌體展示淘選PD-1 結合肽

經(jīng)過兩輪的噬菌體展示淘選實驗與二代噬菌體展示雙末端測序數(shù)據(jù)分析，最終確定了400 條PD-1結合肽序列，其中311 條來自Ph.D.-7 噬菌體展示文庫，89 條來自Ph.D.-12 噬菌體展示文庫。這些多肽在R2-PD 中高度富集，而在R0、R1-PD 和對照實驗R2-DB 及R2-UF 中拷貝數(shù)較低。

隨機從余下的Ph.D.-7 多肽數(shù)據(jù)中挑選311 條多肽作為非PD-1 結合肽，從Ph.D.-12 多肽數(shù)據(jù)中挑選89 條多肽作為非PD-1 結合肽用于后續(xù)特定位置的氨基酸偏好分析。

2.2 聚類分析

根據(jù)BLOSUM62 打分矩陣進行聚類分析，來自Ph.D.-7 噬菌體展示文庫的311 條PD-1 結合肽聚成了9 個類，來自Ph.D.-12 噬菌體展示文庫的89 條PD-1 結合肽聚成了4 個類。

2.3 氨基酸組成分析

PD-1 結合肽的氨基酸組成如圖2 所示，成分差異清晰可見。分別對3 個PD-1 結合肽數(shù)據(jù)集進行了分析，相比其他氨基酸，丙氨酸A、亮氨酸L、脯氨酸P、絲氨酸S 和蘇氨酸T 在PD-1 結合肽中含量較高，這表明這些氨基酸在與PD-1 結合中起著至關重要的作用。

圖2 PD-1 結合肽數(shù)據(jù)集氨基酸組成

2.4 特定位置的氨基酸偏好分析

PD-1 結合肽數(shù)據(jù)集基于位置的氨基酸偏好性采用Two Sample Logo 軟件分析，氨基酸偏好性趨勢如圖3 所示。圖3a 表明，天冬酰胺N 偏向于出現(xiàn)在311 條PD-1 結合肽的前兩個位置，組氨酸H 和甘氨酸G 分別偏向于出現(xiàn)在第3 個和第4 個位置，谷氨酰胺Q 和酪氨酸Y 更傾向于出現(xiàn)在第7 個位置。圖3b 表明，對于來自Ph.D.-12 噬菌體展示文庫的89 條PD-1 結合肽，亮氨酸L 和纈氨酸V 偏好第2 個位置，異亮氨酸傾向于出現(xiàn)在第6 個位置。

圖3 PD-1 結合肽數(shù)據(jù)集基于位置的氨基酸偏好性

2.5 基于PD-1 結合肽的模擬位點分析

使用EpiSearch 將PD-1 結合肽映射到PDL1 晶體結構（PDBID：3B5H，鏈A）的表面，分別將來自Ph.D.-12 噬菌體展示文庫的89 條PD-1 結合肽和來自Ph.D.-7 噬菌體展示文庫的311 條PD-1結合肽按聚類結果進行分析。311 條源自Ph.D.-7噬菌體展示文庫的PD-1 結合肽分成9 個類進行模擬位點分析，EpiSearch 均未給出結果，其參數(shù)設置為Patch Size = 10，Area cutoff = 5，Accuracy cutoff = 3。如表1 所示，來自Ph.D.-12噬菌體展示文庫的89 條PD-1 結合肽分成4 個類進行模擬位點分析，在EpiSearch 默認參數(shù)下，只有Cluster 1 與Cluster 2類得到了模擬位點結果；對于Cluster 3 與Cluster 4，EpiSearch 未給出結果。表中加粗顯示的殘基同時出現(xiàn)在真實的PD-L1 上的表位殘基與模擬位點殘基中，比較得到的模擬位點殘基與PD-L1 上的真實表位殘基，發(fā)現(xiàn)兩者有9 個位點殘基是一致的。上述結果表明，基于噬菌體展示淘選數(shù)據(jù)的模擬位點分析有一定的可靠性。同時，雖然Cluster 1 和Cluster 2 按照聚類分析聚成了兩類，但是模擬位點分析得到的構象性表位殘基是完全一致的，而且模擬位點殘基與PD-L1 上的真實表位殘基具有較高的一致性，因此推斷Cluster 1 和Cluster 2 中的PD-1 結合肽可能模擬了PD-L1 蛋白的部分特性，這些多肽可作為后期藥物開發(fā)的候選多肽。此外，根據(jù)模擬位點分析結果，Cluster 3 和 Cluster 4 中的PD-1 結合肽以及來自 Ph.D.-7 噬菌體展示文庫的311 條 PD-1 結合肽的結合位點與真實的表位殘基可能不一致，所以這些多肽可能對于后期藥物開發(fā)的意義不大。

表1 來自Ph.D.-12 噬菌體展示文庫的89 條PD-1 結合肽的模擬位點分析結果

3 結 束 語

PD-1 結合肽是治療癌癥的潛在治療藥物。本研究通過二代噬菌體展示淘選獲得的PD-1 結合肽有望開發(fā)成阻斷PD-1/PD-L1 相互作用的候選多肽藥物?；贐LOSUM62 打分矩陣進行了聚類分析，淘選出的400 條PD-1 結合肽聚成了13 類。對PD-1 結合肽數(shù)據(jù)集進行了氨基酸組成與基于位置的氨基酸偏好性分析，發(fā)現(xiàn)丙氨酸A、亮氨酸L、脯氨酸P、絲氨酸S 和蘇氨酸T 在與PD-1 結合中起著非常重要的作用。且PD-1 結合肽的氨基酸組成有一定的位置偏好性。模擬位點分析揭示了淘選出的PD-1 結合肽可能模擬了PD-L1 蛋白的部分特性。希望上述結果對PD-1 結合肽的計算設計有一定的指導意義。

本研究仍然存在不足之處，未對淘選出的潛在PD-1 結合肽進行體外與體內(nèi)實驗，因此未評估能否結合PD-1、能否阻斷PD-1/PD-L1 相互作用。在后續(xù)的工作中，將進一步開展實驗驗證，并基于機器學習構建PD-1 結合肽預測工具，填補快速獲取PD-1 結合肽計算工具的空白。