常 凱，劉晨霞，許宏宣，王艷艷，江忠勇

隨著檢驗(yàn)水平、數(shù)字化治療設(shè)備和多系統(tǒng)聯(lián)合治療等技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)疾病的認(rèn)知程度越加深入，為了給每位患者提供最合適和理想化的治療措施，精準(zhǔn)醫(yī)療的概念應(yīng)運(yùn)而生[1]。精準(zhǔn)醫(yī)療高度依賴于對(duì)患者的遺傳學(xué)和其他分子生物學(xué)或影像數(shù)據(jù)分析，使臨床預(yù)防、診斷和治療更具特異性，能提高預(yù)后水平，降低藥物毒副作用等不良后果發(fā)生。在精準(zhǔn)醫(yī)療的大環(huán)境下，基因測序技術(shù)經(jīng)歷了多次換代，成為精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代的中堅(jiān)力量[2]。

基因組攜帶了生物個(gè)體的全部遺傳信息，在臨床檢驗(yàn)學(xué)中，基因測序技術(shù)彌補(bǔ)了細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、微生物與免疫學(xué)的短板，能夠直接對(duì)人體或病原微生物進(jìn)行檢測、定量及突變位點(diǎn)分析[3]。

1 基因測序技術(shù)的發(fā)展

基因測序技術(shù)發(fā)明于1977 年，經(jīng)過40 余年的發(fā)展和進(jìn)化，該技術(shù)已經(jīng)具有了里程碑式的飛躍。

1.1 第一代測序技術(shù) 1977年，TSIATIS A C[4]提出了雙脫氧鏈末端終止法測序，其原理為將ddNTP（缺乏3’-羥基）插入到新和成的DNA 鏈中，使之不能與下一位脫氧核苷酸形成磷酸二酯鍵，迫使DNA合成反應(yīng)停滯。通過電泳分離不同長度的片段，并檢測所測片段的末端堿基，拼接好即為完整DNA序列。在此后近30 年間，隨著標(biāo)記技術(shù)與工業(yè)水平的提高，同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)逐漸進(jìn)行加持，測序通量和自動(dòng)化均得到了大幅提升[5]。由于一代測序具有操作門檻低、讀取長度長、準(zhǔn)確率高（接近100%）等優(yōu)點(diǎn)，目前臨床中多用于單基因病和突變位點(diǎn)的基因檢測，其演變出的毛細(xì)管電泳法一直作為基因診斷的標(biāo)準(zhǔn)。然而其缺點(diǎn)也體現(xiàn)在通量小、成本高和檢測速度慢等方面。

1.2 第二代測序技術(shù) 二代測序（Next-generation Sequencing,NGS）技術(shù)是繼一代測序后的一次全新?lián)Q代。大多數(shù)NGS基于邊合成邊測序技術(shù)，將每個(gè)DNA片段螯合或連接到一個(gè)芯片上，隨后將被標(biāo)記的核苷酸加入體系使DNA鏈延伸，在成像系統(tǒng)捕獲后通過計(jì)算機(jī)推演出核酸序列[6]。目前常見的NGS平臺(tái)多為基于焦磷酸法的454 平臺(tái)、基于可逆染料標(biāo)記法的Illu?mina 平臺(tái)和基于四色熒光標(biāo)記寡核苷酸法的SOLiD平臺(tái)[7]。NGS 相比上一代測序其數(shù)據(jù)量提高了約5 個(gè)數(shù)量級(jí)，具有通量高、準(zhǔn)確度高、靈敏度高和自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，臨床檢驗(yàn)中常用于突變位點(diǎn)檢測、病原微生物菌種檢測等方面[8]。

1.3 第三代測序技術(shù) 第三代測序又稱單分子測序技術(shù)，以Pacific Biosciences公司的SMRT（single molec?ular real-time,SMRT）測序和Oxford NanoPore Technol?ogies 公司的納米孔測序?yàn)榇?。其原理為不同熒光?biāo)記的dNTP，與模板鏈互補(bǔ)后熒光基團(tuán)被DNA 聚合酶剪切，作用時(shí)間較長的熒光能夠被捕獲。而沒有與模板配對(duì)的堿基停留時(shí)間很短，不能被檢測[9]。三代測序在測序數(shù)據(jù)量和準(zhǔn)確度上較二代測序并無明顯提高，但其擁有超長的讀取長度（10 kb-15 kb）和運(yùn)行時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，可作為二代測序的有益補(bǔ)充。臨床多用于病毒基因組檢測分析[10]。

2 基因測序在精準(zhǔn)醫(yī)療的應(yīng)用

2.1 病原微生物的檢驗(yàn)分析 現(xiàn)今，國內(nèi)大部分臨床微生物實(shí)驗(yàn)室采用基于微生物對(duì)底物產(chǎn)生的生化反應(yīng)進(jìn)行自動(dòng)化菌種鑒定，而藥敏實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)多是將抗生素微量稀釋在條孔板中加入菌懸液自動(dòng)孵育并比色分析。對(duì)于病毒等不能或難以體外培養(yǎng)的病原微生物常采用抗原抗體檢測等方法[11]。基因測序技術(shù)基于對(duì)微生物遺傳物質(zhì)的特異性能夠?qū)Σ≡⑸锏木N、毒力及耐藥性等進(jìn)行有效鑒定[12]。

2.1.1 病原微生物的診斷 病原微生物感染導(dǎo)致的疾病往往具有起病急、危害大和具有傳染性強(qiáng)等特點(diǎn)，這就對(duì)臨床診斷的準(zhǔn)確性和時(shí)效性提出了較高的要求?；驕y序針對(duì)微生物的檢測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生并能有效滿足上述需求。對(duì)已知參考序列的病原微生物，通過NGS 技術(shù)能夠快速進(jìn)行鑒別診斷，并能通過序列差異發(fā)現(xiàn)新的變種[13]。在2019 年底爆發(fā)的新型冠狀病毒確診與溯源工作中，NGS技術(shù)扮演了至關(guān)重要的作用。

2.1.2 病原體耐藥基因檢測 病原體耐藥性檢測的傳統(tǒng)方法基于培養(yǎng)與藥敏，其固有缺陷為培養(yǎng)周期長和環(huán)境因素干擾。雖有PCR 和基因芯片方法可以選用，但對(duì)于未知突變類型或未證實(shí)位點(diǎn)仍不能進(jìn)行檢測[14]。隨著生物信息學(xué)與基因數(shù)據(jù)庫的高速發(fā)展，全基因組測序（whole-genome sequencing, WGS）技術(shù)能夠高效便捷地檢測出獲得性耐藥基因，如乙型肝炎病毒耐藥檢測、人結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測等，均能夠?yàn)榫珳?zhǔn)診療提供有益參考[15]。

2.1.3 病原體毒力檢測 病原體毒力評(píng)估對(duì)于預(yù)防和控制疾病的早期風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。WGS 能夠通過數(shù)據(jù)庫對(duì)毒力的遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測。在精準(zhǔn)診療過程中，臨床醫(yī)生可以選擇性地參考數(shù)據(jù)庫中的背景資料指導(dǎo)和評(píng)估用藥情況[16]。

2.2 腫瘤診治中的作用

2.2.1 基因測序在腫瘤診療中的應(yīng)用 不斷積累的基因組變化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)。腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移特性使得通過影像和病理的方法很難確定腫瘤原發(fā)灶的來源[17]。應(yīng)用NGS 技術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞基因組測序并通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)關(guān)聯(lián)腫瘤與特定基因，對(duì)腫瘤的診治具有重要價(jià)值。由于不同個(gè)體對(duì)同一種藥物的敏感性不同，定向殺傷腫瘤細(xì)胞的靶向藥物成為個(gè)體化治療的焦點(diǎn)。而通過NGS 檢測單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP）在指導(dǎo)個(gè)體靶向藥物療效中作用顯著，分子靶向治療策略也表現(xiàn)出更加細(xì)化和精準(zhǔn)化。例如表皮生長因子受體（epider?mal growth factor receptor,EGFR）突變陽性肺癌患者可從酪氨酸激酶抑制劑的治療中獲益[18]；人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）基因受體陽性患者經(jīng)干擾性單克隆抗體曲妥珠單抗在早期和晚期（轉(zhuǎn)移性）乳腺癌的治療中具有療效等[19]。隨著靶藥治療的愈發(fā)精細(xì)化，腫瘤個(gè)體化治療的“同病異治，異病同治”概念被提出，即針對(duì)相同腫瘤的差異化用藥和針對(duì)不同腫瘤相同突變型的相同靶藥治療，目前已在臨床中有所應(yīng)用。

2.2.2 遺傳性腫瘤的篩查 在家族聚集性腫瘤中，環(huán)境因素雖有一定作用，但遺傳因素仍然是家族腫瘤高發(fā)的主要原因。腫瘤發(fā)生機(jī)制中分為單基因突變和多基因突變，目前明確的單基因遺傳引起的腫瘤包括遺傳性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、Wilm 瘤等；而多基因遺傳導(dǎo)致的腫瘤則有鼻咽癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等。NGS技術(shù)對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)基因進(jìn)行檢測分析，綜合評(píng)估后給出患癌風(fēng)險(xiǎn)[20]。由于不是所有的基因突變都有明確的意義，所以此方法仍存在一些質(zhì)疑。但隨著信息生物學(xué)與相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫的愈加完善，將更為準(zhǔn)確地預(yù)測腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防。

2.3 產(chǎn)前篩查與診斷 單基因遺傳病經(jīng)OMIM 收錄的已有8000余種，部分發(fā)病率高且危害較大的常見單基因病已進(jìn)入臨床檢測目錄，例如遺傳性耳聾、地中海貧血、杜氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、血友病等。NGS 技術(shù)能通過檢測孕婦外周血樣本中的游離DNA（cellfree fetal DNA，cffDNA）確定胎兒染色體是否存在異常[21]。目前，無創(chuàng)產(chǎn)前檢查（noninvasive prenatal test?ing,NIPT）已在國內(nèi)逐漸普及，對(duì)于產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)、年齡≥35 歲的高齡孕婦以及影像學(xué)懷疑胎兒有微缺失微重復(fù)綜合征的人群建議檢測[22]。近年來，NIPT Plus 作為常規(guī)NIPT 的升級(jí)版，通過PCR-free 建庫，將檢測疾病種類由3 種擴(kuò)展到100 多種，其中包含染色體非整倍體、染色體大片段缺失∕重復(fù)、染色體微缺失∕微重復(fù)等。將染色體異常綜合征的篩查覆蓋率提高近4倍。

3 展 望

近十年來，基因組學(xué)及基因測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床，并在個(gè)體化醫(yī)療中優(yōu)勢明顯。經(jīng)過測序技術(shù)的三代發(fā)展，其成本已大幅降低，但對(duì)于病患而言近乎萬元的自費(fèi)檢查仍然顯得價(jià)格高昂。由于檢測平臺(tái)的準(zhǔn)入成本高、經(jīng)驗(yàn)及人才的缺乏，測序大多在參考實(shí)驗(yàn)室實(shí)行。如果下一代測序技術(shù)能在標(biāo)準(zhǔn)化、低成本、短周期的方向有所提高，必將輔佐精準(zhǔn)診療造福于全民。