李松，陸軼杰，吳建武，蔣新衛(wèi)

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 肝膽胰外科，江蘇 蘇州 215000）

據(jù)2021年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）在所有惡性腫瘤中發(fā)病率排名第七，由于其惡性度高，進(jìn)展快，病死率排名第二，僅次于肺癌[1]。原發(fā)性肝癌起源于肝臟上皮組織，病理學(xué)上可分為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、膽管細(xì)胞癌及混合型癌，其中HCC是主要類型。目前，對(duì)于肝癌的治療多采取以外科手術(shù)為主，聯(lián)合靶向、免疫、介入、放化療、中醫(yī)等的綜合療法[2]。雖然對(duì)于早期肝癌的治療效果有了很大程度的提升，但總體上肝癌患者的長(zhǎng)期生存狀況仍不樂(lè)觀，5年生存率僅為18%左右。病毒性肝炎導(dǎo)致的肝硬化是我國(guó)肝癌最常見(jiàn)的誘因[3]，但肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍不清晰，難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的個(gè)體化治療。因此，亟需尋找一種新的分子標(biāo)志物，為肝癌的早期診斷及精準(zhǔn)治療提供新的思路。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）近年來(lái)逐漸引起學(xué)者們的關(guān)注，其在HCC中具有影響腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用[4]，提示lncRNA有望成為改善HCC診斷及治療的新的切入點(diǎn)。

1 關(guān)于lncRNA

1.1 lncRNA的概念和特點(diǎn)

lncRNA現(xiàn)定義為長(zhǎng)度超過(guò)200 bp的無(wú)編碼蛋白作用的DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[5]，由日本學(xué)者在小鼠cDNA測(cè)序研究中首次提出[6]。根據(jù)lncRNA在基因組中的定位將其分為lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因內(nèi)lncRNA和基因間lncRNA五類[7]。lncRNA在人類基因組廣泛轉(zhuǎn)錄，但具有高復(fù)雜性和低保守性的特點(diǎn)，表現(xiàn)在其與蛋白編碼基因相比具有更高的細(xì)胞表達(dá)特異度，表達(dá)量也會(huì)隨環(huán)境和時(shí)間動(dòng)態(tài)變化[8]，因此曾被認(rèn)為是RNA聚合酶保真性差而致的轉(zhuǎn)錄噪聲[5]。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)某些lncRNA的表達(dá)限于特定的發(fā)育背景，受到一定的精確調(diào)控，如大量的小鼠lncRNA在其胚胎干細(xì)胞分化階段和大腦中高度表達(dá)[9]，提示其可能具有某些特定的功能。lncRNA與mRNA相比轉(zhuǎn)錄本更短，包含的外顯子更少，穩(wěn)定性也較差。lncRNA也可含有一個(gè)或多個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），但基本不通過(guò)翻譯蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。

1.2 lncRNA的作用方式

lncRNA主要參與轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后等基因表達(dá)過(guò)程[11]，可以通過(guò)多種方式與DNA、RNA、蛋白質(zhì)相互作用從而調(diào)節(jié)DNA的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成，具體的作用方式有以下幾種。（1）染色質(zhì)重塑：lncRNA可以通過(guò)招募染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物到特定的基因組位點(diǎn)來(lái)介導(dǎo)表觀遺傳變化。Plath等[12]研究發(fā)現(xiàn)，X染色體的失活是由標(biāo)志性的lncRNA Xist（X-inactive specific transcript）介導(dǎo)的。Xist位點(diǎn)內(nèi)的非編碼轉(zhuǎn)錄本RepA招募了染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體PRC2，以此沉默X染色體。由相應(yīng)的lncRNA引導(dǎo)的染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物是一種廣泛的染色質(zhì)修飾模式。（2）招募并整合RNA結(jié)合蛋白的功能到轉(zhuǎn)錄程序中[13]。（3）充當(dāng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、催化蛋白活性的輔助因子[14]。（4）調(diào)節(jié)RNA聚合酶：研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-LEENE的轉(zhuǎn)錄可增強(qiáng)RNA聚合酶II（RNA Pol II）結(jié)合內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）啟動(dòng)子，因此增強(qiáng)eNOS轉(zhuǎn)錄[15]。（5）識(shí)別互補(bǔ)序列并充當(dāng)分子海綿，與mRNA互作，調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄后處理的各個(gè)步驟[16]。

2 lncRNA在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用

2.1 lncRNA調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的增殖和侵襲能力

研究發(fā)現(xiàn)，一些lncRNA可影響HCC細(xì)胞體內(nèi)外增殖和侵襲能力。2007年，Kartin等[17]首次報(bào)道了在HCC中高度特異性上調(diào)的非編碼RNA，并將其命名為HULC（highly up-regulated in liver cancer）。有研究發(fā)現(xiàn)，HULC可以通過(guò)“海綿結(jié)合”miR-377-5p促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的增殖和侵襲；敲低HULC后，小鼠體內(nèi)成瘤也明顯縮小[18]。MALAT1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1）是一個(gè)位于11q13 的8.5 kb的保守的核保留lncRNA，其在HCC細(xì)胞中顯著高表達(dá)[19]。Huang等[20]學(xué)者的研究顯示，MALAT1可將染色質(zhì)重塑復(fù)合物SWI/SNF（switching/sucrose non-fermentable）的催化亞基BRG1（brahmarelated gene 1）招募至促炎因子IL-6和CXCL8基因的啟動(dòng)子，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB后增加兩種促炎因子的表達(dá)，從而促進(jìn)QGY-7701/7703 細(xì)胞增殖和侵襲能力。MEG3（maternally expressed gene 3）定位于染色體14q32.3，長(zhǎng)度約為1.6 kb[21]。研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織和細(xì)胞系中的MEG3 水平顯著降低，特別是在晚期HCC患者中，敲除MEG3可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，加速細(xì)胞周期，其機(jī)制可能與抑制AP1G1表達(dá)和激活PI3K/AKT通路有關(guān)[22]。Duan等[23]的研究顯示：HOTAIR（HOX transcript antisense intergenic RNA）在HCC細(xì)胞系中高表達(dá)，敲低后可上調(diào)miR-34a的表達(dá)，抑制HepG2和SMMC7721細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)凋亡?？偠灾喾NlncRNA的異常表達(dá)促進(jìn)了HCC的惡性表型，作用模式可為染色質(zhì)修飾或結(jié)合下游miRNA、蛋白質(zhì)等，提示lncRNA是人為抑制腫瘤進(jìn)程的新靶點(diǎn)。

2.2 lncRNA調(diào)節(jié)HCC上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）對(duì)包括HCC在內(nèi)的多種癌癥的進(jìn)展非常重要，可以賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力，減少凋亡與衰老，促進(jìn)免疫抑制。lncRNA HOXA-AS3在HCC細(xì)胞中高表達(dá)，在細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Huh7 和HCC-LM3中將其敲除可以降低N鈣黏蛋白（N cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)，增加E鈣黏蛋白（E cadherin）的表達(dá)，表明lncRNA HOXAAS3能促進(jìn)HCC的EMT過(guò)程[24]。有學(xué)者認(rèn)為，癌細(xì)胞可以獲得一種雜交上皮/間充質(zhì)（E/M）表型。具有混合E/M表型的細(xì)胞混合上皮和間充質(zhì)特性，它們對(duì)治療更具耐藥性，也更有能力啟動(dòng)轉(zhuǎn)移性病變。HCC中，過(guò)表達(dá)HOTAIR通過(guò)調(diào)控Caveolin-1的表達(dá)和激活，抑制c-Met的表達(dá)和激活，為E/M表型提供了生存優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了HCC的發(fā)展[25]。另有研究指出，在HCC中，MALAT1促進(jìn)了zeste同源物2（EZH2）在miR-22和E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域的富集，抑制miR-22和E-cadherin的表達(dá)，正向調(diào)控SNAI1，在EMT中發(fā)揮重要作用[26]。

2.3 lncRNA調(diào)節(jié)HCC組織血管生成

血管生成是包括HCC在內(nèi)的實(shí)體腫瘤的顯著特征[27]。Lu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在HCC中HULC作為分子海綿靶向結(jié)合miR-107，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子E2F1的上調(diào)，后者結(jié)合并激活SPHK1啟動(dòng)子，而SPHK1/S1P/S1PR1/3信號(hào)通路在腫瘤血管生成中起重要作用。lncRNA HABON（hypoxia-activated BNIP3 overlapping non-coding RNA）是一種由缺氧激活的lncRNA，該lncRNA不僅受到缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的調(diào)控，而且在肝癌細(xì)胞缺氧時(shí)其表達(dá)水平顯著升高。在缺氧細(xì)胞中，HABON可被HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活，并與HIF-1α相互作用，促進(jìn)其蛋白降解，最終通過(guò)影響HIF-1α靶基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用。HIF-1α的靶基因包括EPO編碼基因和VEGF編碼基因等，在腫瘤血管生成中有著重要作用[29]。

2.4 lncRNA調(diào)節(jié)HCC腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）特性

CSC為腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的一類細(xì)胞。CSC通過(guò)自我更新和無(wú)限增殖維持著腫瘤細(xì)胞群的生命力，其運(yùn)動(dòng)和遷徙能力又使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移成為可能，因此腫瘤干細(xì)胞對(duì)腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有著重要作用。有研究表明，在穩(wěn)定感染HBV的HepG2 X細(xì)胞中，lncRNA MALAT1 的表達(dá)上升，其形成克隆及在裸鼠體內(nèi)成瘤的能力均較HepG2細(xì)胞增強(qiáng)。敲減MALAT1降低CD44、CD133、EpCAM等CSC標(biāo)志物的基因表達(dá)，提示MALAT1能夠促進(jìn)HepG2 X細(xì)胞的CSC分化和腫瘤發(fā)生[30]。Wang等[31]學(xué)者的研究顯示，HULC加速了依賴CyclinD1的人肝癌干細(xì)胞的進(jìn)展。Jiang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，MEG3通過(guò)阻斷維持端粒長(zhǎng)度的復(fù)合物（POT1-Exo1-TRF2-SNM1B）的形成，并通過(guò)增加p53和HULC之間的相互作用，減少?gòu)?fù)合物與端粒的結(jié)合，從而減少端粒長(zhǎng)度。最終，MEG3通過(guò)降低端粒酶活性和減弱端粒重復(fù)結(jié)合因子2（TRF2），抑制人肝癌腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.5 lncRNA增強(qiáng)HCC對(duì)藥物的敏感性

晚期肝癌目前最主要的治療方式是化療、靶向治療、免疫治療。腫瘤耐藥是藥物治療的一大阻礙。有研究表明，lncRNA HOTAIR可以通過(guò)抑制miR-217來(lái)增加肝癌患者對(duì)索拉非尼（sorafenib）的耐藥性[33]，另一方面也可通過(guò)調(diào)節(jié)Akt磷酸化和Wnt/β-catenin信號(hào)與miR-34a相互作用，削弱HCC對(duì)于紫杉醇的耐藥[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MT1JP與miR-24-3p的海綿結(jié)合釋放了BCL2L2（Bcl-2 like 2），從而形成了一個(gè)正反饋回路，降低了肝癌細(xì)胞在體內(nèi)外對(duì)侖伐替尼（lenvatinib）的敏感性[34]。Li等[35]研究證明，BANCR（BRAF lncRNA）在HCC細(xì)胞系Huh7中過(guò)表達(dá)，其下調(diào)抑制了Huh7細(xì)胞的活力，促進(jìn)了凋亡，并抑制了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。伴有BRAF突變的晚期HCC患者對(duì)TKI的耐藥更顯著，抑制BRAF可能成為治療肝癌的一種策略，而B(niǎo)ANCR可能是介導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖和TKI逃逸的重要分子[36]。

3 lncRNA作為HCC腫瘤標(biāo)志物

某些lncRNA在HCC的異常表達(dá)及組織特異性，使其有望成為新的腫瘤標(biāo)志物[37]，幫助判斷HCC的發(fā)生及預(yù)后。HCC患者血漿中HULC轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯著升高[38]。此外，與來(lái)自健康個(gè)體的血清相比，在乙型肝炎病毒陽(yáng)性患者的血清中發(fā)現(xiàn)了更高水平的HULC轉(zhuǎn)錄本[39]。這意味著HULC可能成為合適的診斷標(biāo)志物[40]。在Yuan等[41]的研究中，通過(guò)對(duì)血清樣本的qRT-PCR檢測(cè)，篩選并驗(yàn)證出LINC00152、RP11-160H22.5和XLOC014172可能是HCC與慢性肝炎患者的診斷標(biāo)志物。一些lncRNA可能與肝癌預(yù)后密切相關(guān)。Lee等[42]的研究表明，高表達(dá)PLEKHA8P1的原發(fā)性肝癌患者，總生存期和無(wú)病生存期均有降低趨勢(shì)；同時(shí)，PLEKHA8P1的表達(dá)與原發(fā)性肝臟腫瘤的組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)。Wu等[43]學(xué)者的研究表明，HOTTIP（HOXA transcript at the distal tip）表達(dá)是HCC肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和總生存時(shí)間較低的獨(dú)立預(yù)后因素。UCA1（urothelial cancer associated 1）在HCC細(xì)胞中異常高表達(dá)[44]。有薈萃分析發(fā)現(xiàn)，UCA1 上調(diào)與腫瘤體積較大、TNM晚期密切相關(guān)，而UCA1過(guò)表達(dá)與更短的總生存期顯著相關(guān)[45]。目前對(duì)于HCC的診斷多以甲胎蛋白等傳統(tǒng)的分子標(biāo)志物為主，診斷存在腫瘤初期升高不顯著的弊端，且難以判斷預(yù)后，lncRNA因此有望成為早期診斷并預(yù)測(cè)疾病結(jié)局的新的分子標(biāo)志物。但lncRNA普遍表達(dá)量極低，雖然有二代測(cè)序等新方法，但仍缺乏經(jīng)濟(jì)有效的能夠普遍開(kāi)展的檢測(cè)方法。

4 lncRNA導(dǎo)入HCC組織實(shí)現(xiàn)治療的可行性

如前所述，眾多l(xiāng)ncRNA在細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)中表現(xiàn)出了對(duì)HCC細(xì)胞惡性程度的抑制，且能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，提示lncRNA可能成為新的靶向治療位點(diǎn)。肝臟作為主要的代謝器官，具有顯著的吸收外界治療藥物的能力，如有高效的干預(yù)方法，則有可行性。反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）包括雙鏈形式的小干擾RNA（siRNA）和單鏈形式的RNA，可在不同部位實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)RNA的剪切[46]，將其靶向?qū)肽[瘤組織有多種方式。（1）將化學(xué)基團(tuán)與ASO偶聯(lián)，如膽固醇分子與ASO結(jié)合可增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)其的吸收[47]。（2）通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)：Sato等[48]利用維生素A偶聯(lián)脂質(zhì)體系統(tǒng)將靶向膠原伴侶gp46的ASO引入大鼠肝星狀細(xì)胞，以抑制肝硬化。（3）類脂納米顆粒[49]。（4）細(xì)胞外囊泡[50]。還有一種思路是將抑制腫瘤發(fā)展的lncRNA導(dǎo)入細(xì)胞使其過(guò)表達(dá)。基于AAV的核酸輸送方法被譽(yù)為目前模式生物組織輸送核酸的金標(biāo)準(zhǔn)，但也存在受限于lncRNA分子大小和病毒安全性的缺點(diǎn)，這方面的研究仍在起步階段[51]。lncRNA的生物學(xué)作用已得到證實(shí)，目前對(duì)lncRNA的干預(yù)多停留在實(shí)驗(yàn)室水平，開(kāi)發(fā)出更加高效的給藥方法是實(shí)現(xiàn)治療目的關(guān)鍵。

5 小結(jié)與展望

目前，早期肝癌的治療以外科手術(shù)為主，進(jìn)展期多無(wú)法手術(shù)而采取綜合治療，肝癌患者總體的生存時(shí)間仍很短。lncRNA是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，可通過(guò)染色質(zhì)修飾、結(jié)合并調(diào)節(jié)下游的RNA聚合酶、蛋白、miRNA等多種方法發(fā)揮生物學(xué)作用。本文闡述了lncRNA的基本作用方式及其對(duì)HCC的影響和機(jī)制。一些在HCC中特異性表達(dá)的lncRNA，能夠參與調(diào)控腫瘤的增殖和侵襲能力以及血管生成能力，也能夠調(diào)節(jié)腫瘤耐藥性和干細(xì)胞特性。這種生物學(xué)作用使得lncRNA有望成為新型的腫瘤標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)，但仍需要大規(guī)模的臨床研究加以驗(yàn)證。實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化是最終目標(biāo)，目前亟待解決的問(wèn)題是明確靈敏度和特異度均合適的lncRNA以及發(fā)掘更好的RNA測(cè)序方法實(shí)現(xiàn)高效檢驗(yàn)。同時(shí)在治療層面，需要發(fā)掘靶向性強(qiáng)、效率高、相對(duì)安全的導(dǎo)入ASO的辦法?？偠灾?，lncRNA是應(yīng)對(duì)包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的可能解決方案。