袁衛(wèi)東，顏鴻遠，陳盛秋，陳中文，陳昌婕*

1.蘄春縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北 蘄春 438300；2.湖北中醫(yī)藥大學 中藥資源中心，湖北 武漢 430065；3.湖北惠春蘄艾健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，湖北 蘄春 438300

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyiLévl.et Van的干燥葉，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛、祛濕止癢等功效[1]，為中醫(yī)臨床常見用藥，具有悠久的應用歷史?，F(xiàn)代藥理表明，艾葉中富含揮發(fā)油、黃酮、酚酸等類成分，具有消炎抗菌、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[2]，被廣泛應用于醫(yī)藥產(chǎn)品、動物飼料、消毒劑等產(chǎn)品中。除此之外，艾葉碾磨篩去粉末之后即為艾絨，可以用來制作艾柱，對治療類風濕關(guān)節(jié)炎[3]、潰瘍性結(jié)腸炎[4]等療效較好，可以防治多種傳染性疾病[5]。蘄春是艾葉的道地產(chǎn)區(qū)，蘄艾自明朝以來就廣受推崇。目前，對不同產(chǎn)地艾葉品質(zhì)的比較研究也證明了蘄艾的道地性[6-7]。中藥材原植物在不同的生長階段化學成分含量差異較大[8]，適宜的采收期對于保證蘄艾的品質(zhì)具有重要作用。歷代本草對于艾葉采收期的記載不盡相同，從唐代的三月初三至宋代的五月初五，再至明代逐步過渡到端午節(jié)前后[9]，現(xiàn)代研究也證明6 月未開花前采收的艾葉品質(zhì)較好[10-12]。

在采收次數(shù)上，除河南省南陽市部分產(chǎn)區(qū)艾采收2～3 次（頭茬艾于5—6 月采收，二茬艾于8 月采收，三茬艾于10 月采收）外，包括湖北省蘄春縣在內(nèi)的大部分產(chǎn)區(qū)一般于端午節(jié)前后進行1 次采收。3 月初艾苗進入快速生長階段，5 月后生長速度明顯趨于緩慢，于6 月未開花前進行采收后，蘄艾再次進入營養(yǎng)生長階段，干物質(zhì)快速積累，至8 月已經(jīng)長成較成熟的艾株。生產(chǎn)上，由于二茬艾的質(zhì)量不明確，為了保證蘄春蘄艾的品牌價值，第一次采收之后再次生長的蘄艾往往被擱置，產(chǎn)生了大量的浪費。為充分利用蘄艾資源、提高其經(jīng)濟價值、最大限度降低對土地資源的浪費，本研究對蘄艾頭茬艾與二茬艾的產(chǎn)量和品質(zhì)進行了系統(tǒng)分析，為二茬艾的合理利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Trace 1310 型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher 公司）；1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；JSM-6510 型掃描電子顯微鏡（日本電子公司）。

1.2 試藥

對照品異澤蘭黃素（批號：B21568）、棕矢車菊素（批號：B21708）均購于上海源葉生物科技有限公司，純度均為98.0%；對照品新綠原酸（批號：X-014-180410）、隱綠原酸（批號：Y-067-180425）、異綠原酸A（批號：Y-068-190329）、異綠原酸B（批號：Y-069-180105）、異綠原酸C（批號：Y-070-180515）均購于成都瑞芬生物科技有限公司，純度均為98.0%；對照品綠原酸（批號：110753-201716，純度：99.3%）購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 樣品

試驗地位于湖北省蘄春縣管窯鎮(zhèn)胡崗村蘄艾試驗示范基地，試驗采用壟作種植[13]，壟幅寬80 cm，壟溝寬30 cm，壟高25 cm。于2019 年12 月5 日將蘄艾根狀莖截成15～25 cm，按照每壟種2 行，行距40 cm，株距10 cm 進行定植，其余按蘄艾種植常規(guī)的農(nóng)事操作進行。蘄艾由湖北中醫(yī)藥大學中藥資源中心劉大會教授鑒定為菊科植物艾Artemisia argyiLévl.et Van。試驗設頭茬艾（對照）和二茬艾2 個處理，于2020 年5 月25 日采收頭茬艾，2020 年8月1日對再次萌發(fā)的艾進行2次采集。

2 方法

2.1 農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量測定

每次采收前，在試驗地不同方位隨機選取3 個采樣點測定蘄艾生長指標和產(chǎn)量。各采樣點選取具有代表性的15 株蘄艾測定相關(guān)農(nóng)藝性狀，株高為地面基部至蘄艾莖頂端的高度；莖徑為蘄艾莖稈高度1/2處的直徑；枯葉高為植株莖稈中下部枯葉處的高度；葉片寬和葉片長為每株蘄艾中部葉片的寬、長。每個采樣點按長10 m、寬5 m 進行拉線測產(chǎn)。收割后及時晾干，稱定葉片、莖稈的干質(zhì)量并計算葉莖干質(zhì)量比。

2.2 出絨率測定

采用四分法從每份艾葉樣品中稱取艾葉干品10 g，置轉(zhuǎn)速為28 000 r·min-1的高速萬能粉碎機中粉碎30 s，將粉碎后的混合物置一號篩中，反復篩凈粉末，即得艾絨。計算艾絨質(zhì)量占總質(zhì)量的比例，每份樣品進行2 次平行實驗，以其平均值為出絨率。

2.3 總揮發(fā)油及揮發(fā)性成分測定

2.3.1 總揮發(fā)油提取 選取干燥艾葉40 g，剪碎后置2000 mL 圓底燒瓶中，加入蒸餾水1000 mL，浸泡過夜，參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015 年版通則揮發(fā)油測定法[13]提取7 h，收集并測定艾葉干品中總揮發(fā)油含量。

2.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析 采用TG-1701 MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）對樣品進行GC-MS 分析[14]，得到揮發(fā)油總離子流圖，見圖1。

圖1 艾葉揮發(fā)油GC-MS圖

2.3.3 供試品溶液制備 吸取脫水后的艾葉揮發(fā)油，加入二氯甲烷稀釋100倍，即得。

2.4 黃酮和酚酸類成分含量測定

2.4.1 超高效液相色譜（UPLC）條件 利用UPLC測定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、棕矢車菊素、異澤蘭黃素的含量[15]。對照品和艾葉UPLC圖見圖2。

圖2 混合對照品和艾葉UPLC圖

2.4.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、棕矢車菊素、異澤蘭黃素適量，用甲醇制成含新綠原酸25.39 μg·mL-1、綠原酸60.27 μg·mL-1、隱綠原酸19.36 μg·mL-1、異綠原酸B 72.71 μg·mL-1、異綠原酸A 279.22 μg·mL-1、異綠原酸C 40.12 μg·mL-1、棕矢車菊素40.87 μg·mL-1、異澤蘭黃素78.69 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取艾葉粉末（過一號篩）0.1 g 于25 mL 量瓶中，加入色譜純甲醇定容至刻度線，稱定質(zhì)量，放置過夜，超聲處理30 min，冷卻至室溫后用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5 數(shù)據(jù)分析

利用Mainlib 數(shù)據(jù)庫進行譜庫檢索并結(jié)合相關(guān)文獻[15-16]對GC-MS 圖中的色譜峰進行定性分析；利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2004 A版對艾葉揮發(fā)油GC-MS圖譜進行分析；采用SIMCA-P14.1軟件進行主成分分析（PCA）；采用Excel 2010 與SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 植株農(nóng)藝性狀比較

從表1 可知，二茬艾與頭茬艾的株高、莖粗差異有統(tǒng)計學意義，分別降低了50.26%和37.66%。二茬艾的枯葉與頭茬艾相比增加了16.37%，葉片長、葉片寬分別降低了4.53%和7.16%，差異均無統(tǒng)計學意義。由此可見，二茬艾的農(nóng)藝性狀不如頭茬艾，主要表現(xiàn)在株高與莖粗上，但枯葉高、葉片長、葉片寬的差異無統(tǒng)計學意義。

表1 頭茬艾與二茬艾的植株農(nóng)藝性狀比較（,n=3）

表1 頭茬艾與二茬艾的植株農(nóng)藝性狀比較（,n=3）

注：與頭茬艾比較，大寫字母表示P＜0.01。

3.2 產(chǎn)量比較

從圖3 可知，二茬艾葉片干質(zhì)量、莖稈干質(zhì)量和總干質(zhì)量均與頭茬艾差異有統(tǒng)計學意義。二茬艾葉片干質(zhì)量與頭茬艾相比降低了38.46%，莖稈干質(zhì)量降低了47.46%，總干質(zhì)量降低了50.79%。頭茬艾平均葉莖比為0.59，二茬艾平均葉莖比為0.87，二茬艾的葉莖比比頭茬艾提高了47.46%。說明二茬艾的產(chǎn)量較頭茬艾明顯降低，但葉莖比明顯提高。

圖3 頭茬艾與二茬艾產(chǎn)量比較（,n=3）

3.3 葉片出絨率比較

出絨率是評價艾葉質(zhì)量的重要指標之一，出絨率越高，說明艾葉中非腺毛密度越高，越適宜作為制造灸材的原材料。從圖4可以看出，二茬艾的出絨率與頭茬艾相比提高了66.34%。利用掃描電鏡在200 倍放大倍數(shù)下觀察頭茬艾與二茬艾植株中部葉片背部非腺毛并拍照，從圖5可以看出，二茬艾葉片中非腺毛的密度明顯高于頭茬艾。這說明二茬艾中非腺毛的積累量明顯高于頭茬艾，葉片的出絨率較高。

圖4 頭茬艾與二茬艾出絨率比較（,n=3）

圖5 頭茬艾與二茬艾中部葉片掃描電鏡圖（×200）

3.4 葉片總揮發(fā)油及揮發(fā)性組分比較

3.4.1 總揮發(fā)油含量比較 從圖6 可知，二茬艾的總揮發(fā)油含量與頭茬艾相比降低了12.9%，但差異無統(tǒng)計學意義。這說明與頭茬艾相比，二茬艾葉片中總揮發(fā)油的積累量較低，但降低幅度較小。

圖6 頭茬艾與二茬艾中總揮發(fā)油含量（,n=3）

3.4.2 揮發(fā)性組分比較 取6 批艾葉樣品提取總揮發(fā)油，按揮發(fā)性成分含量測定方法檢測，得到總離子流圖，將各揮發(fā)油的GC-MS 圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A 版，生成6 批樣品指紋圖譜（圖7）和指紋圖譜相似度（表2），3批頭茬艾與3 批二茬艾組內(nèi)相似度均大于0.95，所有批次的艾葉相似度均大于0.90，符合指紋圖譜要求。

表2 艾葉揮發(fā)油GC-MS 指紋圖譜相似度

圖7 頭茬艾和二茬艾GC-MS指紋圖譜

由GC-MS 分析結(jié)果可知，頭茬艾與二茬艾葉片中揮發(fā)油化學成分的種類差異不大，從頭茬艾與二茬艾葉片揮發(fā)性成分中選取萜類、烯類和酯類化合物共31 種共有成分，見表3。采用峰面積歸一化法計算頭茬艾與二茬艾中這31 種成分所占總流出峰面積的平均相對百分含量，這31 種共有成分分別占頭茬艾與二茬艾總揮發(fā)性成分的75.08%和74.60%。其中，質(zhì)量分數(shù)超過5%的共有成分有桉油精（頭茬艾16.55%、二茬艾17.04%）、異龍腦（頭茬艾11.47%、二茬艾5.72%）、側(cè)柏酮（頭茬艾9.99%、二茬艾10.94%）、D-樟腦(頭茬艾6.58%、二茬艾9.78%)和（-）-4-萜品醇（頭茬艾5.81%、二茬艾5.70%），這5 種揮發(fā)性成分總含量分別占頭茬艾與二茬艾葉片總揮發(fā)油含量的50.40%和49.19%。二茬艾中桉油精、側(cè)柏酮、D-樟腦、反式石竹烯等15 種共有成分的含量多于頭茬艾，其中8 種共有成分含量顯著高于頭茬艾，而異龍腦、乙酸冰片酯、（-）-4-萜品醇等16 種成分含量低于頭茬艾，其中8 種共有成分含量顯著低于頭茬艾。頭茬艾與二茬艾中桉油精的含量差異不大，但二茬艾中龍腦的含量顯著低于頭茬艾。由此可見，雖然頭茬艾與二茬艾葉片中揮發(fā)性組分無明顯差異且主要藥用成分桉油精的差異較小，但16 種揮發(fā)性組分的相對含量差異較大，說明頭茬艾與二茬艾葉片中各揮發(fā)性組分的積累存在明顯差異。

表3 頭茬艾與二茬艾葉片中揮發(fā)性成分相對質(zhì)量分數(shù)（,n=3）

表3 頭茬艾與二茬艾葉片中揮發(fā)性成分相對質(zhì)量分數(shù)（,n=3）

注：與頭茬艾相比，小寫字母表示P＜0.05；大寫字母表示P＜0.01；表4同。

3.5 葉片黃酮和酚酸類成分比較

從表4 可知，頭茬艾與二茬艾葉片中隱綠原酸、異綠原酸B 和異綠原酸A 的含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），棕矢車菊素的含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與頭茬艾相比，二茬艾葉片中異綠原酸B、異綠原酸A 和棕矢車菊素的含量分別增加了34.89%、97.97%和614.74%，隱綠原酸的含量降低了48.48%，而新綠原酸、綠原酸、異綠原酸C 和異澤蘭黃素的含量差異無統(tǒng)計學意義。說明頭茬艾和二茬艾中葉片中各黃酮和酚酸類成分含量差異較大，除隱綠原酸外，二茬艾中其余黃酮和酚酸類成分含量均有所增加或差異不大，整體來說，二茬艾葉片中黃酮及酚酸類成分含量高于頭茬艾。

表4 頭茬艾與二茬艾葉片黃酮和酚酸類成分質(zhì)量分數(shù)（,n=3） mg·g?1

表4 頭茬艾與二茬艾葉片黃酮和酚酸類成分質(zhì)量分數(shù)（,n=3） mg·g?1

3.6 葉片中化學成分的PCA

PCA 是一種無監(jiān)督模式的識別方法，可通過降維的方式直觀展現(xiàn)多變量的樣品差異。將頭茬艾與二茬艾葉片總揮發(fā)油及31 種揮發(fā)性成分含量、8 種黃酮和酚酸類成分含量導入SIMCA-P14.1 軟件進行分析，得PCA 得分圖（圖8）。可以看出頭茬艾與二茬艾沿著PC1 軸方向具有明顯的區(qū)分趨勢，且6 批樣品可完全按照采集時間進行歸類，這說明了頭茬艾與二茬艾葉片中化學成分差異明顯。

圖8 頭茬艾與二茬艾化學成分的PCA得分

4 討論

頭茬作物和二茬作物的產(chǎn)量及品質(zhì)差異較大，劉剛等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)，二茬燕麥與頭茬燕麥相比經(jīng)濟產(chǎn)量和單位面積粗蛋白含量較低；李春宏等[18]發(fā)現(xiàn)，二茬高粱的產(chǎn)量顯著高于頭茬高粱。本試驗中，二茬艾的株高與莖粗顯著低于頭茬艾，這可能是由于5 月蘄艾第一次采收前經(jīng)歷了長時間的營養(yǎng)積累，而二茬艾營養(yǎng)生長期天氣炎熱，氣候條件和水分狀況及根系活力不如3—5 月，到了8 月，蘄艾進入開花前的物質(zhì)準備階段而停止生長，因此蘄艾的生長速度和物質(zhì)積累時間不如頭茬艾，導致二茬艾的葉片干質(zhì)量、莖稈干質(zhì)量顯著低于頭茬艾。頭茬艾收割之后，留茬主稈上開始萌發(fā)2～5 個側(cè)芽，生長成新的蘄艾植株，因此二茬艾的莖稈較細，也解釋了二茬艾葉莖比顯著高于頭茬艾的結(jié)果。

將艾葉粉碎可以制成艾絨，艾絨的主要成分是一種特殊形態(tài)的非腺毛[19]，主要分布于艾葉的背部，在炎熱的夏季可以降低葉片的蒸騰作用，防止水分過度散失，保證植株正常的生理代謝[20]。在本試驗中，二茬艾的出絨率顯著高于頭茬艾，這可能是由于二茬艾的營養(yǎng)生長期氣候炎熱，蘄艾為了抵御不良環(huán)境而分化出了更多的非腺毛。也有研究證明，隨著艾葉葉齡增大，其非腺毛逐漸脫落，出絨率降低[21]，而二茬艾的葉齡較頭茬艾更低，與該研究結(jié)果一致。艾葉中富含豐富的揮發(fā)油、黃酮和酚酸類成分，是衡量艾葉品質(zhì)的主要因素。二茬艾中的總揮發(fā)油含量與頭茬艾相比降低了12.9%，兩者的GC-MS 總離子流圖較為相似，但其各組分含量差異明顯。桉油精和龍腦是艾葉在《中國藥典》2020 年版中的規(guī)定成分[22]，對于呼吸系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病的治療有良好的效果[23]，頭茬艾與二茬艾中桉油精成分含量差異不大，但頭茬艾中龍腦含量明顯高于二茬艾；側(cè)柏酮和樟腦是艾葉揮發(fā)油中已知的毒性成分[24]，側(cè)柏酮對于肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)有明顯毒性，樟腦對于生殖器官、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟和心臟具有不良反應，二茬艾中的側(cè)柏酮和D-樟腦含量高于頭茬艾，由此可見，頭茬艾揮發(fā)油的產(chǎn)量及藥理活性優(yōu)于二茬艾，但總體來說差異不明顯。艾葉中的黃酮和酚酸類成分具有鎮(zhèn)痛消炎、改善血液循環(huán)、溫經(jīng)止血等作用[2]，二茬艾中除隱綠原酸含量有所下

降之外，其余成分均為上升或變化較小，這說明二茬艾中黃酮和酚酸類成分含量較高，質(zhì)量較好。

綜上所述，二茬艾雖葉片產(chǎn)量不如頭茬艾，但蘄艾采收2茬與采收1茬相比可增產(chǎn)61.5%，增產(chǎn)幅度較大。二茬艾的出絨率較高，適宜作為制作灸材的原材料，創(chuàng)造較高的經(jīng)濟效益；二茬艾總揮發(fā)油含量略低于頭茬艾，但藥用活性成分桉油精含量無明顯差異；除此之外，二茬艾中黃酮和酚酸類成分含量總體來說優(yōu)于頭茬艾，質(zhì)量較好。因此，生產(chǎn)實踐上可以通過采收二茬艾提高蘄艾的產(chǎn)量，且二茬艾質(zhì)量較優(yōu)，可以加以利用，減少對資源的浪費。