廖鑫磊 王桂榮

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。截止2021年1月，分枝桿菌屬已有240個(gè)種，24個(gè)亞種(http://www.bacterio.net/mycobacterium.html)。NTM廣泛存在于水、土壤、灰塵等自然環(huán)境中，屬于條件致病菌[1]。NTM病是指人體感染了NTM，并引起相關(guān)組織、臟器的病變[2]。近年來，全球NTM病呈快速增多趨勢(shì)，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[3]。NTM病與結(jié)核病在臨床表現(xiàn)和影像學(xué)表現(xiàn)上都非常相似， NTM病主要依靠實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)進(jìn)行診斷。隨著NTM病的增多，人們對(duì)其危害性越來越重視，早期診斷及早期治療可降低NTM對(duì)人體的損害。為提高NTM病的診斷水平，除了需增強(qiáng)醫(yī)務(wù)工作者對(duì)NTM病的認(rèn)識(shí)，提高對(duì)NTM的檢測(cè)、鑒定以及耐藥診斷能力，還需增加對(duì)NTM實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的認(rèn)識(shí)，提高NTM病的病原學(xué)陽性率。對(duì)硝基苯甲酸選擇性培養(yǎng)基法和MPB64抗原檢測(cè)法僅可初步鑒別MTBC與NTM；質(zhì)譜技術(shù)可鑒別至菌種水平，但不可直接用于臨床標(biāo)本，只可用于培養(yǎng)陽性菌株，不利于臨床及時(shí)診斷。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子診斷技術(shù)在分枝桿菌菌種鑒定中發(fā)揮著越來越重要的作用，筆者對(duì)用于NTM檢測(cè)及鑒定的分子技術(shù)進(jìn)行概述。

一、NTM檢測(cè)技術(shù)

因NTM與結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性不同，治療方案存在較大差異，因此治療前需準(zhǔn)確地檢測(cè)鑒別患者是結(jié)核病還是NTM病?，F(xiàn)有一些分子技術(shù)可從標(biāo)本中直接檢測(cè)NTM或同時(shí)鑒別MTBC與NTM。Scoleri等[4]研發(fā)了一種以hsp65為靶基因的TaqMan定量PCR技術(shù)，可以直接從呼吸道樣本中檢測(cè)NTM。韓國3種可鑒別MTBC與NTM的試劑盒：(1)AdvanSureTMTB/NTM實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，以MTBC和NTM的IS6110和轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列(internal transcribed spacer，ITS)為靶基因；(2)GENEDIA?MTB/NTM實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，以MTBC的IS6110以及NTM的ITS和rpoB為靶基因；(3)Real-Q MTB & NTM試劑盒，以MTBC和NTM的IS6110和ITS為靶基因[5]。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株時(shí)，AdvanSure、Genedia、Real-Q的準(zhǔn)確度分別為100.0%、98.8%和98.8%，檢測(cè)臨床菌株時(shí)3種試劑盒的敏感度均大于95%[5]。AdvanSure檢測(cè)呼吸道樣本時(shí)的敏感度和特異度分別為97.9%和100.0%，而非呼吸道樣本占總樣本30.5%時(shí)AdvanSure的敏感度和特異度分別降為91%和87%[6-7]。這是由于非呼吸道樣本中含有PCR抑制物可降低實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的敏感度。NTM檢測(cè)的特異度受與NTM相近的其他非分枝桿菌屬細(xì)菌的影響，比如Rhodococcus，Tsukamurella，Segniliparus和Gordonia屬的一些成員與分枝桿菌屬在系統(tǒng)發(fā)育上非常相近，都屬于Corynebacterineae亞綱，若樣本中存在這些細(xì)菌可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果[5]。由于NTM廣泛存在于環(huán)境中，特別是水中，因此樣本采集時(shí)還要注意避免污染[8]。

二、NTM菌種鑒定分子技術(shù)

1. 直接探針雜交法:直接探針雜交法不需要擴(kuò)增步驟，因此可以實(shí)現(xiàn)快速診斷。AccuProbe鑒定系統(tǒng)(AccuProbe；Hologic公司，美國)依靠與16SrRNA互補(bǔ)的寡核苷酸探針，可鑒別MTBC、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、戈登分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌[9]，AccuProbe的最大缺點(diǎn)是不能鑒定臨床上非常重要的膿腫分枝桿菌。

2. 線性探針技術(shù):線性探針技術(shù)(1ine probe assay，LPA)的原理是通過應(yīng)用生物素標(biāo)記的特異引物進(jìn)行靶核酸(DNA)的擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后與固定在尼龍膜上的特異寡核苷酸探針雜交，通過酶聯(lián)免疫顯色法顯示結(jié)果[10]。比較有代表性的LPA試劑盒有INNO-LiPA Mycobacteria v2(INNOLiPA；Fujirebio Europe，比利時(shí))；GenoType Mycobacteria CM，GenoType Mycobacteria AS和GenoType NTM-DR (Hain生命科學(xué)，德國)；Speed-oligo Mycobacteria(Vircell，西班牙)；AdvanSure Mycobacteria GenoBlot Assay(LG Chem Inc.，韓國)和 REBA Myco-ID (YD診斷學(xué)，韓國)。INNO-LiPA Mycobacteria v2以16S-23SrRNA間區(qū)為靶基因，可鑒別16種分枝桿菌[11]；GenoType Mycobacteria CM和GenoType Mycobacteria AS均以23SrRNA為靶基因，分別可鑒別14種和16種分枝桿菌[12-13]；Speed-oligo Mycobacteria以16SrRNA和16S-23SrRNA間區(qū)為靶基因，可鑒別14種分枝桿菌[14]；AdvanSure Mycobacteria GenoBlot assay以16S-23SrRNA間區(qū)為靶基因，可鑒別21種分枝桿菌[10]；REBA Myco-ID以rpoB為靶基因，可鑒別17種分枝桿菌，并可將馬賽分枝桿菌與膿腫分枝桿菌區(qū)分開[15]。GenoType NTM-DR不僅可將臨床常見的NTM鑒定至種水平，包括膿腫分枝桿菌復(fù)合群(膿腫分枝桿菌、馬賽分枝桿菌和bolletii分枝桿菌)、龜分枝桿菌和鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和奇美拉分枝桿菌)，同時(shí)還可以通過檢測(cè)erm(41) 和rrl基因的突變情況確定NTM對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性，以及通過檢測(cè)rrs基因的突變情況確定NTM對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥性[16-17]。

3.基因芯片法:基因芯片又稱DNA微陣列，基本原理是通過微陣列技術(shù)將多種DNA探針有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息?；蛐酒夹g(shù)具有快速、準(zhǔn)確、高通量、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)已有用于分枝桿菌菌種鑒定的基因芯片產(chǎn)品上市，如晶芯?分枝桿菌菌種鑒定芯片試劑盒(北京博奧生物有限公司)。該試劑盒以16SrRNA為靶基因，可鑒別17種分枝桿菌。檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為99.8%和99.7%，檢測(cè)NTM的敏感度和特異度分別為98.8%和100.0%[18-19]。

4. 反向斑點(diǎn)雜交法:反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)(reverse blot hybridization assay，REBA)工作原理為先將已編號(hào)的寡核苷酸探針點(diǎn)到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后與生物素等標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，通過膜條特定位置顯色與否判斷探針是否與該DNA片段雜交。具有敏感度高、特異度強(qiáng)、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。國內(nèi)試劑盒有分枝桿菌菌種鑒定基因檢測(cè)試劑盒[亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司]，以16S rRNA為靶基因，可鑒定臨床上22種常見的致病性分枝桿菌，檢測(cè)NTM的敏感度和特異度分別為87.61%和83.33%[20-21]。

5. 特異基因測(cè)序法:與傳統(tǒng)方法相比，特異基因測(cè)序法進(jìn)行菌種鑒定既快速又準(zhǔn)確。特異基因測(cè)序法目前已經(jīng)成為菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。許多基因已用于分枝桿菌菌種鑒定，如16SrRNA、hsp65、rpoB、ITS、gyrB、danA、recA和secA等[22]。

獲得DNA序列后，進(jìn)行序列比對(duì)分析時(shí)需要使用數(shù)據(jù)庫[22]。有一些公用數(shù)據(jù)庫及比對(duì)工具可用，如NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/identify)、Ribosomal Database Project(RDP，http://rdp.cme.msu.edu)和leBIBI(https://umr5558-bibiserv.univlyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi)[23]。

16SrRNA是細(xì)菌分類和鑒定中最常用的基因，全長1550 bp左右，是30S小核糖體亞單位的重要組成部分[22]?？梢允褂?6SrRNA全長序列，也可以使用長度為440 bp左右的5′端堿基序列差異相對(duì)集中的區(qū)域進(jìn)行菌種鑒定。16SrRNA全長序列的鑒別能力優(yōu)于5′端高可變區(qū)序列，但是應(yīng)用5′端高可變區(qū)序列作為目標(biāo)基因僅需要一個(gè)測(cè)序反應(yīng)即可完成，且其鑒別能力與全長序列比較接近，因此5′端高可變區(qū)序列應(yīng)用更為廣泛。由于序列高度保守性，16SrRNA對(duì)一些具有臨床意義的NTM分辨力較差，僅能鑒定至復(fù)合群水平而不能鑒定到具體菌種，如鳥分枝桿菌復(fù)合群、膿腫分枝桿菌復(fù)合群、偶發(fā)分枝桿菌復(fù)合群等[24]。hsp65比16SrRNA基因變異性大，因此鑒定能力高于16SrRNA序列，可區(qū)分16SrRNA序列無法區(qū)分的部分種類分枝桿菌，特別是快生長NTM[25]。此外，rpoB和ITS基因也常用于NTM菌種鑒定而且分辨能力較高[25-27]。特異基因測(cè)序多為實(shí)驗(yàn)室自建的方法，也有商業(yè)試劑盒。MicroSEQ ID系統(tǒng)(ThermoFisher Scientific，美國)可對(duì)16SrRNA的5′端500 bp和全長1500 bp進(jìn)行快速簡(jiǎn)便的擴(kuò)增和測(cè)序[28]。序列可與MicroSEQ ID圖書館的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)獲得菌種匹配結(jié)果。

有些菌種存在一定的種內(nèi)變異，如鳥分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和戈登分枝桿菌[11,22]。還有一些NTM菌種具有完全一致的單基因序列，單基因測(cè)序并不能將這些NTM區(qū)別開，因此，需進(jìn)行多基因聯(lián)合比對(duì)才能鑒定至種水平[29]。

公共數(shù)據(jù)中DNA序列多樣化，但對(duì)于上傳的序列缺乏監(jiān)管，可能存在一些不準(zhǔn)確或錯(cuò)誤的基因序列信息。當(dāng)使用公共數(shù)據(jù)庫時(shí)應(yīng)仔細(xì)選取參考序列進(jìn)行比對(duì)[22]。雖然也有一些商業(yè)化數(shù)據(jù)庫可用，如MicroSEQ或RipSeq Single/Mixed系統(tǒng)(Pathogenomix，美國)，Integrated Database Network System (IDNS；SmartGene Inc.，瑞士)和GenSeizer(GenSeizer，上海，中國)[30-32]。這些數(shù)據(jù)庫都還在持續(xù)更新中。

6. 全基因組測(cè)序法:在菌種鑒定和分型方面，全基因組測(cè)序法可提供最深入的信息[33]。全基因組測(cè)序具有較高的敏感度及強(qiáng)大的鑒別能力，在無法獲得可能感染病原體線索的情況下，臨床應(yīng)用越來越多。目前全基因組測(cè)序的價(jià)格依然較高且全基因組測(cè)序應(yīng)用的是數(shù)據(jù)處理過程。測(cè)序會(huì)產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，需要高效的計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)、較高的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)能力、高速的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[34]，尚不適合大規(guī)模應(yīng)用。全基因組測(cè)序還主要是用于流行病學(xué)研究，而非菌種鑒定。全基因組測(cè)序技術(shù)要更好的應(yīng)用于臨床上菌種鑒定，其操作步驟、生物信息學(xué)分析以及質(zhì)量控制方面都需要進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化[35]，需要結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)與微生物學(xué)知識(shí)做出正確的結(jié)果判讀。

隨著技術(shù)進(jìn)步，分子診斷技術(shù)在NTM檢測(cè)、菌種鑒定方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的應(yīng)用前景，但應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，還需要結(jié)合實(shí)際情況選擇合適的技術(shù)，以及提升NTM檢測(cè)和菌種鑒定技術(shù)能力。