孟 靜， 吳裕健， 鐘立霞， 程祥龍， 王 銳

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250100；2.山東第一醫(yī)科大學化學與制藥工程學院，山東泰安271016)

1 引 言

生物素是水溶性B族維生素，又稱VB7，是合成維生素C的必要物質，是一種維持人體自然生長、發(fā)育和正常人體機能健康所必需的營養(yǎng)素[1，2]。生物素測定的方法主要有液相色譜-質譜法[3～5]、高效液相色譜法[6～9]、酶聯(lián)免疫法[10，11]和微生物法[12，13]。在特殊醫(yī)學配方食品中生物素的測定過程中，由于基質影響，樣品前處理和液相色譜沖洗階段出現(xiàn)較大干擾，使得目標物測定檢出限高，同時儀器方法測定的是結構相似的化合物，不能確定是否具有生物活性。而微生物方法測定的是有生物活性的生物素，最大程度反映了食品中能夠被人體利用的生物素的含量，特殊醫(yī)學用途配方食品是部分特定人群的唯一營養(yǎng)物質來源，因此對維生素添加量的監(jiān)控尤為重要。GB 5009.259—2016《食品安全國家標準食品中生物素的測定》是我國現(xiàn)行特殊醫(yī)學用途配方食品方法標準中生物素的指定測定方法，該方法為微生物法，它利用植物乳桿菌的生長濃度與生物素含量之間的對應關系，達到定量的目的。

微生物法中引入了微生物這一生長因素，它的活性及生長狀態(tài)對實驗結果的影響較大，為此對該方法進行不確定度評估，可為實驗結果的質量控制提供數(shù)據(jù)參考。

本文采用微生物法測定特殊醫(yī)學用途配方食品中生物素含量，并進行了不確定度評定。

2 材料和方法

2.1 材料及試劑

選取市售特殊醫(yī)學配方乳粉作為待測樣品，標簽標識生物素含量為15 μg/100 g；生物素標準品購自美國藥典(USP)；植物乳桿菌(ATCC 8014)、生物素測定培養(yǎng)基購自北京陸橋；濃硫酸、氫氧化鈉均為分析純。

2.2 儀器與設備

TOMY SX-500高壓滅菌鍋，Sigma 3-30K高速冷凍離心機，梅特勒MS204S分析天平，IKA MS3漩渦混合儀，Bioteck Epoch2C酶標儀，試管，移液管，移液器及容量瓶。

2.3 標準溶液配制

(1)生物素標準儲備液(100 μg/mL)

精確稱取100 mg生物素標準品,用乙醇溶液(50%)溶解并轉移至1 000 mL容量瓶中,定容至刻度。

(2)生物素標準中間液(1.0 μg/mL)

吸取1.00 mL生物素標準儲備液置于100 mL棕色容量瓶中,用乙醇溶液(50%)稀釋并定容至刻度。

(3)生物素標準工作液(10 ng/mL)

吸取1.00 mL生物素標準中間液置于100 mL容量瓶中,用水稀釋定容至刻度,混勻。

(4)標準使用工作液

分2個濃度,高濃度溶液的濃度為0.2 ng/mL;低濃度溶液的濃度為0.1 ng/mL。從工作液中吸取2次各5 mL,用水分別定容到250 mL和500 mL。

2.4 樣品前處理及稀釋

稱取樣品1 g(精確至0.000 1 g)至1個250 mL錐形瓶中，加入3%(體積比)硫酸溶液100 mL,121 ℃水解30 min,冷卻后用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至4.5±0.2,轉到250 mL容量瓶中,用水定容,充分混合。用濾紙過濾,棄去最初的幾毫升。吸取濾液5 mL,加入約20 mL水,用氫氧化鈉溶液調pH值為6.8±0.2,轉至100 mL容量瓶中,用水定容至刻度,作為待測液備用。

2.5 樣品測定

取上述待測液與生物素測定培養(yǎng)基等體積混合后，121 ℃ 5 min滅菌，冷卻后標準曲線管和各待測管中滴加1滴制備好的植物乳桿菌的菌液，36 ℃培養(yǎng)20 h，540 nm處測定其吸光度值，擬合標準曲線，計算樣品測定液的生物素含量。

3 結果分析

3.1 測定原理及數(shù)學模型

GB 5009.210—2016[14]是利用植物乳桿菌(lactobacillus plantarum)對生物素的特異性和靈敏性，定量測定出試樣中待測物質的含量。在含有除待測物質以外所有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中，微生物的生長與待測物質含量呈線性關系，根據(jù)透光率與標準工作曲線進行比較，即可計算出試樣中待測物質的含量。

測量結果計算公式為：

3.2 測量不確定度的主要來源及評定

含量測定的不確定度主要是由方法的重復性誤差,以及試驗過程中所用試劑、儀器、器皿帶來的系統(tǒng)誤差[15，16]引起的。

3.2.1 測量重復性引入的不確定度

由于微生物生長的復雜性，菌株活性、培養(yǎng)溫度的波動、生長環(huán)境pH值及溶液中氧的濃度等因素都會對菌株的生長有影響，進而產(chǎn)生實驗結果的差異。這些因素引入的不確定度可通過重復性試驗來評。在不同時間、同一名檢驗人員按照GB 5009.210-2016標準的要求對同一樣品的生物素含量進行10次平行測定，結果見表1。

表1 乳粉中生物素的含量測定結果Tab.1 Determination of biotin in milk powder μg/100 g

10次測量結果的平均值為

測量結果的標準偏差為

則測量重復性引入的標準不確定度為

測量重復性引入的相對標準不確定度為：

3.2.2 生物素標準品引入的不確定度

生物素標準品引入的不確定度主要包括3個分量：生物素稱量、生物素純度、標準溶液配制。

(1)生物素稱量引入的不確定度

用電子天平準確稱取100 mg生物素標準品，所用天平最小分度為0.1 mg。根據(jù)檢定證書，天平最大重復性誤差為0.2 mg；當0≤m≤50 g時，示值誤差為0.5 mg。按均勻分布，示值誤差引入的不確定度u1和重復性誤差引入的不確定度u2分別為：

合成標準不確定為：

相對標準不確定度為：

urel(m1)=u(m1)/m1=3.11×10-3

(2)生物素純度引入的不確定度

根據(jù)生物素標準品說明書所述，其純度p≥99.9%，按B類不確定度評定，區(qū)間的半寬度為0.001，視為均勻分布。

純度引入標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

urel(p)=u(p)/p=5.77×10-4

(3)標準溶液配制過程引入的不確定度

標準溶液配制過程使用了容量瓶、移液管等玻璃儀器，主要不確定度來源包括移液管體積的不確定度、溫度和重復性3個方面。

表2 各器具計算結果(標準溶液配制)Tab.2 Calculation result of each appliance (preparation of standard solution)

其中，1 000 mL容量瓶、500 mL容量瓶、250 mL容量瓶使用1次，100 mL容量瓶、5 mL移液管、1 mL移液管使用2次。合成玻璃器皿引入的不確定度：

urel(V1)=6.27×10-3

容量瓶和溶液的溫度與校正時的溫度不同，假設實驗室溫度變化介于±5 ℃之間，溶液的體積膨脹系數(shù)為±2.1×10-4，在95%的置信概率下按三角分布，k=1.96，溫度變化帶來的標準不確定度為

u(T1i)=2.1×10-4×5×V1i/1.96
=5.357×10-4V1i

相對標準不確定度為：

urel(T1i)=u(T1i)/V1i=5.357×10-4

合成各容器由溫度帶來的不確定度為：

由生物素標準品引入的合成相對標準不確定度為：

3.2.3 樣品引入的不確定度

(1)樣品稱量引入的不確定度

稱取的樣品質量為1.004 1 g(準確至0.000 1 g)，因此其最大誤差為±0.000 1 g，按照第3.2.2節(jié)中的方法計算樣品稱量引入的不確定度u(m)：

相對標準不確定度為

urel(m)=u(m)/m= 3.097×10-4

(2)樣品稀釋引入的不確定度

樣品稀釋過程中使用了容量瓶、移液管、1 mL吸頭、200 μL吸頭等器皿，按第3.2.2節(jié)中的方法評估的玻璃器皿引入的標準不確定度，結果見表3。

表3 各器具計算結果(樣品稀釋)Tab.3 Calculation result of each appliance(sample dilution)

合成樣品稀釋過程中玻璃器皿引入的相對不確定度：

urel(V2)=4.956×10-3

參照第3.2.2節(jié)中的方法計算溫度變化帶來的合成標準不確定度為：

urel(T2)=1.198×10-3

樣品引入的相對標準不確定度為：

3.2.4 吸光度E測定過程引入的不確定度

根據(jù)檢定證書，酶標儀的吸光度示值誤差是0.5%，透射比重復性是0.0%，測定值一般為對稱分布，則吸光度測定引入的相對標準不確定度為：

3.2.5 合成標準不確定度uc(X)的計算

3.2.6 擴展不確定度的評定

在95%的置信水平下，k=2，相對擴展不確定度為：

U=k×uc(X)=1.15 μg/100 g

最終得出該特殊醫(yī)學配方乳粉的生物素含量為：(27.16±1.15)μg/100 g。

4 結 論

按照JJF 1059.1-2012的要求，采用微生物方法對特殊醫(yī)學配方食品中生物素含量進行多次測定，得到的生物素含量范圍為(27.16±1.15)μg/100 g。分析影響實驗結果的各個分量包括重復性實驗、標準溶液配制、樣品稱量稀釋及吸光度的測定等，對不確定度影響最大的分量為實驗的重復性。重復性試驗中標準曲線、培養(yǎng)時間等均為可準確把控的因素，菌株活性沒有可控制的指標，對實驗的影響較大。在不同時間進行生物素測定，菌株的接種量、工作菌株代數(shù)都要保持相同的條件，最大程度上維持實驗的穩(wěn)定性，使不確定評定結果可用，提高實驗數(shù)據(jù)的準確性。