王風(fēng)云， 李偉宏

(河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450042)

黃芩素是黃芩的主要成分之一，具有降血壓、保肝利膽、中樞神經(jīng)保護等活性[1-3]，并且在乳腺癌、卵巢癌等婦科腫瘤方面的作用也得到廣大醫(yī)藥工作者的重視[4-6]，有開發(fā)成抗腫瘤新藥的潛力，但該成分水溶性、脂溶性均較差，導(dǎo)致其體外溶出、體內(nèi)吸收受限[7]，從而限制抗腫瘤等藥效的發(fā)揮。因此，提高黃芩素體外溶出、體內(nèi)吸收程度是相關(guān)制劑開發(fā)面臨的主要問題。

藥物-磷脂復(fù)合物技術(shù)[8-10]可通過提高藥物脂溶性及水溶性來提高其生物利用度，課題組前期制備了黃芩素磷脂復(fù)合物[11]，但由于它黏性較大，并不能有效解決藥物體外溶出問題[11-12]，促吸收作用也未能充分發(fā)揮。白蛋白納米粒是采用水溶性白蛋白作為納米載體而制備的固態(tài)膠體藥物釋放體系，其極大比表面積可提高藥物分散性，從而促進藥物溶出及體內(nèi)吸收[13-14]，故本實驗選擇牛血清白蛋白(BSA)作為載體，采用高壓均質(zhì)法將黃芩素磷脂復(fù)合物制成白蛋白納米粒，并進行體內(nèi)藥動學(xué)研究，以期為相關(guān)新型抗腫瘤制劑開發(fā)提供新策略。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；RH-1200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(艾卡儀器設(shè)備有限公司)；RCY-1400T型智能溶出試驗儀(歐萊博技術(shù)有限公司)；D-3L型高壓均質(zhì)機(美國PhD Technology公司)；Nano ZS90型納米粒度儀(英國Malvern公司)；DZF-60900型真空干燥箱(上海目尼實驗設(shè)備有限公司)；SJIA-10N-50型冷凍干燥機(寧波市雙嘉儀器有限公司)；QT-2A型旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；NAI-DCY-12YD型氮氣吹掃儀(上海那艾精密儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 黃芩素(批號111595-102605，純度97.2%)、黃芩苷(批號110715-201812，純度95.4%)對照品(中國食品藥品檢定研究院)；黃芩素原料藥(批號S190201，純度97.8%，陜西阿卡索生物科技公司)；磷脂(批號200601，磷脂酰膽堿純度98%，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司)；牛血清白蛋白(批號20200525，白蛋白純度≥98%，藍季生物科技公司)。

1.3 動物 清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(280±20)g，由河南省動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(豫)2016-0001，實驗前禁食12 h。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩素含量測定

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相甲醇-水(含0.1%磷酸)(65∶35)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長275 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 取白蛋白納米?；鞈乙?.0 mL至100 mL量瓶中，加70 mL甲醇超聲處理2 min，“2.1.1”項下流動相定容至刻度，10 000 r/min離心15 min，取上清液，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察 精密稱取黃芩素對照品20.0 mg至50 mL量瓶中，加30 mL甲醇超聲處理2 min溶解，甲醇定容至刻度，即得400 μg/mL貯備液，流動相稀釋至50.0、25.0、10.0、1.0、0.5、0.05 μg/mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以黃芩素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行回歸，得方程為Y=16.087 2X+0.587 9(r=0.999 9)，在0.05～50.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得黃芩素峰面積RSD為1.62%，表明該方法重復(fù)性良好。取0.05、10.0、50.0 μg/mL對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定3次，測得黃芩素峰面積RSD為0.61%，表明儀器精密度良好。取供試品溶液，于0、3、6、12、18、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得黃芩素峰面積RSD為0.44%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取9份供試品溶液，每份1.0 mL，置于100 mL量瓶中，分為3組，分別加入貯備液1.5、2.5、4.0 mL，每組3份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得平均加樣回收率分別為100.63%、99.26%、99.85%，RSD分別為1.02%、0.65%、1.25%。

2.2 磷脂復(fù)合物制備 參考文獻[12]報道，稱取黃芩素100 mg、磷脂280 mg(摩爾比1∶1)，加入50 mL重蒸四氫呋喃，在45 ℃、1 000 r/min下恒溫恒速攪拌3.0 h至溶液澄清，減壓旋蒸除去四氫呋喃，加入30 mL正己烷(黃芩素在其中幾乎不溶)，振蕩溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾除去未參加復(fù)合的游離藥物，減壓旋蒸除去正己烷，即得。

2.3 白蛋白納米粒制備工藝 參考文獻[15]報道，取“2.2”項下磷脂復(fù)合物0.1 g，加3 mL無水乙醇溶解，作為有機相；將牛血清白蛋白粉末溶于25 mL蒸餾水中，作為水相，在1 000 r/min下將有機相滴加到水相中，滴畢后超聲(功率150 W、頻率45 kHz)處理5 min，在55 ℃下減壓濃縮25 min，立即循環(huán)均質(zhì)數(shù)次，即得，加蒸餾水至25 mL。

2.4 包封率、載藥量測定 取1 mL白蛋白納米?；鞈乙褐脸瑸V離心管(20 kDa)中，置于0 ℃離心機中，在10 000 r/min下離心15 min，取濾液，測定游離藥量(m游離)；取1 mL至100 mL量瓶中，加70 mL甲醇超聲處理5 min，流動相定容至刻度，取適量在10 000 r/min下離心15 min，取上清液，測定總藥量(m總)，計算包封率、載藥量，公式分別為包封率=[(m總-m游離)/m總]×100%、載藥量=[(m總-m游離)/m總質(zhì)量]×100%(m總質(zhì)量表示白蛋白納米粒總質(zhì)量)。

2.5 單因素試驗

2.5.1 白蛋白與磷脂復(fù)合物比例 固定磷脂復(fù)合物用量為0.1 g、均質(zhì)壓力為80 MPa，均質(zhì)次數(shù)為10次，考察白蛋白與磷脂復(fù)合物比例0∶1(即不加白蛋白)、10∶1、11.25∶1、12.5∶1、13.75∶1、15∶1對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響，結(jié)果見表1。由此可知，不加白蛋白時磷脂復(fù)合物為混懸狀態(tài)，可能是部分磷脂復(fù)合物發(fā)生解離，藥物析出所致，也與磷脂復(fù)合物疏水性強、黏性大有關(guān)；加入白蛋白后，磷脂復(fù)合物可形成帶乳光的納米?；鞈乙?，主要影響包封率、載藥量，而對粒徑、Zeta電位無明顯影響。由于白蛋白與磷脂復(fù)合物比例超過13.75∶1時包封率升高不明顯，載藥量下降明顯，故選擇12.5∶1作進一步考察。

表1 白蛋白與磷脂復(fù)合物比例對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響(n=3)

2.5.2 均質(zhì)壓力 固定磷脂復(fù)合物用量為0.1 g，白蛋白與磷脂復(fù)合物用量比例為12.5∶1，均質(zhì)次數(shù)為10次，考察均質(zhì)壓力60、70、80、90、100 MPa對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響，結(jié)果見表2。由此可知，均質(zhì)壓力小于90 MPa時對包封率、載藥量影響不大，在100 MPa時兩者有所降低；均質(zhì)壓力對粒徑影響較大，隨著前者增加后者逐漸降低后又有所升高，綜合考慮，選擇90 MPa作進一步考察。

表2 均質(zhì)壓力對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響(n=3)

2.5.3 均質(zhì)次數(shù) 固定磷脂復(fù)合物用量為0.1 g，白蛋白與磷脂復(fù)合物用量比例為12.5∶1，均質(zhì)壓力為90 MPa，考察均質(zhì)次數(shù)6、8、10、12次對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響，結(jié)果見表3。由此可知，均質(zhì)次數(shù)為12次時，包封率、載藥量、Zeta電位絕對值降低，綜合考慮，選擇10次作進一步考察。

表3 均質(zhì)次數(shù)對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響(n=3)

2.6 指標(biāo)測定 平行制備6批白蛋白納米?；鞈乙?，測得其平均包封率為83.19%，載藥量為1.53%，粒徑為177.62 nm，Zeta電位為-33.79 mV，見圖1～2。

圖1 白蛋白納米粒粒徑分布

圖2 白蛋白納米粒Zeta電位

2.7 凍干粉制備 將白蛋白納米粒混懸液分裝至若干西林瓶中，在-65 ℃下預(yù)凍2 d，設(shè)置冷凍干燥機溫度為-30 ℃，放入預(yù)凍好的樣品后抽真空，冷凍干燥3 d后置于干燥器中，在室溫下保存，即得(以黃芩素計，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.87%)。凍干粉復(fù)溶后，平均包封率為78.32%，載藥量為1.39%，粒徑為205.55 nm，Zeta電位為-30.07 mV，見圖3～4。

圖3 凍干粉復(fù)溶后粒徑分布

圖4 凍干粉復(fù)溶后Zeta電位

2.8 體外釋藥研究 取黃芩素、磷脂復(fù)合物及其白蛋白納米粒凍干粉末適量(以黃芩素計，含量為15.0 mg)，加入2 mL空白溶出介質(zhì)制備混懸液，置于活化后的透析袋中(截留分子量8 000～14 000 Da)，兩端扎緊，以900 mL 1.0%SDS溶液作為釋放介質(zhì)，設(shè)置溶出儀溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，于0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、36 h各取樣3 mL，并保持總體積不變，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算累積溶出度，繪制體外釋藥曲線，見圖5。由此可知，原料藥最大溶出度為33.68%，制成磷脂復(fù)合物后雖然有所提高，但最高也只有43.83%；白蛋白納米粒各時間點累積溶出度均明顯高于原料藥及其磷脂復(fù)合物，36 h內(nèi)累積溶出度達72.43%。

圖5 黃芩素體外釋藥曲線(n=6)

2.9 藥動學(xué)研究

2.9.1 血漿樣品處理 參考文獻[7]報道，取血漿樣品200 μL，依次加入20 μL水(含0.1%磷酸)、500 μL甲醇，渦旋5 min后6 000 r/min離心10 min，取上清液，氮氣吹干，殘渣中加入200 μL甲醇復(fù)溶，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。

2.9.2 血漿對照品溶液制備及線性關(guān)系考察 精密稱取10.0 mg黃芩苷對照品，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，甲醇超聲溶解后定容至刻度，取適量，甲醇依次稀釋至30.0、15.0、10.0、5.0、1.0、0.1 μg/mL，各精密量取100 μL，40 ℃氮氣緩慢吹干，加入100 μL空白血漿復(fù)溶，即得，按“2.9.1”項下方法處理，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以黃芩素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行回歸，得方程為Y=0.100 8X+0.152 7(r=0.994 5)，在0.1～30.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.9.3 方法學(xué)考察 取空白血漿、血漿對照品、血漿樣品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖6，可知血漿內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，方法專屬性良好。取按“2.9.1”項下方法處理后的血漿樣品，于0、3、6、12、18、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得黃芩素峰面積RSD為1.73%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取低、中、高(1.0、10.0、30 μg/mL)質(zhì)量濃度血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得黃芩素峰面積RSD分別為6.37%、5.08%、3.15%，表明該方法日內(nèi)精密度良好；連續(xù)測定6 d，每天1次，測得其峰面積RSD分別為10.23%、7.38%、5.06%，表明該方法日間精密度良好。取低、中、高(0.3、7.5、30 μg/mL)質(zhì)量濃度血漿對照品溶液，按“2.9.1”項下方法處理，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，以檢出質(zhì)量濃度與實際質(zhì)量濃度的比值為方法回收率，測得其數(shù)值分別為90.55%、93.11%、96.84%，RSD分別為4.87%、3.96%、7.34%。

1.黃芩苷

2.9.4 分組、給藥及采血 18只大鼠(已禁食約12 h)隨機分為3組，每組6只，采用0.5%CMC-Na溶液配制黃芩素、磷脂復(fù)合物、白蛋白納米粒灌胃液，劑量以黃芩素計均為100 mg/kg。大鼠灌胃給藥后，于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、18、24 h眼眶取血各約0.3 mL，置于肝素浸潤后的離心管中，振蕩5 s后立即離心2 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min)，血漿保存于-10 ℃冰箱中，處理前在室溫下解凍。

2.9.5 藥動學(xué)研究 圖7、表4顯示，與原料藥比較，磷脂復(fù)合物、白蛋白納米粒Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.05，P<0.01)，以后者更明顯(P<0.01)，但Tmax均無明顯變化(P>0.05)，相對生物利用度分別增加至1.67、2.58倍。

表4 黃芩素主要藥動學(xué)參數(shù)

圖7 黃芩素血藥濃度-時間曲線(n=6)

3 討論

本實驗引入白蛋白納米粒技術(shù)后，可有效解決黃芩素磷脂復(fù)合物分散性差、溶出度低等缺陷[15-16]，為提高生物利用度及藥效奠定了基礎(chǔ)[17-18]。白蛋白納米粒包封率、載藥量均低于磷脂復(fù)合物，可能是由于后者提高了黃芩素溶解度，有利于白蛋白包裹藥物[19]；粒徑也更小，可能是由于磷脂的乳化作用所致[13,15]。按照最優(yōu)處方工藝制備的空白白蛋白納米粒(不加磷脂復(fù)合物)是略帶藍色乳光的混懸液，而黃芩素磷脂復(fù)合物在相似條件下呈現(xiàn)混懸狀態(tài)，甚至出現(xiàn)沉淀，推測磷脂復(fù)合物可能以嵌入方式進入白蛋白載體[19]而最終形成納米粒，而非后者吸附在前者上。

磷脂復(fù)合物提高黃芩素口服生物利用度的原因可能與它可改善藥物水溶性及脂溶性[12]，在一定程度上提高了其溶出度有關(guān)，但目前仍無法確定該劑型在血液循環(huán)中是否仍以復(fù)合物的整體狀態(tài)存在[20]。與磷脂復(fù)合物比較，白蛋白納米?？蛇M一步提高黃芩素吸收程度，可能是由于它改善了磷脂復(fù)合物分散性差、疏水性強的缺點，促進了藥物釋放，但藥物從白蛋白納米粒中是以磷脂復(fù)合物形式釋放還是以游離形式釋放尚不明確，需作進一步研究。