盛國(guó)躍 （浙江省金華市教育教學(xué)研究中心 浙江金華 321017）

煙草花葉病毒的感染和重建實(shí)驗(yàn)，是證明核酸是遺傳物質(zhì)的證據(jù)鏈中關(guān)鍵的一環(huán)。學(xué)生在學(xué)習(xí)時(shí)，經(jīng)常會(huì)對(duì)該實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)操作產(chǎn)生疑惑。其原因有2 個(gè)：其一，在經(jīng)全國(guó)中小學(xué)教材審定委員會(huì)2004年及2019年初審?fù)ㄟ^(guò)的各個(gè)版本的高中生物學(xué)教材對(duì)這一實(shí)驗(yàn)的介紹都很少，例如，人教版教材只是簡(jiǎn)單說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，蘇教版教材只以“知識(shí)海洋”的方式作了簡(jiǎn)介，浙科版教材雖然對(duì)該實(shí)驗(yàn)的著墨相對(duì)較多，但也基本未提及具體的操作過(guò)程；其二，與生物學(xué)教學(xué)相關(guān)的期刊中，此方面的相關(guān)論文也極少。本文以浙科版教材為例對(duì)學(xué)生經(jīng)常產(chǎn)生的3 個(gè)疑惑點(diǎn)進(jìn)行探析。

1 使煙草花葉病毒感染煙草的操作方法

1.1 疑惑：如何進(jìn)行煙草花葉病毒感染煙草的操作

在浙科版高中生物學(xué)教材中多次提及“感染”操作，例如，“用RNA 和蛋白質(zhì)分別去感染煙草”“分別來(lái)自不同病毒株系的RNA 和蛋白質(zhì)混合后感染煙草”等［1］。但教材中并未提及“感染”的具體操作方法，在其他章節(jié)中也未出現(xiàn)可供參考的內(nèi)容，這讓許多學(xué)生對(duì)此產(chǎn)生疑惑。

1.2 探索：從原始文獻(xiàn)中尋找答案

疑惑的價(jià)值在于激發(fā)學(xué)生探索的欲望，并指引學(xué)生完成探索過(guò)程。文獻(xiàn)檢索是解決來(lái)源于科學(xué)史的疑惑的有效方法之一。為了解決這一疑惑，學(xué)生在教師的引導(dǎo)下進(jìn)行了2 個(gè)階段的文獻(xiàn)檢索。第1 階段的檢索過(guò)程如下：①在中國(guó)知網(wǎng)中以“煙草花葉病毒”為關(guān)鍵詞，以中等教育（各類(lèi)各科教學(xué)法、教學(xué)參考書(shū)、輔導(dǎo)用書(shū)）為范圍，進(jìn)行檢索，共檢索到38 篇相關(guān)文獻(xiàn)，但這些文獻(xiàn)均不能解決這一疑惑；②以“煙草花葉病毒”為關(guān)鍵詞，在中國(guó)知網(wǎng)中擴(kuò)大范圍進(jìn)行檢索，檢索到的部分文獻(xiàn)中指出可通過(guò)摩擦接種的方法使煙草花葉病毒感染煙草。然而這一階段的檢索結(jié)果并未使全體學(xué)生信服，因?yàn)椋糠謱W(xué)生認(rèn)為科學(xué)研究在一定程度上依賴(lài)當(dāng)時(shí)的科技水平，現(xiàn)代的操作技術(shù)在Fraenkel-Conrat H.、Williams R.C.等科學(xué)家所處的時(shí)代不一定適用。想要了解科學(xué)家在當(dāng)時(shí)進(jìn)行改實(shí)驗(yàn)時(shí)的操作方法，就必須查閱他們關(guān)于此實(shí)驗(yàn)最初發(fā)表的文獻(xiàn)?；诖苏归_(kāi)第2 階段的檢索過(guò)程如下：①在中國(guó)知網(wǎng)、國(guó)家科技圖書(shū)文獻(xiàn)中心等網(wǎng)站中進(jìn)行Fraenkel-Conrat H.、Williams R.C.等科學(xué)家的姓名檢索，未檢索到相關(guān)文獻(xiàn)。②利用聯(lián)合計(jì)算機(jī)圖書(shū)館中心 （Online Computer Library Center，OCLC） 進(jìn)行科學(xué)家姓名檢索，檢索到了“Recons－titution of active tobacco mosaic virus from Its inactive protein and nucleic acid components”“Virus reconstitution：Ⅱ.Combination of protein and nucleic acid from different strains”等2 篇原始論文。這2 篇論文證實(shí)了“煙草花葉病毒的感染和重建實(shí)驗(yàn)”中采用是摩擦接種的方法（注：下文中疑惑點(diǎn)的探索過(guò)程與該探索過(guò)程基本相同，故在下文中不再贅述）。

1.3 解析：感染操作采用常規(guī)的摩擦接種法

煙草花葉病毒有很多類(lèi)型，不同類(lèi)型的侵染方式不同，但它們都無(wú)特殊的吸附結(jié)構(gòu)，故只能以被動(dòng)方式侵入，例如，借助昆蟲(chóng)的刺吸式口器或植物天然傷口侵入。其中TMV 可通過(guò)相鄰葉片摩擦形成的輕微傷口侵入。在自然條件下被煙草花葉病毒侵染后的種子、葉片等是主要侵染源。煙株發(fā)生感染的主要時(shí)期是苗期至現(xiàn)蕾期，此時(shí)煙株抵抗煙草花葉病的能力弱，易感病。在本實(shí)驗(yàn)中，使煙草花葉病毒感染煙草的常規(guī)方法是摩擦接種。具體的操作是選取生長(zhǎng)期、長(zhǎng)勢(shì)相同的煙草若干，在葉片表面噴灑金剛砂，用刷子蘸取病毒液輕輕摩擦，重復(fù)幾次［2］。接種后需用清水輕輕沖洗葉片葉面，以利于植株發(fā)病。由于TMV 發(fā)病最適溫度為25～27℃，當(dāng)溫度高于38℃后，病毒會(huì)受到高溫的抑制，因此，實(shí)驗(yàn)應(yīng)在20～30℃溫室內(nèi)進(jìn)行。

2 將煙草花葉病毒的RNA 與蛋白質(zhì)相互分離的操作方法

2.1 疑惑：如何人為地將煙草花葉病毒的RNA與蛋白質(zhì)相互分離

浙科版教材在“煙草花葉病毒（a、b）及其對(duì)葉子細(xì)胞的感染和病毒重建（c）”示意圖中標(biāo)出，通過(guò)“降解”的方法將TMV 的RNA 與蛋白質(zhì)相互分離，但沒(méi)有寫(xiě)明其降解的具體方法。受酶解法除去植物細(xì)胞的細(xì)胞壁等知識(shí)的影響，多數(shù)學(xué)生錯(cuò)誤地認(rèn)為在該實(shí)驗(yàn)中也是用酶解法進(jìn)行“降解”的。

2.2 解析：用石碳酸處理或堿性洗滌劑處理可使煙草花葉病毒的RNA 與蛋白質(zhì)相互分離

Gierer 和Schramm 在進(jìn)行煙草花葉病毒的感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用將TMV 置于水和苯酚（石碳酸）中，而將蛋白質(zhì)和RNA 相互分離（圖1）。其基本操作是將TMV 溶液與苯酚的水溶液混合，并將此液配制成含有3%十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.3 mol／L NaAc 的溶液。在4℃下劇烈振蕩，離心后取水相，即可得到TMV 的RNA［2］。

圖1 將TMV 置于水和苯酚中震蕩［3］

Fraenkel-Conrat H.和Williams R.C.在進(jìn)行煙草花葉病毒的重建實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用先將TMV 用弱堿性洗滌劑處理，然后通過(guò)分別提純的方法將TMV的RNA 和蛋白質(zhì)相互分離。其基本的操作是，在3℃條件下，將TMV 溶液置于pH 值為10～10.5 的甘氨酸緩沖液或pH 值為10.5 的碳酸氫鹽緩沖液中透析48～72 h。用冷超速離心法分離除去未降解的病毒，用硫酸銨將上清液調(diào)至pH 值為0.4 的飽和液并再次離心。離心后TMV 的蛋白質(zhì)主要存在于沉淀中，而RNA 主要存在于上清液中。對(duì)蛋白質(zhì)部分進(jìn)行重新溶解，經(jīng)在低硫酸銨濃度下沉淀、透析等操作后可獲得純度高、重組效果好的TMV 的蛋白質(zhì)［4-5］。

從經(jīng)堿降解的TMV 中提取的核酸組分，其重組效果不如用洗滌劑法提取的核酸組分。洗滌劑法提取核酸的基本操作是，將含有1% SDS 的病毒溶液的pH 值調(diào)整為8.5，并在40℃下保持16～20 h。用硫酸銨使蛋白質(zhì)沉淀后，取上清液。將上清液冷藏、離心，并用冷乙醇和pH 值為5 的乙酸鹽進(jìn)一步純化?？色@得重建效果好的TMV 的RNA。

3 將提純后的RNA 和蛋白質(zhì)體外重建的操作方法

3.1 疑惑：如何實(shí)現(xiàn)煙草花葉病毒的體外重建

在浙科版教材中，關(guān)于煙草花葉病毒重建操作的相關(guān)表述只有一句：“來(lái)自不同病毒株系的RNA和蛋白質(zhì)混合后感染煙草”［1］。至于RNA 和蛋白質(zhì)應(yīng)該在什么樣的環(huán)境中進(jìn)行混合，混合后又應(yīng)置于什么樣的環(huán)境中等問(wèn)題都沒(méi)有說(shuō)明。這就容易導(dǎo)致學(xué)生簡(jiǎn)單的認(rèn)為只要病毒的核酸和蛋白質(zhì)在細(xì)胞外相遇即可自發(fā)重建，不需要特殊處理。

3.2 解析：體外重建效果受pH 值和離子強(qiáng)度等因素的影響

TMV結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，是一種典型的棒狀植物病毒，約由2 130 個(gè)相同的蛋白亞基沿著單鏈RNA 螺旋狀而成，有較強(qiáng)的自組裝特性。體外重建的效果受pH值和離子強(qiáng)度等因素的影響。Fraenkel-Conrat H.和Williams R.C.在進(jìn)行重建活性病毒時(shí)的基本操作是，將1%蛋白質(zhì)溶液與0.1%核酸溶液按一定比例混合，并添加適當(dāng)?shù)木彌_液，使樣品呈現(xiàn)乳白色。pH 值為6 的醋酸鹽作為緩沖劑的效果最好，但磷酸鹽（pH 值為6.3 或7.0）和乙酸銨（pH 值為6）也可使用。將樣品置于3℃環(huán)境下保存24 h 后，進(jìn)行超速離心，除去不可溶物質(zhì)，獲得乳白色上清液。即可從乳白色上清液中獲得有活性的重組病毒［4-5］。用電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在重建過(guò)程中最初形成的是圓盤(pán)狀，帶有中心孔的蛋白質(zhì)聚集體（圖2），最終形成的重組煙草花葉病毒的形態(tài)與正常TMV 相同，但短片段比例較大（圖3）。

圖2 重組過(guò)程中初始形成的蛋白質(zhì)聚集體（120 000×）［4］

圖3 重組煙草花葉病毒顆粒（60 000×）［4］

4 小結(jié)

受限于課程的性質(zhì)、文本的篇幅等因素，高中生物學(xué)教材不可能對(duì)各種生物學(xué)知識(shí)都加以詳盡的介紹。學(xué)生在學(xué)習(xí)過(guò)程中也難免會(huì)出現(xiàn)一些困惑，教師應(yīng)積極引導(dǎo)學(xué)生解決困惑。查閱科學(xué)家最初發(fā)表的相關(guān)研究論文是解決困惑的有效方法之一，在幫助學(xué)生解決困惑的同時(shí)，幫助學(xué)生理解“科學(xué)知識(shí)可能隨著研究的深入而改變”“科學(xué)受到社會(huì)和文化的影響”等科學(xué)本質(zhì)。獲得原始文獻(xiàn)的途徑主要有：館際文獻(xiàn)資源共享庫(kù)，例如，華東地區(qū)西文生物醫(yī)學(xué)期刊聯(lián)目數(shù)據(jù)庫(kù)、聯(lián)合計(jì)算機(jī)圖書(shū)館中心；中外文期刊數(shù)據(jù)庫(kù)，例如，中國(guó)知網(wǎng)；國(guó)內(nèi)、外著名圖書(shū)情報(bào)機(jī)構(gòu)、文獻(xiàn)服務(wù)部門(mén)，例如，美國(guó)衣阿華大學(xué)醫(yī)學(xué)圖書(shū)館檢索系統(tǒng)（handin MD），http://www.lib.uiowa.edu/hardin-www hslibs.html 提供美國(guó)各州、加拿大及部分英國(guó)、德國(guó)醫(yī)學(xué)院校和醫(yī)院圖書(shū)館網(wǎng)址和免費(fèi)醫(yī)學(xué)雜志網(wǎng)址，均可方便地查詢(xún)所需信息；協(xié)會(huì)組織和出版機(jī)構(gòu)的站點(diǎn)，例如，亞洲橋醫(yī)學(xué)信息快遞站。