王 嫚 吳智楠 周天賜 李佩琪 劉春梅 周 迪 林 潔**

（1 江蘇第二師范學院生命科學與化學化工學院，江蘇省生物功能分子重點實驗室 江蘇南京 210013 2 華東師范大學生命科學學院，上海市調控生物學重點實驗室 上海 200241）

人們已從天然產物中發(fā)現了具有各種生物活性的化合物，包括鎮(zhèn)痛藥物阿司匹林、抗癌藥物紫杉醇和長春新堿等，目前，已上市的小分子新藥化學實體中有63%源自天然產物。而微生物因其數量大、種類多，成為藥物研發(fā)的優(yōu)質材料。其中從藥用植物中分離得到的內生真菌，往往能產生不同于常規(guī)環(huán)境中的生存策略，其代謝或防御系統(tǒng)常常特別發(fā)達，成為藥物發(fā)現的優(yōu)質來源，能產生結構類型多、結構新穎、活性廣泛的次生代謝產物。我國已發(fā)現3 萬多種高等植物，其中藥用植物11 000 多種，而研究過內生真菌的藥用植物僅有21 科44 屬62種2 變種，相對于我國豐富的藥用植物資源，內生真菌活性及化學成分的研究還遠遠不夠。因此，藥用植物內生真菌極具研究價值。

胡蔓藤又名鉤吻，是馬錢科（Loganiaceae）胡蔓藤屬（Gelsemium）植物，因其劇毒性而聞名。該屬植物目前世界上共發(fā)現3 種，分別為分布于美洲國家［1-3］的常綠鉤吻（G.sempervirensArt.）、沼澤茉莉（G.rankiniiSmall.）及主要分布在我國福建、廣西等南部地區(qū)和東南亞地區(qū)的胡蔓藤（G.elegansBenth.）。胡蔓藤植物為常綠木質藤本，小枝呈圓柱形，幼時具縱棱；葉片為膜質，形狀多為卵形、卵狀長圓形或卵狀披針形；苞片邊緣和花梗除幼時被毛外，全株均無毛；種子呈扁壓狀橢圓形或腎形，邊緣具有不規(guī)則齒裂狀膜質翅。胡蔓藤屬植物一般5—11月開花，7月至翌年3月結果。多生于海拔500～2 000 m 山地路旁灌木叢中或潮濕肥沃的丘陵山坡疏林下［4］。我國胡蔓藤的研究歷史悠久，《本草綱目》中對于胡蔓藤的描述為“主金瘡、乳癰、中惡風、咳逆上氣，鬼痊蠱毒”。我國民間因其毒性大，一直以外用為主，能祛風、消腫拔毒、殺蟲止癢；而對豬反而有驅蟲、止喘、鎮(zhèn)靜、催肥和免疫作用，因此，民間稱其“人的毒藥，豬的人參”［5］。20世紀60年代，在福建閩南地區(qū)有民眾用胡蔓藤燒灰干粉口服治療胃癌和肝癌，均取得一定療效，其藥理活性開始引起關注。1930年左右，研究人員對胡蔓藤先后進行了毒理和藥理學、生物學、化學等研究［1］。藥理活性顯示，胡蔓藤具有免疫、鎮(zhèn)痛、促造血、抗心律失常、抗炎和禽畜復壯等多種活性，對肝癌細胞（Bel-7402 和HepG2）、肺癌細胞（A549）、結腸癌細胞（HGC-27）和宮頸癌細胞（Hela）具有明顯的抑制增殖作用［6］。

調查統(tǒng)計表明，至今研究者已從胡蔓藤屬植物中分離出生物堿、萜類和甾體等成分，而該屬植物最為人廣知的主要成分是其中的生物堿。研究者從該屬植物中共分離得到50 余種生物堿，根據其的結構特點分為六大類：薩杷晉堿Sarpagine型、鉤吻素子Koumine 型、胡蔓藤堿乙Humantenine 型、11-去甲氧基鉤吻素乙Gelsedine 型、鉤吻素甲Gelsemine 型、育亨烷Yohimbane 型。這些生物堿在結構上都含有一個吲哚或氧化吲哚母核結構，具有多個手性中心和復雜的籠狀結構［1，6-7］。

2015年Liu 等［8］首次從胡蔓藤內生真菌Guignardia mangiferae中發(fā)現3 個倍半萜和1 個聚酮類新結構化合物，與胡蔓藤植物中的多種生物堿的藥理活性類似，均對脂多糖誘導的BV2 細胞炎性反應有強抑制作用（IC50：4.2～15.2 μmol／L）。除此之外，未見其他有關胡蔓藤內生真菌研究的報道。本實驗以藥用植物胡蔓藤為實驗材料，對其內生真菌進行分離純化，通過形態(tài)學和分子生物學方法對其進行種屬鑒定，并系統(tǒng)性地分析了胡蔓藤植物根、莖、葉和花這4 個部位中內生真菌的多樣性，并以革蘭氏陽性細菌代表金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和革蘭氏陰性細菌代表大腸桿菌Escherichia coli.為指示菌，通過紙片法進行抑菌活性測試，該研究豐富了藥用植物胡蔓藤內生真菌資源，并為進一步開發(fā)利用胡蔓藤內生真菌資源提供參考依據［9-10］。

1 材料

1.1 儀器與試劑

儀器：超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、高壓滅菌鍋（南京博惠科學儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海鴻都電子科技有限公司）、PCR 擴增儀（Biorad）、臺式超速離心機（上海三發(fā)科學儀器有限公司）、三恒多用電泳儀（北京市六一儀器廠）。

試劑：75%乙醇、次氯酸鈉溶液、DNA Marker（DL 2000）、50×TAE、電泳緩沖液、2×PCR Master-Mix、引物ITS4 和ITS5、Loading Buffer、核酸染料。

1.2 植物材料 植物樣品采集自廣西的新鮮胡蔓藤植株，選擇其根、莖、葉、花4 個部位進行實驗。經暨南大學高昊教授鑒定為胡蔓藤。

1.3 培養(yǎng)基

1）分離純化培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：46.0 g PDA 粉末溶于1 L 蒸餾水中，邊加熱邊攪拌至其完全溶解，混勻后，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻備用。

2）抑菌培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：稱取3.0 g 牛肉膏、10.0 g 蛋白胨、5.0 g NaCl，置于1 L蒸餾水中，并加入20 g 瓊脂粉，攪拌均勻，并將pH 值調至7.4～7.6，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻備用。

3）營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基：稱取18 g 營養(yǎng)肉湯干粉置于1 L 蒸餾水中，攪拌均勻，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻備用。

1.4 供試菌種 測試菌株為采購自上海魯微科技有限公司的大腸桿菌（ATCC25922）及金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］。

2 實驗方法

2.1 分離純化內生真菌 使用蒸餾水將胡蔓藤植物表面污垢沖洗干凈。將根、莖、葉、花進行粗剪。在超凈工作臺中進行植物組織表面的消毒（用75%的乙醇浸泡30 s；無菌水漂洗3 次，每次1 min；用次氯酸鈉浸泡1 min；再次用無菌水漂洗3 次，每次1 min），最后用無菌濾紙吸干表面水分備用［11］。為檢測材料表面滅菌的效果是否徹底，將最后一次漂洗組織的無菌水，取適量涂布于PDA 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1 d。培養(yǎng)基表面無菌落長出，則代表滅菌徹底。將表面徹底滅菌的根、莖、葉、花在超凈工作臺用無菌刀片切割成0.5 cm×0.5 cm 的小塊。用無菌鑷子將其分別平鋪于PDA 固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)至樣品邊緣菌絲長出，之后反復挑取菌絲，直至最終獲得純種菌株，并將其轉接到PDA 斜面，待其長滿斜面，保存至4℃冰箱備用［12-13］。

2.2 內生真菌形態(tài)學鑒定 將固體培養(yǎng)基制成平板，以點植法進行接種，即用接種針尖挑取菌絲尖端點植于PDA 平板的中心，然后于25～28℃避光培養(yǎng)一定時間（通常為7～10 d）進行觀察，大小以菌落的直徑（mm）表示。觀察的要點包括：菌落的顏色、菌落表面的紋飾、菌落的質地、菌落的高度、菌落邊緣、是否有滲出物等，并進行記錄。取一小段細致不粗糙且粘性好的膠帶，從菌落表面的中心向邊緣粘，用濃度為75%的乙醇進行固定，選擇乳酸石炭酸棉藍染色液，對其進行染色，將粘有菌絲的一面向上，蓋上蓋玻片，于顯微鏡下觀察產孢結構等特征，參考《真菌鑒別手冊》進行鑒別［14］。

2.3 分子生物學方法鑒定內生真菌 首先進行胡蔓藤內生真菌的基因組DNA 提取，將其作為PCR 擴增模板。真菌DNA 的提取采用CTAB 法（cetyltriethylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化銨）［15］。

利用PCR 技術對所提取的真菌rDNA ITS 區(qū)進行擴增，選用的引物為ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。反應條件設置為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃復性30s，72℃延伸45 s，30 個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

將擴增產物電泳凝膠置于凝膠成像儀中，在紫外光下觀察條帶位置。將確定擴增成功的擴增產物送至上海生工生物有限公司，進行測序。所得到的序列進入NCBI 數據庫，通過BLAST 搜索相似性的序列，并將這些序列相似性高的菌株序列，用 軟 件ClustalX 1.8 進行多序列比對分析［9，16］，再將這些相似的序列導入軟件MEGA5.10 中進行同源性分析，從而構建系統(tǒng)發(fā)育樹（算法：Neighbor-Joining，進化距離計算模型：Kimura 2，置信度檢測：bootstrap，自展次數：1 000 次）［17-18］。

2.4 內生真菌多樣性指數的計算 內生真菌群落的多樣性分析主要采用Shannon-Weiner 公式：H′=－∑PilnPi，其中Pi代表胡蔓藤中某種內生真菌分離得到的數量占總真菌數量的百分比［9］。

2.5 內生真菌抗菌性篩選 在無菌的操作環(huán)境下，用接菌環(huán)挑取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為測驗菌株，接種至營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，放置于搖床中35℃，200 r／min 轉速培養(yǎng)5 d。將普通濾紙片用打孔器打成直徑為6 mm 的圓形濾紙片，放置于培養(yǎng)皿中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min 備用［19］。用移液器分別吸取200 μL 菌懸液至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻。配制好100 mg／mL 菌提取物的萃取液，分別吸取5 μL液體轉接至6 mm 的圓形濾紙片上制成藥敏片自然晾干。用無菌鑷子夾取制備好的藥敏片平貼于含菌平板上，每組3 個重復，28℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小。選擇100 mg／mL 青霉素鈉與恩諾沙星溶液作為該實驗的陽性對照［20］。

3 實驗結果與分析

3.1 內生真菌鑒定結果 從新鮮采取胡蔓藤的根、莖、葉和花中分離純化得到60 株菌株，從宏觀菌落形態(tài)及顯微形態(tài)（圖1）鑒定并去重后，獲得30 株不同菌株。對此30 株菌種進行分子生物學鑒定（表1），共17 個種，來自于7 目、7 科、9 屬。60 株內生真菌中，在根中分離得到15 株內生真菌，占總菌株數的25%，鑒定為4 屬、5 個種，分別為木霉屬Trichoderma spirale，節(jié)菱孢屬Arthriniumsp.、Arthrinium saccharicola，枝孢屬Cladosporiumsp.，鏈格孢屬Alternaria alternat。莖中分離得到26株內生真菌，占總菌株數的43%，鑒定為7 屬、11個種，包括間座殼屬Diaporthe eres，刺盤孢屬Colletotrichum gloeosporioides，節(jié)菱孢屬Arthrinium saccharicola，枝孢屬Cladosporiumsp.，鏈格孢屬Alternaria alternata、Alternaria burnsii、Alternaria brassicicola、Alternariasp.YXM4，平臍蠕孢屬Bipolaris setariae，青霉屬Penicillium citrinum、Penicilliumsp.YL201。葉中分離得到18 株內生真菌，占總菌株數的30%，鑒定為5 屬、7 個種，分別為刺盤孢屬Colletotrichum siamense、Colletotrichum gloeosporioides，小叢殼屬Glomerellasp.R207，節(jié)菱孢屬Arthrinium saccharicola，枝孢屬Cladosporiumsp.，鏈格孢屬Alternaria alternata、Alternariasp.YXM4。花中分離得到1 株內生真菌，占總菌株數的2%，鑒定為間座殼屬Diaporthesp.。鏈格孢屬Alternaria的菌株共有18 株，占總菌株數的30%，節(jié)菱孢屬Arthrinium有12 株，占總菌株數的20%，這2 個屬內生真菌為胡蔓藤優(yōu)勢屬內生真菌。計算胡蔓藤根、莖、葉、花中內生真菌多樣性指數分別為1.494、2.266、1.798、0。莖明顯高于根、葉、花。其中，根、莖和葉中均存在的菌株為枝孢屬Cladosporiumsp.、互生鏈格孢Alternaria alternata，僅存在于根中的內生真菌為木霉屬Trichoderma spirale，節(jié)菱孢屬Arthriniumsp.、Arthrinium arundinis，僅存在于莖中的內生真菌有間座殼屬Diaporthe eres，鏈格孢屬Alternaria burnsii、Alternaria brassicicola，平臍蠕孢屬Bipolaris setariae，青霉屬Penicillium citrinum、Penicilliumsp.YL201，僅在葉中分離得到的內生真菌為刺盤孢屬Colletotrichum siamense、小叢殼屬Glomerellasp.R207，僅在花中分離得到的內生真菌為間座殼屬Diaporthesp.（表2）。

表1 胡蔓藤內生真菌ITS 序列鑒定結果

表2 胡蔓藤不同部位不同內生真菌數量

圖1 內生真菌WM-11 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)圖

3.2 內生真菌抗菌性結果 在鑒定出的17 種胡蔓藤內生真菌中，能對金黃色葡萄球菌產生抗性的菌株有14 種，占內生真菌總數的82%，能對大腸桿菌產生抗性的菌株有12 種，約占內生真菌總數的71%（表3）。抗金黃色葡萄球菌的陽性對照抑菌直徑為（36.57±0.05）mm，抗大腸桿菌的陽性對照抑菌直徑為（33.03±0.37）mm。相比于對照組，胡蔓藤內生真菌中，對金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著的有WM-12（Alternaria burnsii）抑菌直徑為（21.53±0.39）mm、WM-3（Colletotrichum siamense）抑菌直徑為（19.43±0.33）mm、WM-14（Alternariasp.YXM4）抑菌直徑為（16.60±0.04）mm。對大腸桿菌抑菌效果顯著的有WM-14（Alternariasp.YXM4）抑菌直徑為（17.83±0.24）mm、WM-3（Colletotrichum siamense）抑菌直徑為（14.03±0.12）mm。對2 種指示菌都有抑制效果的共有11 種，占總菌種數的65%（表3、圖2）。

表3 胡蔓藤內生真菌抗菌活性

圖2 胡蔓藤內生真菌抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活性對比圖（均值±標準誤）

4 討論

圖3 抑菌效果

本實驗從胡蔓藤根、莖、葉和花中分離純化得到60 株菌種，共17 個種，來自于7 目、7 科、9屬，包括間座殼屬、刺盤孢屬、小叢殼屬、木霉屬、節(jié)菱孢屬、枝孢屬、鏈格孢屬、平臍蠕孢屬和青霉屬，其中，鏈格孢屬與節(jié)菱孢屬為優(yōu)勢屬。在分離得到的胡蔓藤內生真菌中，對金黃色葡萄球菌起抗性的菌株有14 種，約占內生真菌總數的82%，對大腸桿菌起抗性的菌株有12 種，約占內生真菌總數的71%，此研究結果表明來自于新鮮的胡蔓藤植物體內的內生真菌活性較強，并且存在許多迫切需要開發(fā)的有價值的化學成分。在本實驗分離得到的17 種真菌中，間座殼屬、刺盤孢屬、小叢殼屬、節(jié)菱孢屬、枝孢屬、鏈格孢屬、平臍蠕孢屬中多為植物病原菌，而木霉屬的真菌可寄生于多種植物病原菌。胡蔓藤的真菌報道較少，本研究為胡蔓藤內生真菌的研究提供了實驗基礎。一直以來，胡蔓藤藥理研究多集中在腫瘤細胞毒活性，對于其抗菌活性未曾報道。通過對來自于胡蔓藤植物體內的內生真菌抑菌性探究發(fā)現，對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌2 種指示菌均有抑制效果的菌株共有11 種，約占總菌種數的65%，這些有價值的內生真菌屬于廣譜抗菌活性菌種。內生真菌在其生活過程中，往往會產生和其宿主類似的化學成分，這也提示藥用植物胡蔓藤具有抗菌活性的研究價值，值得進一步深入研究。