薛 焱， 王同智， 劉欣媛， 高洪波， 薛永志

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古煤炭建設(shè)生態(tài)環(huán)境研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；3.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

蒙藥材阿給為菊科蒿屬植物冷蒿ArtemisiafrigidaWilld.，別名小白蒿、菟毛蒿，是蒙醫(yī)常用藥，全草入蒙藥或中藥，中國(guó)冷蒿集中分布于內(nèi)蒙古地區(qū)[1-2]。近年來(lái)，隨著中藥材標(biāo)準(zhǔn)化工作深入，為提高藥材質(zhì)量和臨床效果，藥材道地性研究越來(lái)越被關(guān)注[3-4]，但對(duì)蒙藥材的道地性研究甚少。蒙藥冷蒿在蒙古族民間有治療出血疾病的史料記載[5]，牧民取其嫩枝，熱水燙后，和玉米面，蒸煮后食用，是一種含有粗蛋白及無(wú)氮浸出物的食物[6]。目前，阿給藥材來(lái)源為野生冷蒿，隨著土地日益荒漠化及藥材大量開(kāi)采，冷蒿草原瀕于退化。對(duì)冷蒿的藥學(xué)研究主要集中于植物藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7]、生藥學(xué)特征[1]、炮制[8]、化學(xué)成分[9-10]及含量測(cè)定[11]等方面的研究，而對(duì)其有效成分的積累規(guī)律研究較少[12]，尤其生態(tài)環(huán)境對(duì)冷蒿有效藥用成分積累的影響未見(jiàn)報(bào)道。為科學(xué)地開(kāi)發(fā)利用冷蒿，本文采集不同生態(tài)環(huán)境的冷蒿作為實(shí)驗(yàn)材料，分析其總黃酮積累與土壤、地理因子的關(guān)系，為地道性冷蒿的采集，提供了科學(xué)的依據(jù)，為冷蒿種質(zhì)資源篩選及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定的理論參考。

1 材料

1.1 藥材和土壤 冷蒿ArtemisiafrigidaWilld.于2017年7月從內(nèi)蒙古5個(gè)地區(qū)采集，選擇株高相同的地上部分及根際土壤，共100批，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥用植物學(xué)教研室鑒定確認(rèn)為正品，具體信息見(jiàn)表1。

表1 冷蒿采集地及所屬生態(tài)環(huán)境

1.2 儀器與試劑 UV-3010紫外分光光度計(jì)(日本日立公司)；BS110S型電子分析天平(德國(guó)Startorius公司)；HH-601數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市亮丹實(shí)驗(yàn)儀器廠)。所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 土壤采集及理化性質(zhì)測(cè)定 有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定采用重鉻酸鉀法，土壤pH測(cè)定采用電位法，水解性氮采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，速效磷(P)測(cè)定采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法，速效鉀(K)測(cè)定采用NH4OAc浸提-火焰光度法。

2.2 冷蒿總黃酮含量測(cè)定 索氏提取法提取冷蒿總黃酮，硝酸鋁-亞硝酸鈉分光光度法測(cè)定含量，其對(duì)照品溶液制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、樣品溶液制備，以及精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12]報(bào)道。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 25.0軟件進(jìn)行處理，對(duì)地理、土壤因子與冷蒿總黃酮含量進(jìn)行簡(jiǎn)單相關(guān)分析，確定簡(jiǎn)單相關(guān)因子，再對(duì)其進(jìn)行偏相關(guān)分析，排除各因子之間的相互干擾，確定影響冷蒿黃酮含量主要因子，然后對(duì)主要因子進(jìn)行通徑分析和回歸分析，計(jì)算影響黃酮含量的主要因子系數(shù)及影響程度。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 土壤理化性質(zhì) 表2顯示，5個(gè)地區(qū)之間土壤理化性質(zhì)均存在顯著差異(P<0.05)，其中除pH外，呼倫貝爾市額爾古納產(chǎn)藥材各項(xiàng)指標(biāo)均高于其他地區(qū)，土壤營(yíng)養(yǎng)豐富；錫林郭勒盟正藍(lán)旗產(chǎn)藥材各項(xiàng)指標(biāo)均低于其他地區(qū)，土壤相對(duì)貧瘠。

表2 各地區(qū)土壤理化性質(zhì)

3.2 總黃酮含量 按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)吸光度在503 nm波長(zhǎng)處敏感，回歸方程在0～96.8 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 4)，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗(yàn)均符合相關(guān)要求。表3、圖1顯示，不同地區(qū)藥材總黃酮含量存在顯著差異(P<0.05)，以烏蘭察布市四子王旗(荒漠草原)和錫林郭勒盟正藍(lán)旗(沙地)較高，錫林郭勒盟錫林浩特市(典型草原)次之，呼倫貝爾市海拉爾區(qū)(草甸草原)、呼倫貝爾市額爾古納(森林草原)較低。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表3 不同地區(qū)冷蒿總黃酮含量比較

3.3 地理、土壤因子與總黃酮含量的簡(jiǎn)單相關(guān)分析 表4顯示，總黃酮含量與年均氣溫、海拔呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與經(jīng)度、緯度、有機(jī)質(zhì)和速效K呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，而與水解性N和速效P無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；年均氣溫與海拔呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與經(jīng)度、緯度、有機(jī)質(zhì)和速效K呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；海拔與經(jīng)度、緯度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；有機(jī)質(zhì)與水解性N呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與速效P呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；速效P和速效K呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。但上述相關(guān)關(guān)系不能真正反映生態(tài)環(huán)境因子對(duì)冷蒿總黃酮含量的影響及各因子之間的相互作用，為排除各因子相互干擾，須進(jìn)行偏相關(guān)分析。

表4 地理、土壤因子與總黃酮含量的簡(jiǎn)單相關(guān)分析結(jié)果

3.4 地理、土壤因子與總黃酮含量的偏相關(guān)分析 在“3.3”項(xiàng)下結(jié)果基礎(chǔ)上，剔除相關(guān)性較差的土壤pH、水解性N、速效P，通過(guò)SPSS 25.0軟件中的Partial分析程序?qū)ζ渌蜃优c總黃酮含量進(jìn)行偏相關(guān)分析。

一階偏相關(guān)分析結(jié)果表明，無(wú)論控制哪幾個(gè)因子，相關(guān)系數(shù)r均大于0.95，年均氣溫與總黃酮含量之間的偏相關(guān)系數(shù)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，呈正相關(guān)性；緯度、速效K與總黃酮含量之間的偏相關(guān)性達(dá)到顯著水平(P<0.05)，呈負(fù)相關(guān)性；海拔、經(jīng)度、有機(jī)質(zhì)對(duì)總黃酮積累無(wú)明顯影響(P>0.05)。

3.5 地理、土壤因子與總黃酮含量的多元回歸分析及通徑分析 將年均氣溫、緯度、速效K作為自變量，分別用X1、X2、X3表示；總黃酮含量作為因變量，用Y表示，進(jìn)行多元回歸分析，得方程為Y=6.067+0.625X1-0.461X2-0.324X3，P=0.000 31，可知年均氣溫與總黃酮含量存在正相關(guān)關(guān)系，前者每增加1個(gè)單位，后者平均增加0.625；緯度與總黃酮含量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，前者每增加1個(gè)單位，后者平均降低0.461；速效K與總黃酮含量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，前者每增加1個(gè)單位，后者平均降低0.324。

由通徑分析可知，年均氣溫、緯度、速效K對(duì)總黃酮含量直接影響作用的通徑系數(shù)分別為r1y=0.734，r2y=-0.242，r3y=-0.255。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，上述3個(gè)因素通徑系數(shù)的顯著性均小于0.05，即對(duì)總黃酮含量均有顯著影響。圖2顯示，年均氣溫對(duì)總黃酮積累的影響是正向的；緯度、速效K對(duì)總黃酮積累的影響是負(fù)向的；緯度對(duì)年均氣溫、速效K也存在負(fù)向影響。這符合內(nèi)蒙古緯度越高，年均氣溫越低的基本事實(shí)，并且也可解釋為緯度通過(guò)影響年均氣溫來(lái)影響總黃酮含量，緯度與速效K分布呈負(fù)相關(guān)現(xiàn)象，即內(nèi)蒙古高緯度高地區(qū)速效K含量偏低。

圖2 年均氣溫(X1)、緯度(X2)、速效K(X3)對(duì)總黃酮含量(Y)的通徑分析

4 討論

4.1 冷蒿總黃酮積累與土壤營(yíng)養(yǎng) 冷蒿總黃酮含量并未隨土壤肥力的增高而增加(圖1、表4)，土壤營(yíng)養(yǎng)豐富的額爾古納地區(qū)冷蒿總黃酮含量并不是最高的，反而內(nèi)蒙古西部的四子王旗含量卻是最高的，這說(shuō)明土壤貧瘠的內(nèi)蒙古西部草原可能是藥用冷蒿的最佳產(chǎn)地。2004年，Yan等[13]研究表明藥用品質(zhì)較高的野生紅景天分布于土壤速效P較為缺乏的地區(qū)，這與本研究有相同之處。但與盧麗蘭[14]研究認(rèn)為土壤營(yíng)養(yǎng)越好對(duì)藥材廣藿香藥用成分積累越有利正好相反，分析其原因可能是因?yàn)楸R麗蘭的研究是基于室內(nèi)控制實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同水肥條件情況下，施肥對(duì)藥用成分的影響，而本研究是基于自然環(huán)境下，天然冷蒿的藥用成分與土壤營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系。由此可見(jiàn)，水、肥、溫度均有利的室內(nèi)控制實(shí)驗(yàn)與自然條件下藥用植物的有效成分的積累機(jī)制是有區(qū)別的，也有可能是廣藿香與冷蒿的物種差異造成的，究竟是何原因造成高總黃酮含量的冷蒿分布于相對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏的四子王旗草原，還需要下一步采取異地移植栽培實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)一步研究。

土壤中速效K對(duì)冷蒿總黃酮含量積累有負(fù)向作用(圖2)，岳聰慧等[15]研究也表明不同栽培區(qū)土壤中磷、鉀以及有機(jī)質(zhì)不同，附子品種間雙酯型生物堿以及總堿含量差異明顯。內(nèi)蒙古地區(qū)鉀元素分布是由西到東鉀元素含量逐漸遞減，冷蒿總黃酮含量逆鉀元素分布梯度分布[16]，實(shí)驗(yàn)分析結(jié)論與自然背景數(shù)據(jù)是吻合的，間接印證了冷蒿總黃酮積累對(duì)鉀元素是敏感的，需要在以后的研究中進(jìn)行精準(zhǔn)室內(nèi)試驗(yàn)加以進(jìn)一步驗(yàn)證。

4.2 高品質(zhì)冷蒿藥材的最佳分布地 通徑分析圖2可知，年均溫度對(duì)冷蒿總黃酮的積累貢獻(xiàn)最大，四子王旗恰恰是緯度最低、年均溫度最高的地區(qū)，冷蒿能夠適應(yīng)該地區(qū)貧瘠土壤，并在溫度較高的溫帶四子王旗草原完成藥用成分的積累，其合成和積累不僅與植物的基因型有關(guān)，與生態(tài)環(huán)境和土壤也有著密不可分的聯(lián)系，生態(tài)環(huán)境條件變化將引起次生代謝產(chǎn)物含量的變化[16-20]。不同生長(zhǎng)環(huán)境經(jīng)緯度、光照的強(qiáng)度、溫度、空氣濕度等生態(tài)因子不同對(duì)藥用成分含量的累積影響較大[21]。已有的研究顯示黃花蒿[21]、黃芩[22]和紫蘇籽[23]中多數(shù)次生代謝產(chǎn)物與緯度成負(fù)相關(guān)，而與溫度成正相關(guān)等現(xiàn)象，本研究也顯示冷蒿總黃酮含量與緯度成負(fù)相關(guān)，而與年均氣溫成正相關(guān)，這些研究都表明藥用植物有效成分對(duì)于能量的需求是趨同性，陽(yáng)光充足、溫度較高的低緯度地區(qū)對(duì)有效成分積累有積極作用。高緯度環(huán)境不利于冷蒿總黃酮的積累，緯度越高，太陽(yáng)高度角越低，太陽(yáng)的輻射能量越低，冷蒿種群接受的光、熱越少[24]，冷蒿次生代謝物的總黃酮合成越少，年均氣溫對(duì)冷蒿總黃酮含量影響也有類(lèi)似之處。綜上所述，冷蒿的適宜生態(tài)環(huán)境為年均氣溫高、緯度低和速效K含量低的荒漠草原(烏蘭察布市四子王旗)。