李巧英

（山西省農(nóng)業(yè)種子總站，太原 030006）

隨著分子生物學(xué)理論和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記逐漸應(yīng)用在農(nóng)作物種子檢測中，實現(xiàn)了在基因水平上分析農(nóng)作物品種信息。品種間的差異通過多個位點DNA 序列長度不同或堿基組成不同表現(xiàn)出來，利用不同檢測平臺展示指紋信息，便于分析各品種不同位點的基因型，進行比對。分子標(biāo)記法快速檢測，避免了應(yīng)用傳統(tǒng)檢測方法受自然環(huán)境條件和人員主觀因素等影響的困惑。

分子標(biāo)記是一種以DNA 序列變異為基礎(chǔ)的標(biāo)記，在生物體基因組中，DNA 序列差異是生物遺傳多樣性的直接體現(xiàn)，通過研究這些差異可進行品種間親緣關(guān)系的分析。分子標(biāo)記在生物體中分布廣泛，多態(tài)性高，信息量豐富，遺傳穩(wěn)定，利用分子標(biāo)記進行種子基因分析，實驗結(jié)果及時可靠，在農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)控、品種身份鑒定、品種權(quán)保護、品種審定、基因定位和遺傳育種等方面具有重要的意義。經(jīng)過研究與改進，第1 代分子標(biāo)記方法由于各種問題與缺陷逐漸被淘汰，目前SSR 和SNP 分子標(biāo)記是農(nóng)作物種子檢測中應(yīng)用的優(yōu)良標(biāo)記方法。

1 檢測原理

SSR（簡單重復(fù)序列）第2 代DNA 分子標(biāo)記，是生物體內(nèi)存在的以l～6 個核苷酸為重復(fù)單元的DNA 序列，由于寡核苷酸重復(fù)序列和重復(fù)次數(shù)不同形成長短不一的核苷酸片段。將作物品種在某一位點的特異核苷酸序列作為標(biāo)記，根據(jù)核苷酸鏈兩端保守的基因序列設(shè)計不同的引物，將這些DNA 片段擴增出來，分析比較待測樣品在該位點的基因序列，確定品種基因型，分析品種間的遺傳關(guān)系。SSR 標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記，等位變異多，試驗重復(fù)性好，數(shù)據(jù)分析簡便，且易于樣品間結(jié)果比對和與數(shù)據(jù)庫信息比較。

SNP（單核苷酸多態(tài)性）第3 代DNA 分子標(biāo)記，是指生物體內(nèi)同一位點的不同等位基因之間由于插入、缺失、轉(zhuǎn)換或顛換引起的單個核苷酸差異，多為轉(zhuǎn)換和顛換。堿基差異是基因組中遺傳變異的最小結(jié)構(gòu)單位，直接導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的不同，利用SNP 分子標(biāo)記檢測這種差異可以幫助區(qū)分不同品種和研究品種間的關(guān)系。SNP 標(biāo)記在整個基因組中數(shù)量多，高密度分布，靈敏度高，突變頻率較低，易于基因分型，是一種二態(tài)性標(biāo)記，單個標(biāo)記位點的區(qū)分能力較弱，需要結(jié)合多個特異位點組合形成特定指紋區(qū)分品種，要求高通量檢測平臺。

SSR 與SNP 標(biāo)記方法中，SSR 標(biāo)記是以檢測品種特定位點的核苷酸片段長度作為評價依據(jù)，SNP標(biāo)記是以統(tǒng)計分析多個位點的堿基組成變化作為分析手段。SNP 標(biāo)記在生物體基因組中的密度比SSR標(biāo)記高，遺傳穩(wěn)定性也高，在農(nóng)作物種子檢測中不同標(biāo)記方法適合不同的檢測需要，具有不同的應(yīng)用價值。

2 檢測平臺

2.1 SSR 分子標(biāo)記法檢測平臺SSR 分子標(biāo)記法常用的檢測平臺有變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光毛細管電泳。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳是利用4.5%或6%的聚丙烯酰胺凝膠作為支持物分離PCR 擴增產(chǎn)物，經(jīng)固定、染色后形成特異的指紋圖譜，分析目標(biāo)DNA 片段的遷移率，與Marker 標(biāo)記條帶進行比較，確定PCR 產(chǎn)物的大小，通過指紋信息比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品，或與數(shù)據(jù)庫信息比對，確認品種信息。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測平臺需要將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品相鄰泳道同時電泳，或?qū)⒋郎y樣品與相應(yīng)Maker 目的條帶比較，估算DNA 片段大小。這種電泳方法能比較SSR 標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)庫中目前沒有標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋信息的品種，不需要標(biāo)準(zhǔn)樣品的DNA 作參照，但這種電泳檢測方法數(shù)據(jù)精確度低，1～5bp 差異不明顯[1]，自動化程度低。

熒光毛細管電泳檢測平臺是根據(jù)引物擴增范圍和目的等位基因的分布特征將40 對引物進行分組，設(shè)立十重?zé)晒饷毠茈娪倔w系[2]，將不同顏色熒光標(biāo)記的引物和具有自身分布特征的位點分為1 組，多重電泳?；蚍治鰞x分離PCR 產(chǎn)物，數(shù)據(jù)分析軟件（GeneMarker 或SSR 指紋分析器）分析待測樣品在該位點的基因特征，將檢測結(jié)果與SSR 指紋數(shù)據(jù)庫進行比對，確定待測樣品的指紋信息，分析品種身份。熒光毛細管電泳檢測平臺只分析檢測樣品，不需用標(biāo)準(zhǔn)樣品的DNA 作參照，但要求該標(biāo)準(zhǔn)樣品的指紋信息在SSR 指紋數(shù)據(jù)庫中完整備案。熒光毛細管電泳檢測平臺檢測結(jié)果精確，峰值圖可以明顯標(biāo)示品種間單個位點1bp 的差異。由此可知，熒光毛細管電泳比變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測到的等位基因和基因型數(shù)目多，區(qū)分品種的能力強。

2.2 SNP 分子標(biāo)記法檢測平臺SNP 分子標(biāo)記方法常用的檢測平臺有KASP 檢測平臺和芯片平臺。KASP 技術(shù)是根據(jù)引物末端特異匹配的堿基進行SNP 分型，擴增時需要多個特異的SNP 引物及兩個通用熒光探針和兩個通用淬滅探針[3]，經(jīng)過幾個PCR 擴增循環(huán)后，淬滅探針已被切碎，熒光探針退火結(jié)合到新合成的、無淬滅基團的互補鏈上，發(fā)出熒光，通過SNP 分型儀檢測熒光信號，數(shù)據(jù)分析軟件KlusterCallerTM自動確定該位點上的堿基，確定品種基因型。KASP 技術(shù)通過Pherastar SNP 分型儀掃描一塊1536 微孔板用時80s，時間短，效率高。

SNP 芯片是將大量特定的探針分子有序地固定在一小塊硅片、玻片或硝酸纖維素膜等載體上，加入已標(biāo)記的待測樣品，進行雜交，掃描信號的強弱與分布，確定目的基因的種類。SNP 芯片一次能夠平行分析大量基因，檢測幾十萬到上百萬個位點，且性能穩(wěn)定、操作簡單、檢測方便。但芯片設(shè)計開發(fā)成本較高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，目前市場上還沒有完善的種子質(zhì)量檢測SNP 芯片目錄，需要定制特定的SNP 芯片，不適合小樣本量檢測和大范圍推廣應(yīng)用。

SSR 與SNP 標(biāo)記方法在數(shù)據(jù)分析方面各有優(yōu)勢，SSR 標(biāo)記方法是將每份待測樣品分別與40 個位點依次對應(yīng)，獨立分析；SNP 標(biāo)記可以將所有檢測樣品對應(yīng)1 對引物，在1 張指紋圖中疊加分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計簡單，更容易實現(xiàn)整合。

3 在農(nóng)作物種子檢測中的應(yīng)用

3.1 SSR 技術(shù)在農(nóng)作物檢測中的應(yīng)用王鳳格等[2]用SSR 分子標(biāo)記法構(gòu)建了中國玉米審定品種SSR 標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)庫，繪制了玉米審定品種40 對SSR 引物的等位基因分布圖，為玉米種子真實性檢測提供標(biāo)準(zhǔn)樣品參照；蓋樹鵬等[4]篩選出6 對雙親互補型SSR 引物，檢測6 個玉米雜交種種子純度，能準(zhǔn)確鑒定出樣品中的自交株和異型株，與田間鑒定結(jié)果差異不顯著；黃殿成等[5]從引進人才、儀器設(shè)備、試驗操作、檢測成本和工作效率等方面，總結(jié)種子企業(yè)應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記法鑒定棉花品種真實性和種子純度，體現(xiàn)了SSR 分子標(biāo)記在企業(yè)經(jīng)營管理中發(fā)揮的重要作用。截至2020 年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布了基于SSR 標(biāo)記的玉米、水稻、小麥、馬鈴薯等20余種作物的品種鑒定方法標(biāo)準(zhǔn)[6]，在種業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

3.2 SNP 技術(shù)在農(nóng)作物檢測中的應(yīng)用北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心開發(fā)的SNP 芯片MaizeSNP3072[7]、MaizeSNP384[8]用于玉米品種真實性鑒定；中國水稻研究所開發(fā)的96 個SNPs KASP 檢測和50K 個SNPs 芯片用于鑒定水稻真實性[6]；金名捺等[9]利用水稻全基因組9K SNP 芯片分析水稻栽培種黃華占和野生稻Y605，開發(fā)特異SNP 位點檢測，根據(jù)基因分型，能準(zhǔn)確區(qū)分兩個品種；匡孟等[10]基于KASP技術(shù)，利用SNPline 平臺從棉花63K 全基因組芯片中篩選到26個SNP核心標(biāo)記快速檢測棉花雜交種純度。利用SNP 標(biāo)記法鑒定水稻、玉米、小麥品種真實性3項行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)通過審定[6]，棉花和油菜、大白菜等蔬菜作物的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建正在完善中。

4 小結(jié)

SSR 和SNP 兩種標(biāo)記方法在檢測通量、數(shù)據(jù)分析和試驗操作中各有優(yōu)勢，在不同的檢測項目中發(fā)揮各自的作用。李雪等[11]對11 套玉米種子雜交種和親本進行試驗，用40 對SSR 引物和3072 個SNP位點的數(shù)據(jù)比較兩種標(biāo)記方法在玉米種子真實性鑒定中的應(yīng)用，分析結(jié)果表明，這兩種方法在種子真實性鑒定方面具有較好的一致性，且這兩種標(biāo)記方法在區(qū)分品種能力和位點穩(wěn)定性等方面差異較小。SSR 分子標(biāo)記引物數(shù)量少，適合少量樣本檢測，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳費時、費力，檢測結(jié)果精確度低，熒光毛細管電泳自動化程度高，結(jié)果精確，但儀器設(shè)備、試劑及儀器維護成本較高；SNP 分子標(biāo)記實現(xiàn)了位點和樣本高通量檢測，儀器操作智能化，試驗數(shù)據(jù)易整合，但數(shù)據(jù)缺失和分型誤差頻率較高，購置儀器、試劑和芯片定制成本高。SSR 和SNP 兩種標(biāo)記方法和檢測平臺各有優(yōu)缺點，今后應(yīng)積極發(fā)揮SSR 標(biāo)記的靈活性，繼續(xù)開發(fā)SNP 技術(shù)的優(yōu)勢，適應(yīng)市場需要。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷優(yōu)化完善和檢測成本的逐漸降低，兩種標(biāo)記方法在農(nóng)作物種子檢測中將有更廣闊的應(yīng)用前景。