郭 姝 何萬(wàn)領(lǐng) 李曉麗

河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院微量元素與生物健康實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng)471023

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid ，DHA）是一種重要的ω-3 脂肪酸，由于可以促進(jìn)大腦發(fā)育、減少產(chǎn)后抑郁、治療癌癥、抑制發(fā)炎、改善老人癡呆等，被用于保健品和食品中。同時(shí)因?yàn)閷?duì)于嬰幼兒智力及視力發(fā)育尤其重要，成為某些品牌奶粉的最大賣(mài)點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，DHA 可以改善畜禽的生產(chǎn)性能，產(chǎn)出含DHA 的畜產(chǎn)品，對(duì)畜牧業(yè)也有著深遠(yuǎn)的影響。海洋微藻是DHA 的直接來(lái)源且經(jīng)濟(jì)環(huán)?！，F(xiàn)階段微藻的培養(yǎng)技術(shù)日益成熟，不僅油脂含量高而且產(chǎn)量穩(wěn)定，通過(guò)發(fā)酵微藻來(lái)提取油脂制備DHA已經(jīng)成為了研究的熱點(diǎn)方向。其中，裂殖壺菌因?yàn)榭梢陨a(chǎn)多種不飽和脂肪酸，并具有非常高的脂質(zhì)百分比而成為獲取DHA 的最佳選擇。關(guān)于裂殖壺菌產(chǎn)脂肪酸的研究主要涉及誘變、破壁、發(fā)酵、金屬離子的影響、培養(yǎng)條件和提取技術(shù)幾個(gè)方面，但總結(jié)性報(bào)告較少。為此，本文梳理概述裂殖壺菌在生產(chǎn)脂肪酸方面的相關(guān)技術(shù)，以期為海洋微藻的研究和DHA行業(yè)的后續(xù)發(fā)展提供參考。

1 裂殖壺菌的誘變

誘變是指通過(guò)控制外部環(huán)境條件誘使遺傳基因隨之變異，然后在產(chǎn)生的變異株中選出實(shí)驗(yàn)所需要的優(yōu)良品種。誘變通?？梢源笾路譃槲锢碚T變和化學(xué)誘變。物理誘變指利用射線、微波或激光等來(lái)處理菌株，因此也稱(chēng)為輻射育種。在物理誘變中，應(yīng)用最廣泛的2 種方法是紫外誘變和常壓室溫等離子體誘變?；瘜W(xué)誘變是使用一些化學(xué)藥物促使菌株的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，這些化學(xué)藥物也稱(chēng)為誘變劑?；瘜W(xué)誘變的誘變劑主要包括某些烷化劑、抗生素、堿基類(lèi)似物等，常見(jiàn)的誘變劑有硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、乙烯亞胺和疊氮化鈉等。

1.1 常壓室溫等離子體（ARTP）誘變

常壓室溫等離子體（ARTP）是近幾年新提出的一種大氣壓輝光放電冷等離子體源。它能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25～40 ℃的、具有高活性粒子濃度的等離子體射流，可以在與組織或者細(xì)胞之間發(fā)生如催化、診斷、激發(fā)反應(yīng)等復(fù)雜而可控的生化過(guò)程，因而廣泛應(yīng)用于誘變育種。ARTP 在生物領(lǐng)域的應(yīng)用有如下優(yōu)點(diǎn)：效率高，成本低，操作簡(jiǎn)單，綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[1]。

研究表明，ARTP 誘變可用于蘇云金芽孢桿菌及其他菌種提高高產(chǎn)率[2]。袁軍等[3]將編號(hào)為ATCC20888 原始裂殖壺菌菌株的懸浮液經(jīng)過(guò)ARTP處理后，在2，2’-聯(lián)吡啶平上板培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)所有突變菌株并通過(guò)磷酸香草醛油脂快速檢測(cè)法和氣相色譜分析，最后選育出的DHA高產(chǎn)菌株油脂中的主要飽和脂肪酸含量明顯下降，而不飽和脂肪酸含量明顯增加。

1.2 紫外誘變

紫外線是一種非電離輻射，可以通過(guò)促使DHA分子形成嘧啶二聚體，減弱雙鍵間氫鍵的作用，并引起雙螺旋結(jié)構(gòu)扭曲變形，還可以引起堿基轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失[4]。目前紫外誘變已經(jīng)廣泛用于多種菌種。高若珊等[5]通過(guò)紫外誘變的方式獲得了4株比原始菌株耐熱性、產(chǎn)酸性更好的菌株，可以在75 ℃的溫度30 min 以后依然保持較好的活力和產(chǎn)酸能力，其中編號(hào)為1.1801-1912Z 的菌株比原菌種產(chǎn)酸量提高了31.05 g/L。田磊等[6]紫外誘變篩選小柴旦鹽湖鹽單胞菌得到產(chǎn)量超過(guò)原始菌株2倍的正向突變菌株。劉薈[7]經(jīng)38 W 的紫外燈下，誘變距離20 cm 對(duì)小球藻CS-510 進(jìn)行紫外誘變，篩選得到的藻株發(fā)酵以后的生物量和油脂含量分別比出發(fā)菌株提高了11.3%和34.3%。許永等[8]通過(guò)采用紫外誘變選育出的兩株突變裂殖壺菌的菌株，其生物量和DHA 含量分別較對(duì)照組高8.08%、11.57%和13.74%、28.75%。

1.3 復(fù)合誘變

在長(zhǎng)期使用誘變劑之后，菌株很容易產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”。這種效應(yīng)會(huì)延長(zhǎng)菌株的生長(zhǎng)周期、減少孢子量、減慢代謝等，對(duì)發(fā)酵工藝的控制極其不利。為了避免這種情況的產(chǎn)生，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以采用幾種誘變劑復(fù)合處理或者交叉處理菌株的方法進(jìn)行誘變。復(fù)合誘變包括：先后使用兩種及以上誘變劑，重復(fù)使用同一種誘變劑和同時(shí)使用兩種及以上的誘變劑。一般認(rèn)為，復(fù)合誘變可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，假如使用兩種及以上誘變劑進(jìn)行合理搭配使用遠(yuǎn)比一種誘變劑的誘變效果好。

李慧玲等[9]通過(guò)對(duì)裂殖壺菌進(jìn)行紫外線和硫酸二乙酯的復(fù)合因素的誘變，通過(guò)篩選培育以后獲得一株正向突變的優(yōu)勢(shì)菌株，在相同的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，比原始菌種的生物量、油脂和DHA 產(chǎn)量分別提高了7.54%、16.65%、48.79%。趙犇等[10]對(duì)裂殖壺菌的原始菌株進(jìn)行甲基磺酸乙酯和ARTP 復(fù)合誘變，并將通過(guò)2 種因素復(fù)合誘變選育出來(lái)的菌株與2 種單因子分別誘變篩選出來(lái)的菌株進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，復(fù)合誘變的正突變率達(dá)到32.2%，遠(yuǎn)高于2 種單因子誘變；復(fù)合誘變選育出的裂殖壺菌菌株，其DHA 產(chǎn)量和DHA 在油脂中的比例比原始菌株分別高35.6%和19.2%。李?lèi)偯鞯萚11]用化學(xué)試劑亞硝基胍和紫外線相結(jié)合的方式對(duì)生產(chǎn)用裂殖壺菌進(jìn)行誘變，篩選得到一株優(yōu)勢(shì)突變菌株。其油脂含量和DHA含量比出發(fā)菌株分別提高17%和14%。

2 裂殖壺菌的破壁與油脂提取

裂殖壺菌的細(xì)胞壁很難被破碎，因此發(fā)酵培養(yǎng)以后的油脂提取率較低[12]。在科學(xué)實(shí)驗(yàn)或者生產(chǎn)實(shí)踐的過(guò)程中，選擇哪種方法來(lái)破碎裂殖壺菌的細(xì)胞壁，對(duì)油脂的得率和品質(zhì)有著重大影響，同時(shí)也決定油脂提取的生產(chǎn)成本。因而找出高效、便捷和綠色環(huán)保的細(xì)胞破碎方法，對(duì)DHA產(chǎn)業(yè)未來(lái)的發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義。

目前，破壁的方法主要有酸熱法、生物酶法、均質(zhì)法、蒸爆法、超聲法、反復(fù)凍融法、微波法、真空冷凍干燥后提取和噴霧干燥后提取法。研究表明，與其他方法相比，酸熱法和生物酶法不僅操作便捷，而且提取的油脂含量和DHA含量也最高，但是缺點(diǎn)是若大規(guī)模使用酸熱法提取油脂較為耗能；生物酶解法不僅破壁效果好，油脂得率高，還具有比其他方法明顯的優(yōu)越性，在酶解過(guò)程中，成本較低，綠色環(huán)保，因此，適宜進(jìn)行大規(guī)模油脂提取[13-14]。均質(zhì)法、蒸爆法和超聲法提取的油脂含量與酸熱法和酶解法相比較低。從工業(yè)化的角度來(lái)看，超聲法破壁提取油脂對(duì)于設(shè)備要求比較高，蒸爆法則耗能耗時(shí)，相比之下均質(zhì)法則較為理想，油脂中DHA 含量?jī)H次于酸熱法和酶解法。其他的破壁方法如反復(fù)凍融法、噴霧干燥法和真空冷凍干燥的破壁效果均不理想。

3 裂殖壺菌的發(fā)酵

發(fā)酵指通過(guò)微生物在有氧或無(wú)氧條件下的生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)制備菌體自身或代謝產(chǎn)物的過(guò)程。微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平依賴(lài)于菌種自身的特性、發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵的環(huán)境條件[15]。現(xiàn)階段國(guó)際上對(duì)于裂殖壺菌的研究主要集中發(fā)酵條件的優(yōu)化，如碳源、氮源、碳氮比、無(wú)機(jī)鹽以及溶氧量、pH 等方面的研究[16-18]。裂殖壺菌的培養(yǎng)主要分為細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂階段和脂質(zhì)積累階段，因此采用兩步發(fā)酵法即采用分批發(fā)酵培養(yǎng)和培養(yǎng)條件改變，可以實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵和油脂的大量積累[19]。在細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂階段需要提供足夠的營(yíng)養(yǎng)以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的蛋白質(zhì)、核苷等的合成。

裂殖壺菌的生物量、油脂產(chǎn)量及DHA的積累受到多方面發(fā)酵因素的影響。碳源和氮源的添加量和添加比例對(duì)油脂的合成有重要影響。研究顯示，在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)糖可以提高發(fā)酵后裂殖壺菌的生物量，促進(jìn)油脂和DHA的積累，但糖濃度不宜太高，否則會(huì)抑制裂殖壺菌的發(fā)酵[20-22]。在裂殖壺菌的發(fā)酵過(guò)程中，溶氧量也是生產(chǎn)油脂、積累DHA 的重要影響因素之一。在裂殖壺菌合成不飽和脂肪酸的過(guò)程中，氧的有效供給促進(jìn)不飽和脂肪酸代謝過(guò)程中的去飽和反應(yīng)，從而直接決定油脂中脂肪酸的組成和含量[23]。但是為獲取足夠的溶氧量生產(chǎn)DHA而在發(fā)酵過(guò)程中采取通氣培養(yǎng),也會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，添加消泡劑可以解決這個(gè)問(wèn)題,但會(huì)在一定程度上抑制菌體生長(zhǎng)[24]。研究表明，在轉(zhuǎn)速和裝液量都相同的條件下，在擋板三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵比在普通三角瓶，溶氧量更高，因而在擋板搖瓶中發(fā)酵的裂殖壺菌的油脂含量更高，發(fā)酵時(shí)間更短[25]。另外，pH也是研究最多的影響發(fā)酵效果的關(guān)鍵因素之一[26]，發(fā)酵培養(yǎng)基的酸堿度將直接影響菌體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的合成。有研究發(fā)現(xiàn)，前4 d 的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 值控制在3，后2 d 控制為5 時(shí)，總脂肪酸和DHA 的產(chǎn)量較大[27]。除此之外，還有很多添加劑對(duì)裂殖壺菌的發(fā)酵具有促進(jìn)作用。任路靜等[28]的實(shí)驗(yàn)表明，在裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加生物素，可以有效促進(jìn)油脂積累，淺藍(lán)菌素可以提高DHA及不飽和脂肪酸含量，適當(dāng)添加VB1、VB3、VB6、VB12對(duì)DHA 積累也有促進(jìn)作用，與生物素復(fù)合使用以后促進(jìn)作用更加明顯。VB12、生物素、VB1、VB6、VB3按照一定的質(zhì)量濃度加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，96 h 以后生物量和DHA 產(chǎn)量分別比對(duì)照組提高了16.4% 和53.8%[29]。此外，檸檬酸和蘋(píng)果酸也對(duì)DHA 的產(chǎn)量有積極影響[30]。

研究表明，微量元素大都對(duì)微生物生產(chǎn)性能有所影響。曹憲周等[31]發(fā)現(xiàn)，Ca2+、Fe2+和Cu2+可以促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)。而裂殖壺菌自身不僅含有豐富的Mg、Ca、Na、Fe 等元素，并含有少量的Cu、Mn、K、Zn、Al[32]，可見(jiàn)微量元素是裂殖壺菌生長(zhǎng)過(guò)程中必不可少的因素。金屬離子可以直接影響菌體中合成脂肪酸的酶的活性，因此對(duì)金屬離子的研究具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。但是現(xiàn)階段關(guān)于金屬離子對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA影響的研究仍然較少。

4 研究展望

隨著生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越注重營(yíng)養(yǎng)和保健，而DHA可以促進(jìn)大腦發(fā)育，改善視力，具有廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)撃?。目前的研究結(jié)果表明，我國(guó)在裂殖壺菌油脂產(chǎn)量和DHA 含量方面的研究成果與國(guó)外相比仍有很大差距。因此，今后應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)誘變選育高產(chǎn)量的菌株，深入優(yōu)化裂殖壺菌的發(fā)酵工藝，提高生物量、油脂產(chǎn)量和DHA 含量。同時(shí)盡快推廣應(yīng)用于食品和飼料，最大地發(fā)揮其市場(chǎng)價(jià)值。