李嘉興，李明意

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023； 2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 湛江 524001)

肝臟由肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等組成，是機(jī)體最重要的實(shí)質(zhì)性器官之一，具有代謝脂類蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)血容量和維持水電解質(zhì)平衡等生理功能[1]。肝炎、脂肪肝、肝硬化和肝癌等肝臟相關(guān)疾病的發(fā)病率逐漸升高，已成為世界范圍內(nèi)導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。2010年，全球超過200萬(wàn)人死于肝臟疾病(包括急性肝炎、肝硬化和肝癌)，約占全球死亡人數(shù)的4%[2-3]。導(dǎo)致肝臟損傷的因素較多，包括藥物性肝損傷、化學(xué)損傷、病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等。肝臟再生潛能巨大，根據(jù)不同損傷方式和程度肝臟表現(xiàn)出不同的再生方式[4]。因此，有效激發(fā)正常肝細(xì)胞的再生潛能、促進(jìn)肝損傷的修復(fù)、維持肝臟正常的生理功能是治療肝臟疾病的關(guān)鍵。目前研究者對(duì)肝臟再生機(jī)制的認(rèn)識(shí)和理解均來自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因此研究肝臟再生動(dòng)物模型有助于了解肝損傷后再生的調(diào)控機(jī)制，指導(dǎo)臨床肝臟疾病的治療?，F(xiàn)就肝臟再生動(dòng)物模型的研究進(jìn)展予以綜述。

1 部分肝切除模型

1.170%肝切除模型 最經(jīng)典的肝切除模型是大鼠70%肝切除模型，該模型將大鼠肝臟的左外葉和中葉切除，相當(dāng)于切除大鼠70%的肝臟[5]。正常情況下，大多數(shù)肝細(xì)胞處于靜止期，只有不到1%的肝細(xì)胞進(jìn)入增殖期以更新衰老的肝細(xì)胞[6]，維持肝臟正常的生理功能。70%肝切除模型只切除了部分肝臟，且不會(huì)對(duì)剩余肝細(xì)胞造成任何損傷，因此是研究肝細(xì)胞正常增殖調(diào)控的良好模型。K?hler等[7]通過研究大鼠肝切除模型發(fā)現(xiàn)，門靜脈周圍肝細(xì)胞中的Notch-1和齒狀蛋白1表達(dá)升高，同時(shí)Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核易位在肝切除后增加并于15 min內(nèi)達(dá)峰值；而使用干擾小RNA沉默Notch-1和齒狀蛋白1則可導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖減少，從而減緩肝臟再生。另有研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)可通過Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域/蛋白激酶B/缺氧誘導(dǎo)因子-1α通路調(diào)節(jié)肝臟再生，抑制Notch信號(hào)通路可阻礙肝細(xì)胞由S期向M期轉(zhuǎn)化，從而影響肝臟再生[8]。Grijalva等[9]通過研究70%肝切除模型發(fā)現(xiàn)，Yes相關(guān)蛋白的活化和核定位在肝臟再生的早期即開始增加，且術(shù)后前3天增加最顯著，并隨著肝臟恢復(fù)到原來的體積而逐漸降至正常水平。還有研究發(fā)現(xiàn)，Yes相關(guān)蛋白過表達(dá)可直接促進(jìn)肝細(xì)胞增殖或通過Notch-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控使成熟的肝細(xì)胞去分化為肝祖細(xì)胞，從而增加肝臟體積或促進(jìn)肝損傷修復(fù)[10-11]。有研究顯示，Yes相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄共刺激因子缺失的肝切除模型突變體小鼠的肝細(xì)胞不能有效進(jìn)入細(xì)胞周期，導(dǎo)致肝臟完全再生受阻[12]。以上研究表明，Notch和Hippo信號(hào)通路可通過激活DNA復(fù)制促進(jìn)正常肝細(xì)胞增殖或去分化為肝祖細(xì)胞，參與肝部分切除后的肝臟再生。

1.2極限肝切除模型 臨床上，對(duì)于巨大肝癌或肝臟腫物的患者通常采取擴(kuò)大肝切除術(shù)，對(duì)肝臟進(jìn)行較大范圍切除。由于切除的肝臟較大，患者剩余肝臟功能儲(chǔ)備不足，患者術(shù)后易發(fā)生急性肝衰竭。研究術(shù)后肝衰竭的病理生理機(jī)制、促進(jìn)術(shù)后肝臟再生、提高術(shù)后存活率是臨床肝膽外科面臨的主要問題。在不同的部分肝切除術(shù)中，肝細(xì)胞均出現(xiàn)肥大，僅在70%肝切除和90%肝切除術(shù)中出現(xiàn)肝細(xì)胞增殖[13]。因此，促進(jìn)行擴(kuò)大肝切除術(shù)患者的肝臟再生、減少肝癌患者圍手術(shù)期肝衰竭的發(fā)生，對(duì)于提高中晚期肝癌患者的預(yù)后具有重要意義。Zhai等[14]發(fā)現(xiàn)，CXC趨化因子受體4拮抗劑AMD3100聯(lián)合小劑量免疫抑制劑FK506可誘導(dǎo)內(nèi)源性骨髓干細(xì)胞分化，促進(jìn)行擴(kuò)大肝切除術(shù)后小鼠的肝臟再生，并改善其肝功能。Kim等[15]研究表明，血管升壓素可顯著提高90%肝切除大鼠的存活率，表明生長(zhǎng)抑素對(duì)術(shù)后肝臟再生有一定促進(jìn)作用。

1.3反復(fù)肝切除模型 反復(fù)肝切除模型由Simpson和Finckh[16]于1963年建立，吳毅平和吳在德[17]在此基礎(chǔ)上嘗試以不同的切肝量反復(fù)切除大鼠肝臟，旨在闡述反復(fù)肝切除的可行性。Saito等[18]通過建立連續(xù)兩次70%肝切除大鼠模型發(fā)現(xiàn)，二次肝切除后肝細(xì)胞仍具有較大的再生潛能。肝臟部分切除術(shù)是肝癌治療的首選方法，但肝癌術(shù)后5年腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍高達(dá)40%～70%[19]。Li等[20]發(fā)現(xiàn)，二次手術(shù)切除肝復(fù)發(fā)腫瘤的療效良好，術(shù)后5年存活率為54.4%，與初次手術(shù)的療效相近。有報(bào)道稱，肝切除后會(huì)出現(xiàn)術(shù)后粘連，從而增加術(shù)中出血量和手術(shù)時(shí)間，因此反復(fù)肝切除會(huì)增加手術(shù)的病死率[21]。Arima等[22]研究發(fā)現(xiàn)，接受二次肝切除與單次肝切除肝癌患者的白蛋白等生化指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩組患者的肝臟再生能力相似。此外，Wicherts等[23]通過比較1990—2010年接受手術(shù)治療的肝結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移患者發(fā)現(xiàn)，重復(fù)肝切除患者首次肝切除術(shù)后3年和5年的總生存率分別為76%和54%，而僅行一次肝切除術(shù)患者3年和5年的總生存率分別為58%和45%，表明重復(fù)肝切除可提高復(fù)發(fā)性肝癌患者的生存率。以上研究表明，復(fù)發(fā)性肝癌患者仍可從二次肝部分切除術(shù)中受益。一項(xiàng)回顧性分析研究顯示，重復(fù)肝切除與單次肝切除患者在肝功能不全、膽漏和瘺管方面具有可比性，兩組病死率和總病死率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[24]。由于肝源短缺，臨床挽救性肝移植治療復(fù)發(fā)性肝癌存在局限性，而二次肝切除術(shù)可作為復(fù)發(fā)性肝癌的重要治療手段。

2 門靜脈結(jié)扎模型

家兔門靜脈結(jié)扎實(shí)驗(yàn)表明，將部分門靜脈分支結(jié)扎后，家兔肝葉出現(xiàn)萎縮，而未結(jié)扎的肝葉則出現(xiàn)代償性增生肥大[25]。有研究通過比較80%門靜脈結(jié)扎大鼠模型和80%肝切除大鼠模型發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白D1對(duì)兩種不同模型的肝細(xì)胞增殖均具有重要作用，而80%門靜脈結(jié)扎大鼠模型的存活率更高[26]。因此，門靜脈結(jié)扎模型作為肝臟再生動(dòng)物模型，具有更方便、穩(wěn)定、可靠等特點(diǎn)。Lauber等[27]將大鼠分為3組，分別行70%、80%和90%門靜脈結(jié)扎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同程度的門靜脈結(jié)扎后門靜脈壓均相應(yīng)升高；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，90%門靜脈結(jié)扎模型未結(jié)扎肝葉大鼠的有絲分裂肝細(xì)胞增加，且其有絲分裂細(xì)胞計(jì)數(shù)更早達(dá)到峰值，同時(shí)有絲分裂細(xì)胞數(shù)目顯著高于70%門靜脈結(jié)扎模型和80%門靜脈結(jié)扎模型大鼠。自噬是指細(xì)胞受到自噬信號(hào)誘導(dǎo)后在胞質(zhì)中形成自噬泡將待降解物包裹，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，從而將包裹的物質(zhì)降解的過程。研究發(fā)現(xiàn)，門靜脈結(jié)扎模型大鼠的自噬被激活，且自噬活性微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ/Ⅰ與Beclin1和細(xì)胞周期蛋白D1水平均呈正相關(guān)[28]。門靜脈栓塞或結(jié)扎是臨床治療肝癌的手段之一。對(duì)于需要行肝癌擴(kuò)大根治術(shù)的患者，由于切除的肝臟體積較大，且患者常伴有肝炎、肝硬化等肝臟疾病，導(dǎo)致術(shù)后剩余肝臟功能儲(chǔ)備不足以維持人體正常生理活動(dòng)，引起肝衰竭甚至死亡，因此限制了肝切除術(shù)的應(yīng)用。有報(bào)道稱，在肝癌擴(kuò)大切除術(shù)前行門靜脈結(jié)扎術(shù)，可增加剩余肝臟的體積，提高手術(shù)的安全性，減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生[29]。聯(lián)合肝臟離斷和門靜脈結(jié)扎的分階段肝切除術(shù)最早用于肝門部膽管癌的治療[25]。Schnitzbauer等[30]分析行聯(lián)合肝臟離斷和門靜脈結(jié)扎的分階段肝切除術(shù)的肝癌患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，術(shù)后5～28 d(中位時(shí)間9 d)殘余肝臟體積迅速增生，且殘余肝臟體積的中位增長(zhǎng)率達(dá)74%。不同程度門靜脈結(jié)扎可誘發(fā)不同強(qiáng)度的肝臟再生反應(yīng)，且自噬參與這一過程。肝部分切除術(shù)是治療肝癌的首選方法，但對(duì)于不適宜立即行肝部分切除術(shù)的患者，可以先行門靜脈結(jié)扎術(shù)，誘導(dǎo)肝臟再生，提高肝部分切除術(shù)耐受性，減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。門靜脈結(jié)扎模型的建立及研究可為肝癌患者提供更多的治療選擇。

3 化學(xué)損傷模型

肝臟再生是一個(gè)病理生理過程，臨床上許多肝病患者均存在不同程度的肝損傷。四氯化碳(CCl4)、D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GaIN)、酒精、硫代乙酰胺等均具有肝毒性，長(zhǎng)期過量應(yīng)用可導(dǎo)致肝臟損害、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡，從而引起肝細(xì)胞再生。構(gòu)建化學(xué)藥物肝損傷再生模型，模擬肝臟的再生過程，對(duì)研究肝臟不同性質(zhì)病變的再生調(diào)控機(jī)制、指導(dǎo)臨床肝臟疾病診治均具有重要意義。

3.1CCl4損傷模型 CCl4是建立化學(xué)藥物肝損傷動(dòng)物模型最常用的藥物之一，主要機(jī)制是CCl4進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)過肝臟代謝產(chǎn)生三氯甲基和氧自由基，這些自由基與肝細(xì)胞及線粒體膜上的磷脂分子共價(jià)結(jié)合，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致膜的結(jié)構(gòu)和功能破壞[31]。此外，自由基還可抑制細(xì)胞膜和線粒體膜鈣泵的活性，導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[32]。Foroutan等[33]通過單次腹腔注射CCl4構(gòu)建大鼠急性肝損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶水平均升高，肝細(xì)胞凋亡和炎癥增加?；ㄉ南┧嵝盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是炎癥過程的重要組成部分，有研究報(bào)道，在大鼠急性肝損傷模型中，CCl4可誘導(dǎo)花生四烯酸參與的c-Jun氨基端激酶/胞質(zhì)磷脂酶-2/12-脂肪氧化酶炎癥信號(hào)通路的激活，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥的發(fā)生[34]。朱安妮等[35]分別通過單次腹腔注射0.1%、0.2%和0.3%的CCl4建立小鼠急性肝損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCl4造成的急性肝損傷呈劑量依賴性；進(jìn)一步分析血漿轉(zhuǎn)氨酶水平變化發(fā)現(xiàn)，0.1% CCl4是建立小鼠急性輕度肝損傷模型的適宜濃度，有利于肝臟再生藥物的研究。長(zhǎng)期持續(xù)存在的肝損傷會(huì)導(dǎo)致肝臟發(fā)生纖維化，而肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化的重要環(huán)節(jié)。Duan等[36]在CCl4致大鼠肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，Notch通過激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶信號(hào)通路導(dǎo)致肝竇內(nèi)皮細(xì)胞去分化和肝纖維化，從而影響肝細(xì)胞增殖和肝臟再生。Delta樣配體4(Delta-like ligand 4，DLL4)是Notch信號(hào)通路的配體，主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)并維持肝竇穩(wěn)態(tài)。Chen等[37]發(fā)現(xiàn)，在人和CCl4誘導(dǎo)的鼠纖維化肝臟的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中DLL4表達(dá)上調(diào)，這與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)血管化和肝纖維化一致，而體內(nèi)沉默DLL4則可減輕肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化和CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。CCl4損傷模型是常用的藥物性肝損傷模型，可用于急性肝損傷甚至肝臟纖維化的研究，該模型可準(zhǔn)確反映肝臟的結(jié)構(gòu)、功能和代謝變化，是研究肝損傷病理機(jī)制和篩選護(hù)肝藥物的經(jīng)典模型。

3.2D-GaIN損傷模型D-GaIN是常見的引起肝損傷的肝毒性藥物[38]。D-GaIN造成肝損傷的主要機(jī)制是D-GaIN進(jìn)入肝細(xì)胞后與葡萄糖焦磷酸化酶結(jié)合，阻礙糖原合成，導(dǎo)致肝細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)受損，甚至引起肝細(xì)胞壞死[39]。此外，D-GaIN還可通過增加氧化應(yīng)激，產(chǎn)生活性氧類，引起線粒體功能障礙，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[32]。Yu等[40]發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21可通過激活核因子紅系2相關(guān)因子2觸發(fā)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路，減輕D-GaIN誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)小鼠肝臟造成的損傷，促進(jìn)肝臟再生。Wang等[41]發(fā)現(xiàn)，山楂酸可抑制脂多糖/D-GaIN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠血清和肝組織中炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素6-水平升高，上調(diào)肝組織中丙二醛和髓過氧化物酶活性；此外，山楂酸還可下調(diào)核因子κB的表達(dá)，上調(diào)核因子紅系2相關(guān)因子2和血紅素加氧酶1的表達(dá)。表明山楂酸通過抑制核因子κB和核因子紅系2相關(guān)因子2信號(hào)通路激活，保護(hù)脂多糖/D-GaIN誘導(dǎo)的肝損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌R005通過下調(diào)肝臟和腸道中的Toll樣受體、腫瘤壞死因子-α和核因子κB轉(zhuǎn)錄，降低促炎細(xì)胞因子的血漿濃度而表現(xiàn)出抗炎特性，可在一定程度上緩解D-GaIN造成的急性肝損傷[42]。總之，D-GaIN所致的肝臟損傷的病理變化與病毒性肝炎相近，故D-GaIN損傷模型是研究病毒性肝炎較理想的動(dòng)物模型。

3.3酒精性肝損傷模型 酒精性肝病是臨床肝膽外科常見的一類疾病，可誘發(fā)肝脂肪變性、肝進(jìn)行性纖維化、肝硬化甚至肝癌。因乙醇消費(fèi)導(dǎo)致的死亡約占全球總死亡人數(shù)的3.8%[43]。人體攝入乙醇后，首先在肝臟中通過乙醇脫氫酶系統(tǒng)、乙醇氧化酶系統(tǒng)和過氧化氫酶系統(tǒng)氧化代謝為乙醛，然后再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酸。乙醛代謝過程中的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量活性氧類，可造成肝細(xì)胞線粒體損傷或誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致酒精性肝病的主要原因。Lieber-DeCarli模型是目前研究慢性肝損傷應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物模型，該模型在液體飲食中添加高濃度的酒精，連續(xù)喂養(yǎng)大鼠4～12周，模擬人類肝臟慢性酒精中毒的病理改變[44]。Bertola等[45]通過Lieber-DeCarli流質(zhì)飲食4～6周以及在喂養(yǎng)期間多次單劑量酒精(5 g/kg)灌胃喂養(yǎng)小鼠，模擬臨床上有長(zhǎng)期慢性飲酒史的患者暴飲暴食后誘發(fā)的急性肝損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Lieber-DeCarli模型相比，慢性和暴飲暴食酒精除可導(dǎo)致小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高外，還可導(dǎo)致肝臟廣泛脂肪變性。有學(xué)者在酒精流質(zhì)飲食喂養(yǎng)小鼠4周的基礎(chǔ)上，再通過腹腔向小鼠體內(nèi)注射CCl4(每周2次，持續(xù)4周)，利用CCl4對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用誘發(fā)肝臟炎癥和肝纖維化[46]。理想的酒精性肝損傷模型對(duì)于研究和闡明酒精性肝損傷的病理機(jī)制以及促進(jìn)酒精性肝病的防治均具有重要意義。

4 小 結(jié)

不同類型的肝臟損傷應(yīng)采用不同的造模方法。良好的動(dòng)物模型可通過完整模擬疾病的發(fā)病特點(diǎn)、組織損傷和病理變化，為疾病病理機(jī)制的研究、診治以及藥物的研發(fā)等提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。肝臟損傷導(dǎo)致的肝臟疾病是影響人類健康的常見疾病。引起肝臟損傷的因素主要包括化學(xué)性、藥物性、酒精性及環(huán)境因素等，長(zhǎng)期肝臟損傷可誘發(fā)肝炎、脂肪肝、肝硬化甚至肝癌等疾病。因此，應(yīng)用不同的造模方式模擬不同肝臟疾病的病理特點(diǎn)，有助于促進(jìn)肝臟再生的研究，也可為相關(guān)肝損傷治療藥物及治療方法的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。