王 賢，劉 放，魏小紅，朱曉林，王寶強(qiáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

番茄(Solanumlycopersicum)在世界范圍內(nèi)廣泛種植，其營(yíng)養(yǎng)豐富、適應(yīng)性廣、食用方式多樣，是全球總產(chǎn)量最高的30種農(nóng)作物之一，在世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)市場(chǎng)中占有重要的地位[1]。但長(zhǎng)期以來(lái)，番茄的生產(chǎn)受到許多病害的影響，尤其是番茄黃化曲葉病毒病(tomato yellow leaf curl virus disease，TYLCVD)。番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)傳播媒介為煙粉虱，因此也被稱為煙粉虱傳雙生病毒(whitefly-transmitted geminiviruses，WTG)，可侵染茄科、豆科等20多種植物[2]。該病具有發(fā)病率高、危害大、傳播效率高等特點(diǎn)[3]。番茄感染TYLCV后，葉片變形黃化，無(wú)法正常開(kāi)花結(jié)果，對(duì)果實(shí)顏色、口感及營(yíng)養(yǎng)成分影響極大，使其綜合品質(zhì)降低，減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。1940年TYLCV在以色列首次被發(fā)現(xiàn)，隨后開(kāi)始大規(guī)模暴發(fā)，20世紀(jì)90年代末亞洲各國(guó)相繼發(fā)現(xiàn)該病毒病，1991年我國(guó)首次在廣西南寧發(fā)現(xiàn)該病毒，2006 年起該病毒傳播到北京、山西、江蘇、上海、廣東、廣西、云南等地，具有關(guān)部門(mén)統(tǒng)計(jì)，該病毒對(duì)我國(guó)番茄產(chǎn)業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)十多億元，嚴(yán)重威脅我國(guó)番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4-5]。該病毒最有效的解決方法是通過(guò)育種手段培育新的抗病品種，因此篩選抗病性較強(qiáng)的材料迫在眉睫。

番茄抗性品種的選擇中，表型、抗氧化酶活性、總酚與類(lèi)黃酮含量以及抗性基因的表達(dá)等作為主要的抗性指標(biāo)被用來(lái)鑒定不同材料的抗病能力[6]。植物體感染病原菌后，體內(nèi)活性氧過(guò)量積累，而超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)是普遍存在于植物體內(nèi)一類(lèi)重要的保護(hù)酶，可以清除體內(nèi)過(guò)剩的活性氧[7]，另外多種抗氧化酶相互協(xié)調(diào)作用，可以增強(qiáng)植物對(duì)病害的抵抗力[8-11]。鄒芳斌等[7]研究顯示，抗氧化酶活性的升高與黃瓜抗病能力呈極顯著正相關(guān)。Ji等[12]的研究顯示，SPA(sodium pheophorbide a)可以通過(guò)提高抗氧化酶活性來(lái)控制櫻桃番茄對(duì)灰霉病的抗性。因此，抗氧化酶含量的變化可以作為植物抗病性機(jī)制發(fā)生的重要指標(biāo)之一。次生代謝產(chǎn)物在植物的許多生長(zhǎng)代謝過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用，其中最主要的是酚類(lèi)，酚類(lèi)中最主要的是類(lèi)黃酮。研究發(fā)現(xiàn)，酚類(lèi)物質(zhì)與植物的抗病過(guò)程密切相關(guān)[13]，邱永祥等[14]認(rèn)為，感病后期抗病品種中的次生代謝物含量高于感病品種。植物感病后體內(nèi)的莽草酸或乙酸途徑會(huì)積累大量的酚類(lèi)物質(zhì)，抑制病原菌進(jìn)而達(dá)到抗病的目的。類(lèi)黃酮在植物抗病毒與抗菌中發(fā)揮重要作用，可以清除植物在非正常狀態(tài)下產(chǎn)生的自由基進(jìn)而在一定程度上降低植物的損傷[15]。早期的栽培番茄品種中沒(méi)有抗TYLCV的基因，而在野生番茄中蘊(yùn)含著豐富的抗病基因，如最初發(fā)現(xiàn)的醋栗番茄(Solanumpimpinellifolium)和秘魯番茄(Solanumperuvianum)等，目前已被報(bào)道的抗病基因主要有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4和Ty-5，帶有抗病基因的抗性植株被病毒侵染后，體內(nèi)病毒含量很低，不表現(xiàn)明顯的感病癥狀[16-17]。因此，了解植物抗病基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)程度對(duì)于研究植物抗病水平具有重要作用，植物抗病基因的表達(dá)分析已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

由于番茄黃化曲葉病對(duì)番茄產(chǎn)業(yè)的影響巨大，抗病性的鑒定與檢測(cè)大多集中在表型或某一單一的抗性指標(biāo)，目前綜合多種抗性指標(biāo)研究番茄抗黃化曲葉病的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選取自育的15份番茄種質(zhì)材料。利用苗期農(nóng)桿菌接種法接種TYLCV，從表型、帶毒率、抗氧化酶活性、次生代謝物含量、抗性基因表達(dá)多個(gè)方面綜合研究不同種質(zhì)的抗病性，旨在全面鑒定不同種質(zhì)的抗病能力并篩選出幾個(gè)抗病性較強(qiáng)的材料，為抗病育種材料的選擇及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料

編號(hào)分別為801、802、803、805、806、817、818、819、820、822、841、842、853、857、867，以及感病品種桃太郎Money Maker(MM)與抗病品種齊達(dá)利兩個(gè)對(duì)照品種，番茄種子由甘肅張掖益新泉蔬菜育種公司提供(齊達(dá)利由瑞士先正達(dá)種子公司提供，MM由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所鮮食番茄課題組提供)，所攜帶抗性基因見(jiàn)下表1。用于苗期接種的 TY-DNA 侵染性克隆 pBin-PLUS-1.7A+2β(農(nóng)桿菌)引自浙江大學(xué)。

表1 不同番茄材料的基因型

1.1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒，F(xiàn)astKing cDNA第一鏈合成試劑盒，熒光定量PCR試劑盒，植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 番茄苗的培養(yǎng)

將17份番茄種子用10%次氯酸鈉溶液浸泡10 min后播種于50孔的育苗穴盤(pán)中，置于育苗基地培養(yǎng)，長(zhǎng)出1～2片真葉后定植于花盆中繼續(xù)培養(yǎng)，每份種質(zhì)各定植10株。

1.2.2 pBin-PLUS-1.7A+2β的培養(yǎng)

事先分別配置固體與液體的LB培養(yǎng)基，配置過(guò)程中加入抗生素Kan(50 mg·L-1)和 Rif(50 mg·L-1)，先將含 pBin-PLUS-1.7A+2β的農(nóng)桿菌菌液涂布于固體LB培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱倒置暗培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，后挑選合適的單菌落轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，放于200 r·min-128 ℃的搖床過(guò)夜，于600 nm處測(cè)量吸光值且處于0.6～0.8時(shí)，方可達(dá)到接種要求。

1.2.3 接種病毒

參考張少麗等[18]的方法，采用農(nóng)桿菌接種法接種TYLCV。選取長(zhǎng)勢(shì)最佳的植株過(guò)量澆水，以便病毒侵入，采用1 mL注射器吸取菌液從葉背注射于植株體內(nèi)，注射時(shí)以可觀察到菌液滲入為準(zhǔn)，每株約0.2 mL。接種完成后分別于20、30、40 d調(diào)查發(fā)病情況并采樣，進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的活性、總酚與類(lèi)黃酮含量以及抗性基因表達(dá)測(cè)定，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 帶毒率的檢測(cè)

在接種20 d后對(duì)各材料進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，以此判斷該品種對(duì) TYLCV的易感程度。參考李佳蔚[19]的研究合成 TYLCV特異引物V2(F: 5′-GGGCCACGATTTAATTAGGGATCTTAT-3′； R: 5′-TACATTCTGTATATTCTGGGCTTCCG-3′)，其擴(kuò)增長(zhǎng)度為229 bp。PCR體系為20 μL，其中模板DNA 1 μL；Master Mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、ddH2O 7 μL。95 ℃變性5 min后開(kāi)始循環(huán)，95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72 ℃繼續(xù)延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳25 min(150 V)，最后用Goldview染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.2 抗氧化酶活性的測(cè)定

參照Hu等[20]的方法，采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性；參照裴斌等[21]的過(guò)氧化氫還原法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性；采用紫外分光光度法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性。

1.3.3 次級(jí)代謝物的測(cè)定

總酚和類(lèi)黃酮的測(cè)定分別參照唐巧玉等[22]和Pastrana-Bonilla等[23]。分別以沒(méi)食子酸與蘆丁繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算含量。

1.3.4 抗性基因的表達(dá)分析

采用天根生物公司RNA試劑盒分別于接種20、30、40 d提取番茄葉片中的總RNA，并用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。根據(jù)FastKing cDNA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參考天根公司的SYBR System操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。每種材料設(shè)3個(gè)重復(fù)。根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)Ty-1、Ty-2、Ty-3基因的引物，以actin基因?yàn)閮?nèi)參，見(jiàn)表2。合成由陜西楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司完成。

表2 抗病基因及引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel整理與分析實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)，用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(字母法標(biāo)記)與相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種質(zhì)番茄材料的表型及帶毒率分析

2.1.1 表型特征分析

如圖1所示，所有苗齡為30 d的試驗(yàn)植株接種TYLCV病毒后，選取各抗性水平下具有代表性的材料802、803、820、842、853、齊達(dá)利。與未感病植株相對(duì)比，802、803在感病20 d出現(xiàn)葉片卷曲、黃化、變形、變小并隨時(shí)間推移加重，至40 d時(shí)變形皺縮嚴(yán)重，表現(xiàn)為易感病；820在感病20 d與30 d癥狀并不明顯，而在40 d出現(xiàn)葉片黃化、卷曲、皺縮，842在感病20 d和30 d時(shí)癥狀不明顯，在40 d出現(xiàn)葉片輕微黃化，表現(xiàn)為不易感?。?53與齊達(dá)利感病后在各時(shí)期無(wú)任何感病癥狀，表現(xiàn)為免疫。

A，對(duì)照；B，感病后表型。A， The control; B， The phenotype after infection.圖1 部分品種感病后的表型Fig.1 The phenotypes of some varieties after virus infection

2.1.2 帶毒率分析

檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，17份番茄材料全部擴(kuò)增出約229 bp的條帶，說(shuō)明在接種后20 d各番茄材料中均含黃化曲葉病毒的DNA序列，病毒成功侵入植株體內(nèi)，帶毒率為100%，說(shuō)明各試驗(yàn)材料成功接種TYLCV，可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)與分析。該結(jié)果也表明了農(nóng)桿菌接種法接種該病毒的可行性。

圖2 不同番茄材料接種20 d后的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of different tomato materials after virus inoculation for 20 days

2.2 不同種質(zhì)番茄幼苗葉片抗氧化酶的分析

2.2.1 SOD活性分析

如圖3所示，感病后，805、817、819、820、841、842、853、857、867的SOD活性在各時(shí)期下均顯著高于陰性對(duì)照MM(P<0.05)；853、867材料的SOD活性在各時(shí)期下甚至高于陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利，其中867具有顯著性差異(P<0.05)；801的SOD活性在各時(shí)期下均低于陰性對(duì)照MM；在20 d時(shí)，867的SOD活性是陰性對(duì)照MM的1.80倍，801的SOD活性是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.55倍，在30 d時(shí)，853的SOD活性是陰性對(duì)照MM的1.50倍，806的SOD活性是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.70倍，在40 d時(shí)，867的SOD活性是陰性對(duì)照MM的1.56倍，801的SOD活性是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.69倍。

柱上沒(méi)有相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。The bars without the same lowercase letters showed significant difference(P<0.05). The same as below.圖3 不同番茄材料接種病毒后超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化情況Fig.3 Changes of superoxide dismutase (SOD) activity in different tomato materials after virus inoculation

2.2.2 CAT活性分析

如圖4所示，感病后，817、842、853、857、867的CAT活性在各時(shí)期下均高于陰性對(duì)照MM，其中817、853、867具有差異顯著性(P<0.05)；853材料的CAT活性在各時(shí)期下甚至高于陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利；在20 d時(shí)，857的CAT活性是陰性對(duì)照MM的2.46倍，819的CAT活性是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.44倍，在30 d時(shí)，867的CAT活性的是陰性對(duì)照MM的2倍，820的CAT活性是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.62倍，在40 d時(shí)，867的CAT活性是陰性對(duì)照MM的2.12倍，822的CAT活性是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.53倍。

圖4 不同番茄材料接種病毒后過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的變化情況Fig.4 Changes of catalase (CAT) activity in different tomato materials after virus inoculation

2.2.3 APX活性分析

如圖5所示，感病后，801、805、817、818、819、820、822、841、842、853、857、867的APX活性在各時(shí)期下均高于陰性對(duì)照MM，其中817、819、820、841、842、853、857、867具有差異顯著性(P<0.05)；842、853、857、867材料的APX活性在各時(shí)期下甚至高于陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利，其中853、867具有顯著性差異(P<0.05)。在20 d時(shí)，853的APX活性是陰性對(duì)照MM的3.12倍，803的APX活性是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.29倍，在30 d時(shí)，867的APX活性是陰性對(duì)照MM的2.81倍，803的APX活性是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.36倍，在40 d時(shí)，857的APX活性是陰性對(duì)照MM的2.1倍，803的APX活性是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.4倍。

圖5 不同番茄材料接種病毒后抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性的變化情況Fig.5 Changes of ascorbate peroxidase (APX) activity in different tomato materials after virus inoculation

2.3 不同種質(zhì)番茄幼苗葉片總酚及類(lèi)黃酮分析

2.3.1 總酚含量分析

如圖6所示，感病后，802、805、806、817、818、819、820、841、842、853、857、867的總酚含量在各時(shí)期下均高于陰性對(duì)照MM，其中805、806、817、819、820、841、842、853、857、867具有差異顯著性(P<0.05)；853材料的總酚含量在各時(shí)期下甚至高于陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利；在20 d時(shí)，853的總酚含量是陰性對(duì)照MM的1.68倍，803的總酚含量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.56倍，在30 d時(shí)，853的總酚含量是陰性對(duì)照MM的1.72倍，801的總酚含量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.57倍，在40 d時(shí)，857的總酚含量是陰性對(duì)照MM的1.82倍，801的總酚含量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.62倍。

圖6 不同番茄材料接種病毒后總酚含量的變化情況Fig.6 Changes of total phenol content in different tomato materials after virus inoculation

2.3.2 類(lèi)黃酮含量分析

如圖7所示，感病后，817、818、820、841、842、853、857、867的類(lèi)黃酮含量在各時(shí)期下均高于陰性對(duì)照MM，其中817、853、857、867具有差異顯著性(P<0.05)；857、867材料的類(lèi)黃酮含量在各時(shí)期下甚至高于陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利，其中857具有顯著性差異(P<0.05)；在20 d時(shí)，857的類(lèi)黃酮含量是陰性對(duì)照MM的4.02倍，803的類(lèi)黃酮含量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.32倍，在30 d時(shí)，857的類(lèi)黃酮含量是陰性對(duì)照MM的4.06倍，806的類(lèi)黃酮含量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.36倍，在40 d時(shí)，857的類(lèi)黃酮含量是陰性對(duì)照MM的4.28倍，802的類(lèi)黃酮含量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.211倍。

圖7 不同番茄材料接種病毒后類(lèi)黃酮含量的變化情況Fig.7 Changes in the content of flavonoids in different tomato materials after virus inoculation

2.4 不同種質(zhì)番茄幼苗葉片抗病基因表達(dá)分析

2.4.1Ty-1基因表達(dá)分析

如圖8所示，857、867材料感病后Ty-1基因表達(dá)量在各時(shí)期下均高于陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利，其中867材料具有顯著性差異(P<0.05)，801、802、803、805、806、817、818、819、820、841、842材料感病后Ty-1基因表達(dá)量在各時(shí)期下均低于陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利，其中除802、817、842外其他材料均具有顯著性差異(P<0.05)；在20 d時(shí)，867的Ty-1基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的 2.2倍，802的Ty-1基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.53倍，在30 d時(shí)，867的Ty-1基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的 1.4倍，801的Ty-1基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.41倍，在40 d時(shí)，822的Ty-1基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的1.4倍，818的Ty-1基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.42倍，另外，總體來(lái)看，番茄植株接種病毒后Ty-1基因表達(dá)量在30 d、40 d時(shí)有明顯升高。

圖8 不同番茄材料接種病毒后Ty-1基因的表達(dá)情況Fig.8 Expression of Ty-1 gene in different tomato materials after virus inoculation

2.4.2Ty-2基因表達(dá)分析

如圖9所示，除853材料外，其他供試材料感病后Ty-2基因表達(dá)量在各時(shí)期下均低于陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利，且具有顯著性差異(P<0.05)；在20 d時(shí)，853的Ty-1基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.93倍，820的Ty-2基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.31倍，在30 d時(shí)，853的Ty-2基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的1.03倍，803的基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.42倍，在40 d時(shí)，853的Ty-2基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的1.03倍，801的Ty-2基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.48倍。

圖9 不同番茄材料接種病毒后Ty-2基因的表達(dá)情況Fig.9 Expression of Ty-2 gene in different tomato materials after virus inoculation

2.4.3Ty-3基因表達(dá)分析

如圖10所示，842、857、867材料感病后Ty-3基因表達(dá)量在各時(shí)期下均高于陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利，其中857、867材料具有顯著性差異(P<0.05)，801、802、803、805、806、817、818、819、820、841材料感病后Ty-3基因表達(dá)量在各時(shí)期下均低于陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利，均具有顯著性差異(P<0.05)；在20 d時(shí)，857的Ty-3基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的1.38倍，820的Ty-3基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.31倍，在30 d時(shí)，867的Ty-3基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的1.17倍，820的基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.26倍，在40 d時(shí)，857的Ty-3基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的1.53倍，820的Ty-3基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照齊達(dá)利的0.38倍。另外，842、853、857、867的Ty-3基因表達(dá)量高于其他材料，且存在顯著性差異(P<0.05)。

圖10 不同番茄材料接種病毒后Ty-3基因的表達(dá)情況Fig.10 Expression of Ty-3 gene in different tomato materials after virus inoculation

2.5 抗氧化酶、總酚、類(lèi)黃酮以及抗病基因表達(dá)的相關(guān)性分析

由表3可以看出，番茄植株感染黃化曲葉病毒后，其體內(nèi)的抗氧化酶活性的強(qiáng)弱、總酚與類(lèi)黃酮的含量高低以及抗病基因表達(dá)量之間存在密切相關(guān)的關(guān)系，SOD活性、CAT活性、APX活性、總酚含量、類(lèi)黃酮含量、Ty-1、Ty-2和Ty-3基因的表達(dá)量相互之間均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其中除總酚含量與Ty-1基因表達(dá)量之間呈顯著正相關(guān)外，其余各指標(biāo)相互之間均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。另外APX活性與SOD活性之間相關(guān)性最大，總酚含量與Ty-1基因的表達(dá)量之間相關(guān)性最小。

表3 各抗性指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

黃化曲葉病毒病是目前影響番茄產(chǎn)量的主要病害之一，目前解決這一病害最有效的方法是通過(guò)育種手段培育新的抗病品種，但存在對(duì)抗性水平研究較少，了解不夠全面的問(wèn)題。為了解帶有抗性基因的番茄材料對(duì)番茄黃化曲葉病毒病的抗性，對(duì)15份番茄以及兩份對(duì)照材料進(jìn)行帶毒率 、抗氧化酶活性、總酚與類(lèi)黃酮含量的檢測(cè)，并利用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析抗性基因的表達(dá)水平。植物受到病毒侵害后，體內(nèi)活性氧會(huì)大量積累，而抗氧化酶則可以清除多余的活性氧，從而減輕植物在病害下的損傷。因此，抗氧化酶活性的高低可反映出植物對(duì)病毒抗性的強(qiáng)弱[8，10]，植物產(chǎn)生的次生代謝物與植物的抗病也密切相關(guān)，研究表明，酚類(lèi)物質(zhì)的積累可以抑制多數(shù)病原菌，植物受到侵害時(shí)酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)快速積累，而感病品種則積累較慢，類(lèi)黃酮物質(zhì)可以提供質(zhì)子供體而清除自由基，達(dá)到抗逆抗病的效果。因此，次級(jí)代謝物的含量高低也可反映出植物對(duì)病毒抗性的強(qiáng)弱[24-27]。

目前有關(guān)植物抗病性的研究中，多將抗氧化酶活性作為一個(gè)重要指標(biāo)，王玲平[28]對(duì)黃瓜不同抗性品種的研究顯示，隨時(shí)間推移抗氧化酶活性均有不同程度升高且抗病品種中的SOD酶活性高于感病品種。丁九敏等[29]研究顯示，黃瓜接種霜霉病后，CAT、SOD活性均升高。但對(duì)APX的研究較少。賈雙雙等[30]研究顯示，高抗材料的總酚與類(lèi)黃酮含量均顯著高于高感材料。本課題組之前的病情分析表明，供試材料中齊達(dá)利、853、857、867對(duì)TYLCV表現(xiàn)為免疫，805、817、819、820、841、842對(duì)TYLCV表現(xiàn)為高抗，MM、802、806、818、822對(duì)TYLCV表現(xiàn)為輕微抗病，801和803的抗病能力最弱。本研究結(jié)果表明，所有供試材料均成功感染TYLCV，從表型看，853沒(méi)有任何感病特征，802與803感病最為嚴(yán)重；867、853、857的抗氧化酶活性最高，其中853、867的SOD活性、853的CAT活性和842、853、857、867的APX活性在各時(shí)期下甚至高于陽(yáng)性對(duì)照，另外在20d時(shí)853的APX活性是陰性對(duì)照的3.12倍；857、853、867 的次生代謝物含量最高，其中853的總酚含量和857、867的類(lèi)黃酮含量在各時(shí)期甚至高于陽(yáng)性對(duì)照，另外在40 d時(shí)，857的類(lèi)黃酮含量是陰性對(duì)照的4.28倍；感病植株體內(nèi)的各抗性指標(biāo)相互之間均呈極顯著正相關(guān)(總酚與Ty-1之間為顯著正相關(guān))。這與趙秀娟等[31]、齊紹武等[32]、賈雙雙等及本課題組之前的研究結(jié)論相符合。在15種供試材料中，857、853、867的抗氧化酶活性與次生代謝物含量均最高，初步推測(cè)抗氧化酶與次生代謝物之間存在因果關(guān)系。不同的供試品種對(duì)病毒的抵抗力表現(xiàn)不同，分析原因是不同的品種其基因型、遺傳物質(zhì)以及體內(nèi)防御系統(tǒng)存在差異。進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)的抗氧化酶合成水平以及次生代謝物積累水平存在差異。

目前報(bào)道的番茄黃化曲葉病毒的抗性基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4和Ty-5等[33-34]，這些基因在一定條件下可以抑制番茄黃化曲葉病毒的擴(kuò)增、表達(dá)以及移動(dòng)，從而從根本上達(dá)到抗病毒的目的[19]，但不同抗性基因在番茄 TYLCV 病害防御中的機(jī)理報(bào)道較少。不同抗性基因?qū)?TYLCV 病原的抗性水平不同，相關(guān)抗性基因在 TYLCV 病原侵染下的表達(dá)水平及差異鮮有報(bào)道[35]。 田兆豐等[36]用TYLCV感染不同基因型的番茄品種，采用qRT-PCR法分析基因表達(dá)，結(jié)果顯示，隨發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，抗病基因Ty-1、Ty-3的基因表達(dá)量均升高，在不同品種中存在差異。本研究結(jié)果表明，867、857、853、842的抗病基因的表達(dá)量最高，857、867的Ty-1基因表達(dá)量、842、857、867的Ty-3基因表達(dá)量在各時(shí)期下均高于陽(yáng)性對(duì)照，另外在20 d時(shí)867的Ty-1基因表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照的2.2倍?？傮w來(lái)看，植物接種病毒后Ty-1基因表達(dá)量在30、40 d時(shí)有明顯升高。這暗示出番茄感染病毒后，其抗病基因Ty-1大量表達(dá)的時(shí)間較其他抗病基因較遲，說(shuō)明Ty-1基因表達(dá)具有延遲性，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究?？共』虮磉_(dá)量越高的品種，抗氧化酶含量與次生代謝物含量也越高，其抗病能力也越強(qiáng)，表現(xiàn)出正相關(guān)性。分析原因可能是抗性基因的表達(dá)，促進(jìn)了抗氧化酶的合成，也促進(jìn)了次生代謝物的積累，也可能是抗性基因的表達(dá)與植株的抗病信號(hào)通路存在聯(lián)系，抗病基因的產(chǎn)物調(diào)控了信號(hào)分子，通過(guò)信號(hào)傳遞在生理水平上產(chǎn)生防御反應(yīng)。另外發(fā)現(xiàn)802與803攜帶的抗性基因多于822，但抗病性卻弱于822，分析原因822可能存在其他的抗病途徑， 802與803在病毒引起的一系列逆境中的抵抗力較弱。綜合分析，植物的抗病系統(tǒng)是一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，受多種物質(zhì)與因素的調(diào)節(jié)，眾所周知，基因的表達(dá)可以調(diào)節(jié)植物對(duì)逆境的應(yīng)答，而植物抗病的應(yīng)答又離不開(kāi)酶這個(gè) “員工”，植物的許多抗逆過(guò)程都是通過(guò)酶的介導(dǎo)完成的。本實(shí)驗(yàn)中抗病基因相對(duì)表達(dá)量的升高與酶活性的升高、總酚與類(lèi)黃酮含量的升高相互聯(lián)系，共同參與番茄植物的抗病過(guò)程，但具體如何聯(lián)系還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

對(duì)不同番茄材料進(jìn)行病毒檢測(cè)和抗性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，所有研究材料均成功攜帶TYLCV，帶毒率為100%；不同材料的抗病能力表現(xiàn)如下， 853無(wú)任何的感病特征，802與803感病最為嚴(yán)重； 867、853、857的抗氧化酶活性較高，842與819次之，801與803較低； 857、853、867的總酚與類(lèi)黃酮含量較高，817與842次之，822與803較低； 867、857、853、842的抗性基因表達(dá)水平較高，817與822次之，805與820較低。對(duì)各方面指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示，不同番茄材料中的抗病能力較高的為867、857、853三個(gè)材料，817與842次之， 803最低，可將867、857、853用作高抗性的育種材料或生產(chǎn)應(yīng)用中，817與842作為替代材料。植株感病后體內(nèi)的SOD、CAT、APX活性、總酚、類(lèi)黃酮含量、Ty-1、Ty-2和Ty-3基因的表達(dá)量相互之間均呈極顯著正相關(guān)(總酚與Ty-1之間為顯著正相關(guān))，另外番茄植株感病后體內(nèi)Ty-1基因的表達(dá)具有延遲性。