張珣，王婧，丁華，劉姣，楊潔，周有祥

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

茶因其獨(dú)特的風(fēng)味和保健功能而廣泛被人們所喜愛［1］。但有些茶葉存在嫩度差、外形疏松的問題，有些廠家在茶葉的制作過程中添加一定量的蔗糖，來達(dá)到固定茶葉外形、調(diào)節(jié)茶葉顏色、提高茶的甘甜，同時增加茶葉重量的目的。商家在茶葉中添加蔗糖不僅欺騙消費(fèi)者，破壞茶葉市場次序［2］，而且使茶葉更易滋生細(xì)菌，帶來安全隱患［3］。建立可靠的外源蔗糖檢測方法顯得很有必要，目前文獻(xiàn)報道茶葉中外源蔗糖的檢測方法主要有高效液相色譜法［3，4］、液質(zhì)聯(lián)用法［5，6］、近紅外無損檢測［7］、薄層色譜法［8］、酶法［9］、離子交換色譜［10］。高效液相色譜法具有靈敏、高效、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但需配有特定的檢測器，常用的有蒸發(fā)光散射檢測器［11-13］和示差檢測器［14］，此外還有脈沖安培檢測器［15］。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高、選擇性好、測定快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。近紅外無損檢測是在對收集的紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理和降維分析后，建立相應(yīng)的模型，實(shí)現(xiàn)紅茶中外源蔗糖含量的判別和含糖量的在線實(shí)時檢測，該方法具有成本低、方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。薄層色譜法一般用于單糖的定性或半定量檢測；酶法檢測是基于某些單糖的酶促反應(yīng)，例如蔗糖的水解、葡萄糖和果糖的磷酸化，根據(jù)酶促反應(yīng)，測定樣品中葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、總多糖的濃度，該方法已被商品化，結(jié)果穩(wěn)定，操作簡單，但效率低。離子交換色譜用于茶葉可溶性糖分析的檢測器多為安培檢測器，靈敏高效，但對樣品的前處理要求高。此外還有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［16］和毛細(xì)管電泳法［17］等。在上述方法中，除商品化的酶法檢測外，許多方法都有特定的儀器要求，不便于戶外或及時檢測，酶法檢測成本較高。

DNS比色法測蔗糖含量的原理為蔗糖等雙糖在酸性條件下經(jīng)加熱處理水解成還原糖。還原糖和過量的3，5-二硝基水楊酸在堿性環(huán)境下加熱，將3，5-二硝基水楊酸還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸（圖1）。在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的濃度與溶液棕色程度成正比，用分光光度計測定其吸光度，可得到線性方程，從而可以對還原糖進(jìn)行定量分析［18］。

圖1 DNS法測還原糖原理

本研究在DNS法測還原糖的基礎(chǔ)上以及在果蔬中已有相同原理標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行的前提下，提出DNS法測茶葉中的蔗糖，具備一定現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ)。初步建立了檢測茶葉中摻加蔗糖的方法，在有一定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上能很好鑒別出添加了外源蔗糖的茶葉，同時對設(shè)備要求不高，方便隨時隨地檢測，為茶葉外源蔗糖的檢測提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器

SIGMA3K15型離心機(jī)，SHZ-82A型水浴鍋，HITACHI U-3900型紫外可見分光光度計，AL204電子分析天平，IKA A11研磨機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1）3，5 -二硝基水楊酸（DNS）試劑。將6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液加入到含185 g酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa·4H2O）的500 mL熱水中，再加5 g苯酚和5 g亞硫酸鈉（Na2SO3），攪拌使其冷卻，用水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中備用。

2）1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取0.100 0 g經(jīng)80℃干燥2 h的葡萄糖（C6H12O6）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，溶解定容至100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3）亞鐵氫化鉀溶液。稱取10.6 g亞鐵氫化鉀［K4Fe（CN）6·3H2O］去離子水溶解定容至100 mL。

4）乙酸鋅溶液。稱取21.9 g乙酸鋅［Zn（OAc）2·2H2O］，用少量去離子水溶解后加入3 mL冰乙酸，用去離子水定容至100 mL。

5）6 mol/L鹽酸溶液。在500 mL燒杯中加入100 mL去離子水，量取100 mL鹽酸緩緩加入燒杯中，邊加邊攪拌，混勻后裝入儲液瓶備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用移液管分別準(zhǔn)確吸取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支10 mL具塞刻度試管中，加去離子水使溶液體積補(bǔ)至2.0 mL，加入4.00 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，置沸水浴中加熱5 min。取出，立即置冷水中，冷卻至室溫，定容，搖勻。所得系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0、0.02、0.04、0.08、0.10、0.12 mg/mL。用分光光度計測定540 nm吸光度。以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 還原糖的測定 取1 mL待測樣品于10 mL比色管中，補(bǔ)水至2 mL，加入4 mL DNS試劑，沸水浴5 min，定容至10 mL，540 nm下測吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算還原糖含量。

1.2.4 淋洗與浸泡測茶葉蔗糖方法的比較 茶葉中若摻雜蔗糖，有2種基本的方法可以將內(nèi)部蔗糖溶解出來，即淋洗法和浸泡法。為比較淋洗法和浸泡法對蔗糖的提取能力，取摻雜蔗糖茶葉樣品，設(shè)計如下試驗(yàn)。

1）淋洗茶葉茶湯的蔗糖含量測定。①還原糖的測定：取5 g左右預(yù)先處理（加糖或不加糖）的一批茶葉流水淋洗10 s，取濾液，加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀除去蛋白質(zhì)，定容至100 mL，過濾，取濾液按“1.2.3”方法測還原糖含量，每個樣品3個平行。②蔗糖的測定：取上述濾液50 mL，加入5 mL鹽酸，68℃水浴振蕩15 min，測還原糖量［19］。計算2次還原糖量之差，計算轉(zhuǎn)化糖含量，從而得出蔗糖含量，每個樣品3個平行。

2）浸泡茶葉茶湯中蔗糖含量的測定。①還原糖的測定：取5 g左右預(yù)先加糖處理的茶葉加入50 mL的去離子水，置于45℃水浴鍋中，振蕩浸提1 h，取茶湯，3 000 r/min離心3 min。過濾茶湯，定容至100 mL，適當(dāng)稀釋后用于還原糖測定，每個樣品3個平行。②蔗糖的測定：上述茶湯定容后剩余的50 mL茶湯，加入5 mL的6 mol/L鹽酸，68℃水浴振蕩15 min，測還原糖量，計算2次還原糖之差，利用差值計算蔗糖含量，每個樣品3個平行。

1.2.5 方法檢出限與回收率試驗(yàn) 取3份已知蔗糖含量的茶葉樣品，分別按每5.00 g茶葉向其中添加1、10、50 mg蔗糖，粉碎攪拌均勻，按浸泡茶葉測茶湯中蔗糖含量，每份測量3次，得到檢出限計算回收率。

1.2.6 精密度試驗(yàn) 同時取5份相同樣品按浸泡茶葉測茶湯中蔗糖含量，并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.7 樣品的檢測與分析 根據(jù)工廠添加蔗糖方式，選取在茶葉揉捻時分別添加不同質(zhì)量蔗糖，在50 kg鮮葉中分別添加1、2、3 kg蔗糖，制備最終添加蔗糖含量分別為9.3%、18.5%、22.1%的樣品，以不添加蔗糖樣品為對照，測4份樣品中蔗糖含量。同時取市場上16份茶葉樣品，測蔗糖含量，比較差異，分析可能添加蔗糖種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖的質(zhì)量濃度在0～0.12 mg/mL與其吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=16.04x-0.02，相關(guān)系數(shù)r為0.996（圖2）。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 淋洗茶葉測得蔗糖含量

茶葉樣品在經(jīng)過短暫的流水淋洗后，表面的蔗糖部分溶于水中，在茶葉前處理上能節(jié)約時間。茶葉為已知樣品，由表1可以看出，2號和5號樣品蔗糖含量少，1號、3號、4號蔗糖含量多，為添加蔗糖樣品。試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際蔗糖添加情況相符，在茶葉本身蔗糖含量相差不大的情況下能有效區(qū)分額外添加蔗糖的茶葉樣品。

表1 淋洗茶蔗糖含量

2.3 浸泡茶葉測得蔗糖含量

由表2可以看出，相較于淋洗茶湯，浸泡茶湯的蔗糖含量整體提高，說明大部分蔗糖沒有被淋洗下來。但結(jié)果同樣表明，2號和5號茶葉蔗糖含量低，1號、3號、4號含量高，與預(yù)期相符?？紤]到不同茶葉的溶解速度不一樣，經(jīng)相同的淋洗過程，自身或添加蔗糖被淋洗的情況會有所不同。綜合考慮，淋洗操作節(jié)省時間和資源，但試驗(yàn)結(jié)果受茶葉本身影響更大，可以作為初步定性的參考；浸泡茶葉需要時間長，測得更準(zhǔn)確，能滿足定量的需要，后續(xù)將對浸泡法進(jìn)行相關(guān)研究。

表2 浸泡茶蔗糖含量

2.4 方法檢出限與回收率

試驗(yàn)以文獻(xiàn)［18］的方法為基礎(chǔ)，DNS方法的檢出限為2.0 mg/L，線性范圍為0～120.0 mg/L。由于茶葉成分復(fù)雜，通過試驗(yàn)確定蔗糖的檢出限較為可信，分別添加1、10和50 mg的蔗糖。結(jié)果如表3所示，當(dāng)添加量為1 mg時，測量誤差大于測量值，在實(shí)際操作中無法反映出正確結(jié)果；當(dāng)添加蔗糖為10 mg時，回收率117.60%，結(jié)果較為可靠，方法對添加蔗糖的檢出限為2 mg/L。

表3 檢出限與回收率

添加1 mg蔗糖，方法回收率低，相對偏差高，無法區(qū)分是否添加蔗糖，在添加蔗糖10 mg時，回收率較好，但RSD為9.18%，較大的相對偏差顯示檢測數(shù)據(jù)存在較大波動，原因是檢測方法存在一定誤差，當(dāng)檢測值較小時，相對偏差就大。當(dāng)添加量為50 mg時，RSD明顯減小。整體上當(dāng)外源蔗糖添加量為10 mg時，該方法已經(jīng)能準(zhǔn)確定量檢測。

2.5 精密度試驗(yàn)

取5份茶葉樣品各5.00 g浸泡并檢測，試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，DNS法的精密度好，以茶葉中蔗糖（可溶性糖折算而來）為檢測對象，該方法的RSD為2.47%。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品的檢測與分析

在對市場上的16份茶葉樣品（編號為1～16）檢測后發(fā)現(xiàn)，不同茶葉蔗糖含量存在一定差異。一些茶葉蔗糖含量計算得到負(fù)值，是由于茶葉本身蔗糖含量低，測量存在一定誤差。樣品經(jīng)多次檢測仍為負(fù)值，說明是系統(tǒng)誤差所致。分析茶葉樣品數(shù)據(jù)可知這些茶葉蔗糖含量在0～21.29 mg/g（表5）。揉捻過程添加蔗糖的3份樣品（編號為18～20，17號為對照）測得蔗糖含量分別為44.99、112.66、141.50 mg/g，計算回收率分別為48.4%、60.9%、64.0%。

表5 樣品檢測結(jié)果

經(jīng)調(diào)查研究，要達(dá)到收縮茶葉外形和提升茶葉光澤度的目的，鮮葉的加糖量通常在5%左右。有文獻(xiàn)報道在5%～25%［12］。其中5%的蔗糖添加至鮮葉中，折算成干葉其添加蔗糖量在9.26%左右，DNS法測得結(jié)果為44.99 mg/g，說明檢測結(jié)果在44.99 mg/g以上，則可能為添加蔗糖樣品，這一結(jié)論與陳琦等［2］的研究結(jié)果一致。

3 討論

研究建立了茶葉中蔗糖的DNS測定方法，并運(yùn)用在實(shí)際的樣品檢測中。能明顯區(qū)分添加量為2 mg/g的蔗糖樣品，實(shí)現(xiàn)定量檢測，酸解3，5-二硝基水楊酸法在食品糖類檢測中應(yīng)用廣泛，方法成熟，但食品基質(zhì)成分復(fù)雜，茶葉中尤為明顯，本研究開拓了其在茶葉蔗糖檢測中的應(yīng)用。但同時方法存在一定局限，主要表現(xiàn)在以下方面。同幾乎所有測茶葉外源糖的方法一樣，方法測定的是茶葉總的含糖量，對于是否添加蔗糖作出的是可能性的判斷，不同茶葉本底影響不同，要給出合理的判斷值需要更多的數(shù)據(jù)支持；方法前處理比較復(fù)雜，有待精簡。淋洗法在添加蔗糖量較大時，可以粗略地測定區(qū)分樣品，優(yōu)點(diǎn)在于節(jié)省提取時間，樣液基質(zhì)更為簡單，缺點(diǎn)是方法靈敏度不夠。

DNS法在直接測還原糖含量時，相比酸解后再測還原糖結(jié)果的穩(wěn)定性更好，有些茶葉蔗糖含量出現(xiàn)負(fù)值，可能是酸解操作給試驗(yàn)帶來干擾。

在2次添加回收試驗(yàn)中，得到不同的回收率，一次在成品茶葉添加蔗糖，一次在茶葉制作過程中添加蔗糖，后者回收率較前者低，部分原因在于揉捻可使蔗糖滲入茶葉內(nèi)部，增加提取難度。本方法在前處理上缺少優(yōu)化試驗(yàn)，如水浴時間、料液比、提取介質(zhì)、提取次數(shù)等，但鑒于試驗(yàn)結(jié)果已滿足預(yù)期，不再進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。