季權(quán)安，劉 燕，肖琛聞，黃葉娥，李 科，韋 強(qiáng)，鮑國(guó)連

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

兔流行性腹脹病是由特定病原引起的以腹脹為典型臨床特征的家兔傳染病[1]，自2004年春開始在我國(guó)各地流行，具有高發(fā)病率和高死亡率[2]。關(guān)于兔流行性腹脹病的病因，目前尚無(wú)定論，生產(chǎn)上也還沒(méi)有較為有效的治療措施[3]。為了早日探明病因，作者團(tuán)隊(duì)先后在浙江省臺(tái)州臨海(LH)、嘉興嘉善(JS)、杭州富陽(yáng)(FY)等地的30多家規(guī)模兔場(chǎng)開展流行病學(xué)調(diào)查，從上百例被檢病死兔病樣中分離病原菌，其中，居首位的是大腸埃希菌(Escherichiacoli)，排其次的是魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)。另外，團(tuán)隊(duì)人員還從病死兔的糞便和腸黏膜樣品中鏡檢到少量球蟲卵囊。據(jù)此，我們認(rèn)為該病可能是一種以魏氏梭菌為主，單一或混合大腸埃希菌、沙門氏菌感染所致的傳染病[4]。大腸埃希菌和魏氏梭菌容易產(chǎn)生耐藥性，用化學(xué)藥物進(jìn)行控制，不但成本高、效果差異大，還易造成藥物殘留。當(dāng)前，我國(guó)正在實(shí)行飼料端全面禁抗(生素)、養(yǎng)殖端減抗限抗，因此對(duì)新型、綠色抗生素替代品的探尋已迫在眉睫。溶菌酶(LZ)具有殺菌免疫功能[5]，于1921年由蘇格蘭生物學(xué)家亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)[6]，是動(dòng)物上重要的非特異性免疫因子。革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)的細(xì)胞壁和革蘭氏陰性菌(G-)的內(nèi)壁層幾乎全部由肽聚糖組成，LZ能有效地水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，使細(xì)胞溶解死亡[7]，從而達(dá)到抗菌消炎的目的。LZ與抗生素的殺菌機(jī)制不同，不易產(chǎn)生耐藥性，具有安全、無(wú)殘留、活性穩(wěn)定等優(yōu)良特性[8]。為了有效防治兔流行性腹脹病，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查與病原分離鑒定結(jié)果，本研究選取LH、JS、FY的3家兔流行性腹脹病常發(fā)場(chǎng)，開展LZ臨床防治試驗(yàn)研究?，F(xiàn)將相關(guān)內(nèi)容總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

供試小白鼠40只，體重在30～50 g，購(gòu)自浙江省中醫(yī)藥大學(xué)。供試幼兔56只，2月齡左右，體重在1.0～1.5 kg，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)兔場(chǎng)提供。

另選取LH、JS、FY的3個(gè)常發(fā)病兔場(chǎng)的60日齡無(wú)癥狀兔，及經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確診、癥狀輕重不一的流行性腹脹病患兔用于預(yù)防和治療試驗(yàn)。

1.1.2 藥品和主要試劑

LZ(酶活力≥500 U·mg-1，批號(hào)為200423)，由浙江艾杰斯生物科技有限公司提供；普通瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、姬姆薩氏染色液由本實(shí)驗(yàn)室配制；血瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，及生化試驗(yàn)用各種糖發(fā)酵管、甘露醇、甲基紅(MR)試劑、VP試劑、尿素酶試劑、H2S，均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。其他相關(guān)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查

深入主要養(yǎng)殖地區(qū)實(shí)地走訪，組織浙江省臺(tái)州、嘉興、寧波、紹興、杭州等地的養(yǎng)殖戶主、飼養(yǎng)人員、診治獸醫(yī)開展座談，詢問(wèn)養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病現(xiàn)狀、臨床癥狀、防治措施與效果，以及同群和鄰群、本場(chǎng)和當(dāng)?shù)赝脠?chǎng)有無(wú)類似病例。入場(chǎng)抽查，現(xiàn)場(chǎng)觀察位于LH、JS、FY的3個(gè)常發(fā)病兔場(chǎng)的病情，詳細(xì)了解飼養(yǎng)、管理、環(huán)境衛(wèi)生、飼料質(zhì)量、水源安全等情況。借助統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

1.2.2 臨床剖檢與病理變化觀察

將病死兔頭朝左，右側(cè)臥于解剖臺(tái)上，用帶鉤鑷子配合剪刀解開體表，露出左側(cè)胸腹部，然后從腹部朝兔頭方向剪去整個(gè)腹部肌肉，用大剪去掉前胸廓，露出整個(gè)胸腹腔，逐一查視心、肝、脾、肺、腎、氣管、腸系膜淋巴結(jié)等器官、組織是否充血、出血、腫脹，有無(wú)變性、壞死灶、灰白色結(jié)節(jié)等病變，觀察胃、十二指腸、空腸、結(jié)腸、盲腸內(nèi)容物狀況，及胃、腸黏膜有無(wú)脫落，胃是否膨大、充滿氣體和液體。

1.2.3 病原分離鑒定

無(wú)菌采集心、心包液、肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)、胃內(nèi)容物、小腸內(nèi)容物和盲腸內(nèi)容物。將上述內(nèi)臟病料接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)特征均一的菌落傳代純化，將純化的培養(yǎng)物再次劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。將純化后的病原菌按照常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗(yàn)，并將純化后的病原菌接種到幼兔體內(nèi)進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)，提取后供致病力試驗(yàn)用。

用上述肉湯培養(yǎng)物(即將無(wú)菌采集到的病料接種于肉湯培養(yǎng)基后經(jīng)純化復(fù)壯培養(yǎng)的菌毒，亦稱復(fù)壯毒)注射小鼠(經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定每只注射0.02 mL)和2月齡左右的供試兔(經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定每只注射0.5 mL)，24 h后觀察死亡和病變情況。

人工發(fā)病試驗(yàn)：取上述腸內(nèi)容物(含小腸內(nèi)容物和盲腸內(nèi)容物)用超純水3倍稀釋，無(wú)菌紗布過(guò)濾，1 000×g離心15 min，灌喂健康幼兔4只，每只1 mL，另設(shè)對(duì)照組4只。

取病死兔病變部結(jié)節(jié)或刮屑物進(jìn)行壓片或涂片，用姬姆薩氏液染色，鏡檢各型蟲體。應(yīng)用飽和鹽水漂浮法鏡檢球蟲卵囊：取新鮮兔糞5～10 g放入量杯中，先加少量飽和鹽水將兔糞搗爛混勻，再加飽和鹽水到50 mL，將糞液用雙層紗布過(guò)濾，濾液靜置15～30 min，取浮液鏡檢球蟲卵囊數(shù)量。

1.2.4 預(yù)防與治療試驗(yàn)

分別在LH、JS、FY常發(fā)病兔場(chǎng)采用LZ進(jìn)行臨床防治試驗(yàn)。選取60日齡無(wú)癥狀兔開展預(yù)防試驗(yàn)，選取經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確診、癥狀輕重不一的流行性腹脹病患兔進(jìn)行治療試驗(yàn)。每個(gè)兔場(chǎng)設(shè)4組，即將預(yù)防試驗(yàn)和治療試驗(yàn)均隨機(jī)分為處理組和對(duì)照組，每組45只。預(yù)防試驗(yàn)中，處理組每100 kg全價(jià)飼料添加10 g溶菌酶，按照1日2次、每次每只35～50 g的量(即按照兔體重7%的比例，下同)飼喂，連用5 d；治療試驗(yàn)中，處理組每100 kg飼料添加20 g溶菌酶，按照1日2次、每次每只35～100 g的量飼喂，連用5 d。預(yù)防試驗(yàn)和對(duì)照試驗(yàn)中，對(duì)照組飼料中均不添加任何藥物。觀察、統(tǒng)計(jì)各組的發(fā)病、死亡和治愈只數(shù)。

防治效果的判定標(biāo)準(zhǔn)如下：腹脹消失，精神、食欲正常的判為治愈；預(yù)防過(guò)程中出現(xiàn)精神不振、食欲減退、腹部膨脹等現(xiàn)象，觸摸腹部有明顯的硬物感，伴有不同程度的腹瀉或便秘的判為發(fā)?。环乐芜^(guò)程中發(fā)生死亡的判為病死。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果與業(yè)內(nèi)學(xué)者觀點(diǎn)基本相符：該病不分品種、不分季節(jié)均可發(fā)病，但以春、秋季高發(fā)，發(fā)病率普遍在30%～60%，病死率達(dá)90%以上，病情嚴(yán)重兔場(chǎng)病死率高達(dá)100%。發(fā)病兔以斷奶至3月齡為主，尤以40～70日齡發(fā)病率最高，成年兔少發(fā)，未見(jiàn)哺乳期發(fā)病。發(fā)病期普遍持續(xù)1～3周，最長(zhǎng)可達(dá)1個(gè)月以上，部分兔場(chǎng)間隔一段時(shí)間會(huì)復(fù)發(fā)。該病呈地方流行性，不同地區(qū)間有較大差異。

調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，LH、JS的飼養(yǎng)管理、環(huán)境衛(wèi)生相較于FY差，發(fā)病情況相對(duì)更嚴(yán)重。添加抗球蟲藥物、抗菌藥物進(jìn)行防治的養(yǎng)殖場(chǎng)大多反映效果不佳或不明顯。

2.2 臨床癥狀和病理變化

觀察臨床病癥發(fā)現(xiàn)，多數(shù)病死兔腹部膨脹如鼓(圖1)，觸摸腹部有明顯硬物感，肛周圍被毛潮濕并伴有糞便污染。剖檢病死兔可見(jiàn)：心、肺、胸腺等臟器有不同程度出血，但肝、脾、腎未見(jiàn)明顯的出血點(diǎn)、壞死灶和灰白色結(jié)節(jié)等病變；胃腸臌氣，積液，部分家兔胃黏膜脫落，潰瘍；腸壁有出血點(diǎn)；盲腸內(nèi)充滿氣體，伴有較硬的塊狀物；有的結(jié)腸、直腸有膠凍樣物。

A，腹部膨脹如鼓，觸摸有硬物感；B，胃黏膜脫落，潰瘍；C，盲腸充滿氣體，內(nèi)容物硬結(jié)。A， Abdominal expansion as drum; B， Gastric mucosa exfoliation and ulcer; C， Caecum filled with gas and content binding.圖1 病死兔的臨床病癥照片F(xiàn)ig.1 Photos of died rabbits

2.3 細(xì)菌分離鑒定

針對(duì)LH、JS、FY送檢的112例40～90日齡疑似流行性腹脹病患兔進(jìn)行剖檢。革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，部分純化培養(yǎng)菌系兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌。該菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、灰白色菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上呈紅色菌落(圖2)，在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上呈黑色帶金光菌落。經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定，該菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘露醇、鼠李糖，均不產(chǎn)生H2S，尿素酶陰性。將肉湯培養(yǎng)物經(jīng)腹腔注射，小白鼠、家兔于24 h內(nèi)死亡，且供試小白鼠全部死亡，20只供試兔中死亡19只，致死率達(dá)95.0%，病變與自然發(fā)病相同。人工發(fā)病試驗(yàn)結(jié)果顯示：死亡2只，且從死亡家兔中分離到同種菌，另2只食欲明顯下降；而對(duì)照組4只健活。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，分離菌符合大腸埃希菌生化特征。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在全部112只送檢患兔中，分離到大腸埃希菌的合計(jì)有78只，占比69.6%(表1)，可見(jiàn)，大腸埃希菌是兔流行性腹脹病的主要病原之一。

圖2 大腸埃希菌革蘭氏染色、分離培養(yǎng)(麥康凱培養(yǎng)基)圖Fig.2 Gram staining， isolation and culture (on MacConkey agar) of Escherichia coli

在分離菌中，革蘭氏染色鏡檢還發(fā)現(xiàn)部分菌端鈍圓、有明顯莢膜的革蘭氏陽(yáng)性粗大桿菌，但未見(jiàn)芽胞。這些分離菌在肉湯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)基變混濁，并產(chǎn)生大量氣體。將其接種于血瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，形成雙溶血環(huán)的圓形、表面光滑、邊緣整齊的灰白色菌落(圖3)。生化反應(yīng)顯示，其能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和果糖，產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，不發(fā)酵甘露醇。將肉湯培養(yǎng)物經(jīng)腹腔注射，小白鼠、家兔于24 h死亡，且供試小白鼠全部死亡，20只供試兔中死亡19只，致死率達(dá)95.0%，病變與自然發(fā)病相同。人工發(fā)病試驗(yàn)結(jié)果顯示：死亡2只，且從死亡家兔中均分離到同種菌，另外2只食欲不振；而對(duì)照組4只健活。該分離菌的細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)生長(zhǎng)特性和生化特性與魏氏梭菌一致。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在全部112只送檢患兔中，分離到魏氏梭菌的合計(jì)有69只，占比61.6%，與大腸埃希菌的混合感染率為55.4%，可見(jiàn)，混合感染魏氏梭菌是激發(fā)兔流行性腹脹病的主要病原之一。

取病死兔病變部結(jié)節(jié)與刮屑物進(jìn)行壓片或涂片，經(jīng)姬姆薩氏液染色，鏡檢到少量球蟲體。應(yīng)用飽和鹽水漂浮法，從糞便濾浮液鏡檢到少量球蟲卵囊，屬于輕微感染。此外，還有少量疑似沙門氏桿菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等未定型雜菌。這些蟲菌數(shù)量極少，并無(wú)致病力，亦未能復(fù)制到相同病例。

2.4 臨床防治試驗(yàn)

2.4.1 預(yù)防試驗(yàn)

預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果顯示，LZ對(duì)兔流行性腹脹病具有明顯的預(yù)防效果，3個(gè)兔場(chǎng)預(yù)防組的發(fā)病率均較對(duì)照組降低50個(gè)百分點(diǎn)以上(表2)，差異極顯著(P<0.01)，說(shuō)明LZ可作為養(yǎng)兔場(chǎng)日常預(yù)防添加使用。

表2 溶菌酶對(duì)兔流行性腹脹病的預(yù)防效果

2.4.2 治療試驗(yàn)

LH、JS、FY三地兔場(chǎng)各取45只患兔，經(jīng)過(guò)治療，分別治愈38、40、42只，未得到有效治療而病死的數(shù)量分別為7、5、3只(表3)。結(jié)果顯示，LZ對(duì)兔流行性腹脹病具有明顯療效，是治療兔流行性腹脹病發(fā)病的有效藥物，3個(gè)兔場(chǎng)治療組的病死率比對(duì)照組低70多個(gè)百分點(diǎn)(表3)，差異極顯著(P<0.01)。

表3 溶菌酶對(duì)兔流行性腹脹病的治療效果

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)兔流行性腹脹病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，LH、JS兩地兔場(chǎng)多為經(jīng)驗(yàn)不足的新建兔場(chǎng)，兔舍衛(wèi)生條件較差，濕度較高，飼養(yǎng)管理不善，飼料質(zhì)量也存在一些問(wèn)題，從其送檢病例中分離到的魏氏梭菌和大腸埃希菌相對(duì)FY的兔場(chǎng)要多，發(fā)病率和病死率也相對(duì)更高。王曉梅[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)管理較好的兔場(chǎng)很少發(fā)生兔流行性腹脹病，而衛(wèi)生和管理不善的兔場(chǎng)，如兔舍寒冷、陰暗潮濕、陽(yáng)光不足、通風(fēng)不良和環(huán)境衛(wèi)生差的兔場(chǎng)，發(fā)病較為嚴(yán)重。本研究經(jīng)實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)管理不善和不利的環(huán)境因素會(huì)明顯增加兔流行性腹脹病的發(fā)病率。

大腸埃希菌、魏氏梭菌廣泛存在于各地養(yǎng)兔場(chǎng)。林毅等[4]報(bào)道，兔流行性腹脹病的病原菌可能包括魏氏梭菌、巴氏桿菌、大腸埃希菌，系單一或混合感染所致。劉照波等[9]報(bào)道了在山東某兔場(chǎng)分離鑒定出魏氏梭菌與大腸埃希菌混合感染的兔流行性腹脹病病例；白國(guó)勇等[10]從兔流行性腹脹病病例中分離到以魏氏梭菌和大腸埃希菌為主的多株細(xì)菌，且分離菌有一定的致病力。Licois等[11]認(rèn)為，該病是一種腸道細(xì)菌性傳染病。Huybens 等[12]初步證明，兔流行性腹脹病由細(xì)菌感染引起，而非病毒或寄生蟲感染引起。Djukovic等[13]發(fā)現(xiàn)，一種新型梭狀芽孢桿菌的腸道定殖與小腸流行性結(jié)腸炎(ERE)的發(fā)生有關(guān)[14]。當(dāng)發(fā)生ERE時(shí)，病兔消化道3個(gè)部位的厚壁菌數(shù)量減少，而胃和盲腸內(nèi)魏氏梭菌數(shù)量增加[15]，且在ERE病兔腸道中分離到梭狀芽胞桿菌[16]。目前，雖然尚無(wú)研究證明兔流行性腹脹病與較早發(fā)生在法國(guó)的ERE屬同一種疾病，但從本研究結(jié)果看，兔流行性腹脹病同樣與魏氏梭菌相關(guān)。作者團(tuán)隊(duì)從LH、JS、FY的上百例病死兔病料中分離到以大腸埃希菌、魏氏梭菌為主的病原菌，認(rèn)為兔流行性腹脹病是以魏氏梭菌和大腸埃希菌單一或混合感染所致的一種細(xì)菌性傳染病，這與學(xué)者們認(rèn)為該病以細(xì)菌為主要病原的觀點(diǎn)相吻合，但與Szalo等[15]認(rèn)為其病原為不可培養(yǎng)的細(xì)菌的觀點(diǎn)不盡相同。本研究中，分離到的細(xì)菌培養(yǎng)物和復(fù)壯毒對(duì)供試兔均具有高致死率，且從發(fā)病的供試兔上能分離到同種致病菌，病變與自然發(fā)病相同，與楊加瓊[16]在小白鼠和試驗(yàn)兔上均能復(fù)制相同病例的結(jié)果相符。

隨著行業(yè)監(jiān)管力度加大，飼料已進(jìn)入全程無(wú)抗化的新階段，但這也加大了畜禽消化道細(xì)菌性疾病的防控難度。篩選、研發(fā)抗生素替代物勢(shì)在必行。以往，大腸埃希菌、魏氏梭菌類細(xì)菌性疾病主要依賴抗生素防治，養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)為了防控疾病，濫用抗生素和化學(xué)藥品，造成耐藥菌株增多、藥物殘留嚴(yán)重等不良影響。LZ是機(jī)體非特異性免疫因子之一，既能抗菌，又能增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力[17-18]，能有效降低發(fā)病率和病死率，且無(wú)毒無(wú)害，近年來(lái)受到越來(lái)越多人的關(guān)注[19]。Epaud等[5]發(fā)現(xiàn)，供給外源性LZ會(huì)增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體對(duì)細(xì)菌的殺滅能力；Oliver等[20]研究表明，LZ與抗生素的使用效果相當(dāng)；May等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LZ在無(wú)抗生素的畜禽飼糧中使用，能夠達(dá)到與抗生素飼糧同樣的促生長(zhǎng)效果。本研究表明，LZ用于兔流行性腹脹病治療時(shí)具有治愈率高、恢復(fù)快的特點(diǎn)，無(wú)毒副作用，經(jīng)口服給藥不會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。更為重要的是，LZ無(wú)殘留，不會(huì)對(duì)下游的食物鏈產(chǎn)生負(fù)面影響，是一種具有完全替代抗生素潛能的綠色飼料添加劑。由于LZ具有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，在各地普及應(yīng)用后，可最大限度地減少養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)的防控成本，使其免遭或挽回部分經(jīng)濟(jì)損失。在疫苗等更為先進(jìn)的防治措施落地前，LZ可作為當(dāng)前防治兔流行性腹脹病的首選藥。