常貝貝 張 碩 于曉麗 杜曉云 劉 偉 姜中武 趙玲玲

（1煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺 264005；2山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺 265500；3山東省蘋果·果業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，煙臺 264003）

我國蘋果屬果樹歷史悠久，文字記載首次出現(xiàn)在西漢，記錄在司馬相如創(chuàng)作的 《上林賦》中，較詳細(xì)的記載可以追溯至魏晉時期[1]。蘋果已經(jīng)成為世界上種植面積最大的果樹樹種之一，是我國主要消費(fèi)果品之一，深受廣大市民喜愛。目前育出的蘋果品種多為二倍體，多倍體品種數(shù)量較少。而農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，主要種植的農(nóng)作物均為多倍體，如小麥為異源六倍體、馬鈴薯為同源四倍體、花生為異源四倍體、甘薯為同源六倍體等。由于多倍體品種性狀表現(xiàn)優(yōu)良，隨著蘋果產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，生產(chǎn)上對優(yōu)質(zhì)品種的需求增加，開展多倍體品種培育研究顯得尤其重要。

1 多倍體果樹研究概況

多倍體是指含有三套或者三套以上完整染色體組的生物體，根據(jù)染色體組來源的差異，可分為同源多倍體和異源多倍體兩種類型。很多植物在經(jīng)染色體加倍后表現(xiàn)出植株強(qiáng)壯、生長旺盛、抗逆性強(qiáng)等特性，擁有此等優(yōu)良性狀的多倍體植物在自然界中普遍存在，多倍體是影響植物進(jìn)化的重要因素，也是形成新品種的重要途徑之一[2]。多倍體植株主要采用現(xiàn)代生物技術(shù)如組織培養(yǎng)技術(shù)對誘導(dǎo)的植株加以培養(yǎng)獲得。目前被育種者們成功誘變出的多倍體果樹已有很多種，如柿、山楂、獼猴桃、石榴、棗 、葡萄、梨、香蕉和蘋果等。其中‘沾冬2號’是晚熟鮮食二倍體品種‘冬棗’自然變異中選育出的大果型、且擁有眾多優(yōu)良性狀的新品種，經(jīng)過鑒定為二、四混倍體[3]。 葡萄品種‘巨玫’‘玫瑰香’為四倍體，梨品種‘黃蓋梨’為三倍體，山楂品種中‘大金星’為三倍體，桂林‘良豐無核柑’為二、四混倍體。當(dāng)前培育的蘋果品種主要為二倍體，三倍體品種為數(shù)不多，其主要品種類型有‘北海道’‘喬納金’‘北斗’‘陸奧’等，而在少數(shù)品種中出現(xiàn)過四倍體類型，如‘金冠’和‘嘎拉’等，但是在栽培中應(yīng)用較少。

2 多倍體產(chǎn)生途徑

2.1 自然產(chǎn)生多倍體

果樹中天然多倍體可分為苗期自然多倍體和自然芽變產(chǎn)生的多倍體。三倍體蘋果品種‘大珊瑚’‘赤龍’‘緋之衣’等是從自然實生變異中選出的，這些三倍體品種可能都是通過2n配子途徑產(chǎn)生的?！篪喞妗旌ｘ喞妗恰喞妗耐此谋扼w芽變。通過比對已經(jīng)鑒定的40種蘋果屬植物，結(jié)果顯示其二倍體品種多達(dá)30個，多倍體品種有10個，且以三倍體品種居多，四倍體和五倍體則相對較少。天然多倍體在其它果樹中也廣泛存在，如草莓生產(chǎn)上應(yīng)用的主要栽培品種是八倍體，柿樹、獼猴桃為六倍體。雖然多倍體在自然界中可通過加倍獲得，但數(shù)量不多，隨機(jī)性較強(qiáng)，且頻率較低，在自然條件差的情況下，會出現(xiàn)不能生長甚至死亡的狀況，在生產(chǎn)中獲得大面積的應(yīng)用和栽植比較困難。

2.2 有性雜交獲得多倍體

蘋果多倍體在自然界中實際存在已久，但通過自然突變獲得完全四倍體的頻率很低，且嵌合體嚴(yán)重。實踐證明，二倍體之間雜交、二倍體和多倍體之間雜交的方法也可以獲得多倍體。就蘋果而言，許多多倍體品種都是通過二倍體品種間雜交育成，比如‘陸奧’‘喬納金’‘世界一’‘北斗’等均是由二倍體與三倍體雜交獲得。二倍體之間雜交雖然可以獲得各種類型的多倍體，但出現(xiàn)多倍體的幾率很低。除了蘋果以外，其它果樹品種，如梨、葡萄等多種果樹也通過有性雜交途徑成功獲得多倍體品種。研究結(jié)果表明，由于產(chǎn)生的后代中親本的優(yōu)良性狀易于丟失，通過有性雜交方式獲得多倍體需要優(yōu)質(zhì)父本和母本作為雜交基礎(chǔ)。

2.3 人工誘導(dǎo)多倍體

通過有性階段和無性階段均可產(chǎn)生多倍體，有性階段是通過減數(shù)分裂過程中小孢子母細(xì)胞或大孢子母細(xì)胞不減數(shù)產(chǎn)生了2n配子形成多倍體，無性階段則是體細(xì)胞分裂過程中通過染色體加倍且細(xì)胞不分裂形成多倍體。人工誘導(dǎo)多倍體主要有兩種途徑，分別為物理方法誘導(dǎo)和化學(xué)方法誘導(dǎo)。機(jī)械創(chuàng)傷、溫度驟變和摘心處理等是為最常用的物理方法。在20世紀(jì)初期，使植物形成加倍的不定芽方法主要有嫁接、切傷、反復(fù)摘心法等，例如在番茄上，通過摘心實現(xiàn)多倍體誘導(dǎo)[4]，但其誘變率較低，定向性比較差，產(chǎn)生的嵌合體較多。目前這些物理方法誘導(dǎo)多倍體技術(shù)主要應(yīng)用在一些具有營養(yǎng)繁殖優(yōu)勢的植物上。

化學(xué)方法是如今比較常用的誘變方法，一些化學(xué)試劑如乙烯亞胺、甲基黃酸乙酯、疊氮化合物、羥胺、抗生素、秋水仙素等等，均對植物分生組織有加倍效應(yīng)。秋水仙素即秋水仙堿，是最常用的化學(xué)誘變試劑，熔點(diǎn)高達(dá)157℃，易溶于水、乙醇，味苦，有毒。1937年，Blakeslee等用秋水仙素誘導(dǎo)，使曼陀羅等植物的染色體數(shù)加倍且獲得了成功。自此，秋水仙素便被作為培育植物新品種的主要誘變劑，為了提高誘變率，常常將誘變與葉片離體再生相結(jié)合。歐春青等[5]以試管苗葉片為外植體，用不同濃度秋水仙素處理‘寒富’蘋果的離體葉片獲得其同源四倍體植株，證明了葉片再生過程中想要獲得四倍體，用秋水仙素處理是一個較為有效的途徑。賈少樺[6]在葉片再生培養(yǎng)基中加入秋水仙素獲得了‘珠美海棠’的四倍體植株。

3 多倍體的鑒定方法

3.1 形態(tài)學(xué)鑒定法

相較于二倍體而言，多倍體在形態(tài)學(xué)上的差異主要表現(xiàn)為巨大性，該特性是多倍體植株最為直觀的外部形態(tài)特征，具體表現(xiàn)為高大的植株，莖干明顯粗壯，根系發(fā)達(dá)，葉片明顯肥厚，果實和花朵均明顯增大等。馬躍等[7]實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過秋水仙素誘導(dǎo)以后獲得的同源四倍體植株相比二倍體植株，其葉片在形態(tài)上，更大、更厚。利用植株外部形態(tài)特征進(jìn)行倍性鑒定，可直觀的在苗期做出早期鑒定，大大減輕工作量，該方法的缺點(diǎn)是準(zhǔn)確度不夠高，誤差大[8]。

3.2 染色體計數(shù)法鑒定

染色體計數(shù)法有常規(guī)壓片法和去壁低滲法兩種。

就壓片法而言，一般情況下以根尖、莖尖、卷須、愈傷組織等為材料，經(jīng)過醋酸洋紅或蘇木精等進(jìn)行染色壓片，然后在顯微鏡下對細(xì)胞分裂中期的染色體數(shù)目進(jìn)行觀察并計數(shù)，在此過程中需要比較熟練的操作技能。李林光等[9]使用壓片法對多倍體植株進(jìn)行了鑒定，經(jīng)鑒定莖尖染色體數(shù)表明多半變異植株為同質(zhì)四倍體。在某種程度上，該鑒定方法也有一定的缺點(diǎn)，如步驟太多，比較繁瑣，要對需要鑒定的每株植株進(jìn)行解離、染色、制片，并用顯微鏡仔細(xì)觀察數(shù)出染色體具體數(shù)目，需要有較高的試驗條件，對操作水平也有較高要求，否則容易在各個環(huán)節(jié)出現(xiàn)誤差。

Gamage和 Schmidt[10]研制了一種新的染色體制片法，利用常規(guī)去壁滴滲法用DAPI染色和熒光顯微鏡檢測相結(jié)合，能更清晰地看到染色體，適用于很多種木本植物，并已應(yīng)用于柑橘，是較理想的直接鑒定方法。

3.3 流式細(xì)胞儀法鑒定

流式細(xì)胞儀越來越多地被應(yīng)用于植物倍性鑒定。其鑒定原理是直接測定細(xì)胞的DNA含量，以此來快速鑒別植株的染色體倍性水平。這種方法操作步驟簡單，且結(jié)果更為準(zhǔn)確，已廣泛應(yīng)用于蘋果等植物的倍性鑒定。流式細(xì)胞儀不僅可以檢測單倍體和多倍體，還可以很準(zhǔn)確地識別再生植物中的少量混合細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞，避免傳統(tǒng)檢測方法不能全面的觀察數(shù)量產(chǎn)生的檢測誤差。除此之外，該種方法不用考慮植物體取材部位以及細(xì)胞所處的時期，即葉片、莖、根、花、果皮、種子等均可以作為取材部位，而且所需材料較少，不影響植物的生長和發(fā)育。但此方法也存在一些弊端和不足，最大的問題是測定費(fèi)用較高，對于一般育種單位來說在經(jīng)濟(jì)方面有一定的困難。目前，用流式細(xì)胞計數(shù)法已應(yīng)用于大部分果樹的倍性鑒定[11]。但這種方法只能準(zhǔn)確鑒定出同質(zhì)多倍體的數(shù)目，未知染色體數(shù)目的植物無法確定其染色體數(shù)，還需通過結(jié)合直接鑒定法進(jìn)行鑒定，異源多倍體和有性雜交而得到的多倍體也無法確定其染色體來源。

4 問題與展望

近年來，通過蘋果多倍體的選育，培育了眾多優(yōu)良品種，很大程度上豐富了我國的蘋果種質(zhì)資源。有關(guān)蘋果多倍體的研究也越來越多，蘋果多倍體育種的途徑也多種多樣。其中，最為常用的多倍體誘導(dǎo)技術(shù)是以不同濃度秋水仙素誘導(dǎo)蘋果植株獲得多倍體。此種方法操作簡單，誘變率高，但此種方法不易獲得純合的蘋果植株，容易出現(xiàn)嵌合體，性狀分離現(xiàn)象較多。而嵌合體的純化過程，費(fèi)時又費(fèi)力。通過離體胚狀體途徑是解決嵌合體純化問題最為有用的方案，但是對于蘋果而言，周期還是太長，因此，仍有必要繼續(xù)探索新方法，以便短時間內(nèi)更快地獲得蘋果多倍體。