張冰冰，張偉，郭寒，李明洋，李小曼，李享，楊威，余麗蕓，徐闖

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院）

奶牛低鈣血癥是圍產(chǎn)期高產(chǎn)奶牛高發(fā)的一種以鈣穩(wěn)態(tài)失衡為主的疾病。數(shù)據(jù)顯示，發(fā)達(dá)國家規(guī)?；翀鰢a(chǎn)期奶牛低鈣血癥發(fā)病率達(dá)到50%以上，其中臨床型低鈣血癥的發(fā)病率接近5%[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，黑龍江省規(guī)?；鰢a(chǎn)期奶牛臨床型低鈣血癥發(fā)病率為2%~5%，而亞臨床低鈣血癥在分娩后12~24 h內(nèi)的發(fā)病率高達(dá)80%，產(chǎn)后3~14 d內(nèi)發(fā)病率為30%~45%[4]。奶牛低鈣血癥影響奶牛胃腸及子宮平滑肌收縮，增加產(chǎn)后奶牛真胃變位、酮病、胎衣不下和繁殖障礙等疾病的發(fā)生概率[5]。此外，奶牛低鈣血癥導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎、乳房炎等細(xì)菌感染引起的疾病高發(fā)[6-7]，給奶牛的健康和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重影響。在生理上，奶牛子宮腔內(nèi)細(xì)菌在產(chǎn)后前兩周將持續(xù)存在，很可能導(dǎo)致器官功能的損害，然而低鈣血癥奶牛顯著增加了子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生[8]。

低鈣血癥奶牛血漿皮質(zhì)醇濃度升高，中性粒細(xì)胞吞噬活性比例降低，以及單核細(xì)胞對抗原激活刺激的反應(yīng)受損[6]。有研究顯示，在產(chǎn)后頭3 d，血鈣<2.15 mmol·L-1的奶牛的總循環(huán)中性粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞吞噬能力和中性粒細(xì)胞氧化爆裂能力均降低[9]。面對每日暴露于單細(xì)胞病原體的環(huán)境，多細(xì)胞生物嚴(yán)重依賴先天免疫系統(tǒng)作為對入侵者的第一反應(yīng)。中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的終末分化細(xì)胞成分，約占外周白細(xì)胞總數(shù)的35%~75%。中性粒細(xì)胞作為機(jī)體第一道防線在感染初期的防御中起著重要作用，其殺滅病原體的方式主要包括遷移，吞噬，黏附，脫顆粒作用等。

Ca2+是機(jī)體各項(xiàng)生理活動中不可缺少的離子。在細(xì)胞內(nèi)，Ca2+開啟（或關(guān)閉）需要大量的效應(yīng)因子，這些效應(yīng)因子控制著關(guān)鍵的生物過程，如胞外作用（包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放和分泌）、肌肉收縮、受精、酶活性（例如，凝血級聯(lián)反應(yīng)）和對抗原的免疫反應(yīng)[10]。Ca2+也是多種細(xì)胞表面受體的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，參與細(xì)胞的能量代謝、增殖以及凋亡等病理生理過程[11]。鈣離子釋放激活的鈣通道蛋白（ORAI1）是一個(gè)33 kDa的蛋白，包含4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TM），n端和c端均位于胞質(zhì)中。它是一種位于質(zhì)膜中的高度Ca2+選擇性離子通道，介導(dǎo)“存儲操作”Ca2+信號。這些信號在調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，包括基因表達(dá)、生長、分泌和運(yùn)動。ORAI1通道在質(zhì)膜（PM）中起作用，但通過STIM1蛋白介導(dǎo)的ER和PM之間的動態(tài)膜間耦合過程被激活[12]。STIM1感知ER上Ca2+含量，Ca2+耗竭時(shí)形成斑塊狀結(jié)構(gòu)結(jié)合PM上的ORAI1，觸發(fā)Ca2+依賴的基因轉(zhuǎn)錄、T細(xì)胞激活或肥大細(xì)胞脫顆粒[13]。實(shí)驗(yàn)擬利用含不同濃度鈣離子培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，旨在研究低鈣條件下對中性粒細(xì)胞內(nèi)鈣的影響，為奶牛低鈣血癥對中性粒細(xì)胞免疫功能影響研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

從黑龍江省大慶市某集約化奶牛場篩選體況（3分，總分為5分）及胎次（2~4胎）相近的分娩后3 d內(nèi)的奶牛，從奶牛尾靜脈采血,肝素抗凝,分離血漿利用鈣測定試劑盒測定血鈣濃度后將它們分為兩組：健康對照組和低鈣血癥實(shí)驗(yàn)組，每組各3頭。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑：牛外周血中性粒細(xì)胞分離試劑盒，改良臺式液均購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液，PBS緩沖液購自Hyclone公司；鈣測定試劑盒購自美國愛德士公司；ORAI1抗體購自美國proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，F(xiàn)luo-3AM均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：FACSCalibvr型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；CO2培養(yǎng)箱購自德國BINDER公司；DT5-2B型低速臺式離心機(jī)，購自北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；低速離心機(jī)，購自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；生化分析儀，購自美國愛德士公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 奶牛血鈣濃度測定

選擇清晨喂料前，固定奶牛后通過牛尾靜脈采血5 mL收集在肝素抗凝管內(nèi)，室溫靜置冷卻后，經(jīng)3 000 rpm離心15 min，分離血漿，通過自動生化分析儀進(jìn)行奶牛血鈣濃度的檢測根據(jù)所檢測的血鈣濃度將奶牛分為兩組，一組為健康對照組，一組為低鈣血癥組。

1.3.2 奶牛血液中性粒細(xì)胞的分離

采用牛中性粒細(xì)胞分離試劑盒，根據(jù)該試劑盒說明書分離健康奶牛和低鈣血癥奶牛血液中性粒細(xì)胞。簡單概述為經(jīng)分離液分離，經(jīng)水平離心后收集細(xì)胞沉淀，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，經(jīng)三次洗滌后即為中性粒細(xì)胞。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面ORAI1蛋白豐度

為了分析鈣離子對圍產(chǎn)期奶牛血液中性粒細(xì)胞表面ORAI1蛋白的影響，實(shí)驗(yàn)將收集到的中性粒細(xì)胞按照細(xì)胞密度為5×105個(gè)·mL-1，經(jīng)改良臺氏液重懸后，加入ORAI1抗體室溫孵育40 min后離心棄上清，經(jīng)改良臺式液洗滌2次，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG避光孵育30 min后，經(jīng)1 500 rpm離心5 min，加改良臺氏液清洗2次后，利用流式細(xì)胞儀檢測奶牛血液中性粒細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，分析表面ORAI1蛋白蛋白的表達(dá)量。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子的檢測

為了檢測中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，實(shí)驗(yàn)將所分離到的中性粒細(xì)胞按照5×105個(gè)·mL-1密度進(jìn)行調(diào)整，經(jīng)染色液37℃孵育30 min進(jìn)行熒光探針裝載，1 500 rpm離心5 min后經(jīng)臺式液清洗，清洗后再孵育10 min，從而確保Fluo-3AM在細(xì)胞內(nèi)完全轉(zhuǎn)變成Fluo-3后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。染色液配置為：濃度為0.5μm·L-1的Fluo-3AM的溶液和臺氏液1∶1 000配置成染色液備用。

1.3.5 在不同濃度鈣的條件下培養(yǎng)中性粒細(xì)胞

將1.3.2步驟所述分離出的健康對照組的中性粒細(xì)胞分成四組，每組分別用加入0.2、0.6、1 mmol·L-1氯化鈣以及PBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，經(jīng)37℃，5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12、18 h，根據(jù)1.3.3、1.3.4步驟通過流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞表面ORAI1蛋白豐度和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光強(qiáng)度。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均利用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。同行數(shù)據(jù)后所標(biāo)*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液中鈣濃度檢測

由表1可知，健康對照組奶牛的血鈣濃度極顯著高于低鈣血癥實(shí)驗(yàn)組奶牛。

表1 健康組奶牛和低鈣血癥組奶牛血鈣濃度比較Table 1 Blood calcium of healthy cows and hypocalcemia cows

2.2 中性粒細(xì)胞膜表面ORAI1蛋白豐度的檢測

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，健康對照組奶牛中性細(xì)胞ORAI1蛋白豐度極顯著高于低鈣血癥奶牛實(shí)驗(yàn)組（P<0.01），如圖1所示。

圖1 健康對照組和低鈣血癥實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞膜表面ORAI1蛋白豐度Fig.1 The abundance of ORAI1 protein on the surface of neutrophil membrane in healthy cows and hypocalcemia cows

2.3 中性粒細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測

如圖2所示，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明健康對照組奶牛血液中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著高于低鈣血癥實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）。

圖2 健康對照組和低鈣血癥實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度Fig.2 Changes in calcium in neutrophil of healthy dairy cows and hypocalcemia dairy cows

2.4 不同濃度氯化鈣刺激下12，18 h后ORAI1變化

為探究體外鈣離子濃度對于奶牛中性粒細(xì)胞表面ORAI1蛋白的影響，研究利用不同濃度氯化鈣刺激健康奶牛中性粒細(xì)胞，檢測表面ORAI1蛋白豐度，我們分別檢測12、18 h后不同濃度氯化鈣刺激下PMN膜表面ORAI1蛋白豐度變化并分析，結(jié)果表明，不同濃度氯化鈣刺激下12 h后，對照組中性粒細(xì)胞表面ORAI1蛋白豐度顯著低于0.2 mmol·L-1和0.6 mmol·L-1實(shí)驗(yàn)組（P<0.05），極顯著低于1 mmol·L-1實(shí)驗(yàn)組（P<0.01），圖3所示。

圖3 不同濃度氯化鈣刺激下12 h后ORAI1變化Fig.3 Effectof differentdoseof CaCl2 on ORAIproteinabundance in neutrophils of healthy dairy cows treated 12 h

圖4表明不同濃度氯化鈣刺激下18 h后，對照組中性粒細(xì)胞表面ORAI1蛋白豐度極顯著低于0.02 mmol·L-1和0.6 mmol·L-1實(shí)驗(yàn)組（P<0.01）。

圖4 不同濃度氯化鈣刺激下18 h后ORAI1變化Fig.4 Effectof differentdoseof CaCl2 on ORAIprotein abundance in neutrophils of healthy dairy cows treated 18 h

2.5 不同濃度氯化鈣刺激下12，18 h細(xì)胞內(nèi)鈣變化

為探究不同濃度氯化鈣刺激奶牛中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣的變化，分離健康奶牛中性粒細(xì)胞，分別經(jīng)0.2、0.6 mmol·L-1和1 mmol·L-1氯化鈣刺激12、18 h，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度，結(jié)果表面，0.2、0.6 mmol·L-1和1 mmol·L-1氯化鈣刺激12 h后中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著高于正常對照組（P<0.05）。

圖5 不同濃度氯化鈣刺激下12 h后細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化Fig.5 Effect of different dose of CaCl2 on intracellular Ca2+in neutrophils of healthy dairy cows treated 12 h

3 討論

奶牛低鈣血癥是圍產(chǎn)期奶牛高發(fā)的以鈣穩(wěn)態(tài)失衡為主的疾病，使奶牛鈣依賴性肌肉平滑肌和骨骼肌機(jī)能受損，顯著增加真胃變位、酮病、胎衣不下的發(fā)生[14]。研究發(fā)現(xiàn)，泌乳初期奶牛低鈣血癥與血液中白細(xì)胞活性低下有關(guān)，導(dǎo)致其對異物吞噬能力降低，從而增加了子宮內(nèi)膜炎及乳房炎等炎性疾病的發(fā)生，給奶牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15]。

圖6 不同濃度氯化鈣刺激下18 h后細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化Fig.6 Effect of different dose of CaCl2 on intracellular Ca2+in neutrophils of healthy dairy cows treated 18 h

中性粒細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中重要的組成成分,同時(shí)也是滲入受攻擊組織的第一個(gè)白細(xì)胞，通過趨化因子的梯度漸變，招募血液中的中性粒細(xì)胞到達(dá)感染部位[16]。因此，中性粒細(xì)胞是抵抗病原微生物感染的主要防御細(xì)胞之一。

游離鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)的一種主要第二信使參與細(xì)胞多種生理活動以及免疫功能的調(diào)節(jié)。在正常情況下，細(xì)胞外液、細(xì)胞液及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子濃度差分別維持在1.5、50和400μM·L-1。這個(gè)穩(wěn)態(tài)的維持依靠的是細(xì)胞膜和細(xì)胞器上的鈣泵和直接轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用。鈣離子的主動轉(zhuǎn)運(yùn)緊密地控制著細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，從而使鈣離子從細(xì)胞外流入可以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號，從而導(dǎo)致功能性反應(yīng)[17]。在靜息細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)鈣的大部分位于ER內(nèi)，這通常稱為“鈣庫”。胞漿鈣水平通過幾個(gè)鈣泵維持在相對較低的水平，包括分別將鈣送到細(xì)胞外和ER空間的質(zhì)膜和SERCA[18]。在包括免疫細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞）在內(nèi)的非興奮性細(xì)胞中，SOCE是響應(yīng)細(xì)胞刺激鈣進(jìn)入的主要機(jī)制。細(xì)胞表面受體的參與啟動了信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致磷脂酶家族成員的磷酸化。磷脂酶將膜脂質(zhì)磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯（PIP2）轉(zhuǎn)化為甘油二酯（DAG）和三磷酸肌醇（IP3），其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受體結(jié)合并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放鈣。鈣從ER流出后，第二次長時(shí)間鈣離子流過質(zhì)膜。這種持續(xù)的鈣進(jìn)入激活了許多鈣依賴性信號分子和轉(zhuǎn)錄因子，這些信號和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)了關(guān)鍵的免疫效應(yīng)器功能，包括脫顆粒，細(xì)胞因子產(chǎn)生，細(xì)胞極化和增殖[19-20]。

在實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞儀檢測健康對照組ORAI1蛋白表面豐度明顯高于低鈣血癥實(shí)驗(yàn)組，呈現(xiàn)出極顯著差異，說明患低鈣血癥奶牛ORAI1蛋白表面豐度降低。流式細(xì)胞儀檢測健康對照組PMN內(nèi)鈣離子濃度明顯高于低鈣血癥實(shí)驗(yàn)組，呈現(xiàn)出顯著差異。這些結(jié)果表明奶牛發(fā)生低鈣血癥時(shí)PMN表面ORAI1豐度降低，影響奶牛血液中性粒細(xì)胞Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。

為了進(jìn)一步探究細(xì)胞外鈣水平對PMN內(nèi)鈣的影響，我們在體外用不同濃度的氯化鈣培養(yǎng)PMN并檢測其表面ORAI1豐度及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。由結(jié)果可以看出，當(dāng)細(xì)胞外鈣離子濃度升高時(shí)，培養(yǎng)12 h后PMN表面ORAI1蛋白表面豐度和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度也顯著/極顯著升高。這些結(jié)果說明當(dāng)奶牛中性粒細(xì)胞外鈣水平升高時(shí)，中性粒細(xì)胞膜上ORAI1蛋白豐度升高，中性粒細(xì)胞內(nèi)鈣離子進(jìn)入調(diào)控水平也就升高，進(jìn)而中性粒細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。但為何1 mmol·L-1氯化鈣培養(yǎng)18 h后PMN表面ORAI1豐度比12 h時(shí)低，仍需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

細(xì)胞外液中的低鈣水平可顯著降低中性粒細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度以及ORAI1蛋白豐度的表達(dá)。