王小明，蔣婷奇，譚躍浪，方 蕾

（1.浙江巨泰藥業(yè)有限公司，浙江 衢州 32400；2.普洛藥業(yè)股份有限公司，浙江金華 322199）

阿莫西林是一種β-內(nèi)酰胺類的青霉素類抗菌素，臨床上廣泛使用?？芍委煻喾N細(xì)菌感染引起的疾病，包括喉炎、肺炎、皮膚感染、泌尿道感染等[1]。我國(guó)有207 個(gè)阿莫西林膠囊批準(zhǔn)文號(hào)。某公司產(chǎn)品自獲批以來(lái)，一直執(zhí)行《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)[2]。根據(jù)《國(guó)務(wù)院辦公廳關(guān)于開(kāi)展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的意見(jiàn)》（國(guó)辦發(fā)〔2016〕8 號(hào)）要求，進(jìn)行阿莫西林膠囊一致性評(píng)價(jià)質(zhì)量研究[3]。以2015 年版《中國(guó)藥典》（二部）（ChP2015）收載質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，參考美國(guó)藥典40 版（USP40）、《日本藥典（17版）》（JP17）、《英國(guó)藥典2017 版》（BP2017）等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)有關(guān)物質(zhì)的分析方法進(jìn)行優(yōu)化[4-6]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀 器

Agilent 1260 高效液相色譜儀，包括Agilent VWD、Agilent Openlab CDS 工作站；XS 105 電子天平，精度1/105；XPE26電子天平，精度1/106。

1.2 試 劑

實(shí)驗(yàn)所用對(duì)照品請(qǐng)見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)品對(duì)照Tab 1 List of reference substances

阿莫西林膠囊，自制產(chǎn)品，批號(hào)分別為Q02171201、 Q02171202、 Q02171203， 規(guī) 格 為0.25 g；參比制劑：持證商為Beecham Group plc，批號(hào)2368，規(guī)格為0.25 g。

磷酸二氫鉀、氫氧化鉀，分析純；甲醇，色譜純；水，超純。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法篩選

阿莫西林膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在《中國(guó)藥典》2015 年版（二部）（ChP2015）、美國(guó)藥典40 版（USP40）、《日本 藥 典（17 版）》（JP17）、《英 國(guó) 藥 典2017 版》（BP2017）均有收載，其中USP40中只收載了阿莫西林有關(guān)物質(zhì)，膠囊未收載有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)；BP 阿莫西林原料和膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均包含有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)，檢測(cè)方法基本相同；EP 收載了阿莫西林原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，與BP標(biāo)準(zhǔn)基本一致。

2.1.1 不同有關(guān)物質(zhì)方法比較

分別配制雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)I、雜質(zhì)J、雜質(zhì)L溶液及阿莫西林與以上各雜質(zhì)的混合溶液作為系統(tǒng)適用性溶液，使用ChP2015、EP9.0 及USP40 有關(guān)物質(zhì)方法分別進(jìn)樣，色譜見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 《中國(guó)藥典》系統(tǒng)適用性溶液色譜Fig 1 Applicable solution chromatogram of Chinese Pharmacopoeia system

圖2 EP系統(tǒng)適用性溶液色譜Fig 2 Applicable solution chromatogram of EP system

由圖1～圖3 可知，《中國(guó)藥典》及EP 雜質(zhì)F均為負(fù)峰，且雜質(zhì)D、雜質(zhì)E 及雜質(zhì)J 均有未檢出情況，USP 各雜質(zhì)均能檢出并且能夠有效分離?！吨袊?guó)藥典》及EP 的檢測(cè)波長(zhǎng)均為254 nm，該波長(zhǎng)為阿莫西林的最低吸收波長(zhǎng)，不利于有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。

圖3 USP系統(tǒng)適用性溶液色譜Fig 3 Applicable solution chromatogram of USP system

綜上所述，選擇USP 有關(guān)物質(zhì)分析方法為本品的有關(guān)物質(zhì)分析方法。

2.1.2 色譜柱選擇

采用不同廠家的色譜柱，以USP有關(guān)物質(zhì)分析方法對(duì)系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)行考察，Ultimeate AQC18 4.6 mm×100 mm，5 μm色譜柱，雜質(zhì)A與雜質(zhì)B重合；Spursil C18 4.6 mm×100 mm，5 μm色譜柱，雜質(zhì)A 與雜質(zhì)B 分離不佳，雜質(zhì)E2 與雜質(zhì)C 重合；Pack ODS-AQ 4.6 mm×100 mm，5 μm 色譜柱，雜質(zhì)A 與主峰重合；ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm色譜柱，各雜質(zhì)分離良好，見(jiàn)圖4。

圖4 ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm系統(tǒng)適用性溶液色譜Fig 4 Applicable solution chromatogram of Thermo(ODS HYPERSIL 4.6×100 mm,5 μm)system

故使用色譜柱ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.3 3批樣品檢測(cè)結(jié)果比較

對(duì)工藝驗(yàn)證3 批樣品使用變更前《中國(guó)藥典》、變更后的有關(guān)物質(zhì)方法分別進(jìn)行檢測(cè)，考察雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)及雜質(zhì)檢出量，變更后方法在雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)上優(yōu)于變更前的方法，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 阿莫西林膠囊有關(guān)物質(zhì)分析方法變更前后比較Tab 2 Comparison before and after the change of analytical methods for related substances in amoxicillin capsules

2.2 分析方法的驗(yàn)證

待驗(yàn)證的方法為：取樣品適量，精密稱量，加流動(dòng)相A 溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含阿莫西林（按C16H19N3O5S計(jì)）1.25 mg的溶液，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另取阿莫西林對(duì)照品適量，精密稱量，加流動(dòng)相A溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含阿莫西林（按C16H19N3O5S計(jì)）12.5 μg的溶液，作為對(duì)照溶液。照高效液相色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0512）測(cè)定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm）；以2.72 g/L磷酸二氫鉀溶液（以1 mol/L的氫氧化鉀或質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%磷酸調(diào)節(jié)pH 至5.0）為流動(dòng)相A；甲醇為流動(dòng)相B；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；體積流量1.5 mL/min；柱溫40 ℃，樣品溫度4 ℃。按表3線性梯度洗脫。

表3 梯度洗脫程序Tab 3 Table of gradient elution procedures

精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜，供試品溶液中如有雜質(zhì)峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，雜質(zhì)A（相對(duì)保留時(shí)間為0.78）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得大于0.5%，其他單個(gè)雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得大于1.0%，總雜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得大于5.0%，供試品溶液色譜中小于對(duì)照溶液主峰面積0.03倍的峰忽略不計(jì)。

參照文獻(xiàn)[7]等，對(duì)本樣品的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

2.2.1 系統(tǒng)適用性及儀器精密度

取系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算保留時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，雜質(zhì)與雜質(zhì)、雜質(zhì)與主峰之間分離度均≥1.5，6 針保留時(shí)間RSD≤1.0%，主峰、雜質(zhì)峰面積的RSD分別≤2.0%、≤5.0%。表明該方法系統(tǒng)的影響及儀器精密度良好。

2.2.2 濾膜吸附

將系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液用0.45 μm的水相膜過(guò)濾。分別棄去不同初濾液進(jìn)樣，與未過(guò)濾或離心樣品進(jìn)行峰面積的比較，記錄色譜。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液濾膜均無(wú)吸附。

2.2.3 專屬性

分別進(jìn)樣雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)I、雜質(zhì)J、雜質(zhì)L、雜質(zhì)M、阿莫西林、阿莫西林與各雜質(zhì)混合溶液、空白溶劑、空白輔料，記錄色譜。結(jié)果表明，各雜質(zhì)及阿莫西林單獨(dú)進(jìn)樣與混合進(jìn)樣保留時(shí)間一致，空白溶劑及空白輔料無(wú)干擾。

2.2.4 定量限

精密稱取各雜質(zhì)對(duì)照品及阿莫西林對(duì)照品適量，用稀釋劑依次稀釋進(jìn)樣，直至信噪比（S/N）至10～20，作為定量限溶液。再平行配制6 份定量限含量溶液，進(jìn)樣，計(jì)算精密度。定量限的質(zhì)量濃度ρ和相當(dāng)于樣品的質(zhì)量濃度的分?jǐn)?shù)w如表4所示。

表4 定量限結(jié)果匯總Tab 4 Summary of limits of quantitation results

由表4可知，各雜質(zhì)及阿莫西林保留時(shí)間精密度RSD符合規(guī)定。

2.2.5 檢測(cè)限

精密移取定量限含量溶液3 mL 置10 mL 容量瓶中，加稀釋劑至刻度，搖勻，配制成檢測(cè)限溶液，進(jìn)樣，檢測(cè)結(jié)果如表5。

表5 檢測(cè)限結(jié)果匯總Tab 5 Summary of detection limit results

2.2.6 線性與范圍

以阿莫西林對(duì)照品及各雜質(zhì)對(duì)照品分別配制對(duì)照含量的30%、50%、80%、100%、120%及雜質(zhì)含量限的溶液分別進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，響應(yīng)因子為縱坐標(biāo)，以定量限濃度到120%含量進(jìn)行線性回歸計(jì)算，r≥0.990、響應(yīng)因子RSD≤10%、y0/y100≤25%（y為縱軸，y0/y100表示在y軸上的截距），并計(jì)算校正因子。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 線性與范圍結(jié)果Tab 6 Summary of linear and range results

由表6可知，各雜質(zhì)及阿莫西林在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)與峰面積均呈顯著線性關(guān)系。

2.2.7 準(zhǔn)確度

采用加樣回收。配制供試品含量的樣品溶液，分別加入雜質(zhì)含量限度的50%、100%、120%的雜質(zhì)溶液，每個(gè)含量平行配制3 份，分別計(jì)算9份樣品的回收率并計(jì)算平均回收率及RSD。結(jié)果表明，各雜質(zhì)回收率均在92%～105%，RSD≤2%。

2.2.8 精密度、重復(fù)性

配制對(duì)照品溶液1份，供試品溶液6份分別進(jìn)樣，計(jì)算6份供試品的雜質(zhì)質(zhì)量。結(jié)果表明，重復(fù)性各樣品雜質(zhì)個(gè)數(shù)與雜質(zhì)質(zhì)量無(wú)明顯差異，即重復(fù)性良好。

2.2.9 溶液穩(wěn)定性

精密稱取阿莫西林對(duì)照品、樣品約14.5、29 mg，置20 mL 量瓶中，用稀釋劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，4 ℃放置，分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 進(jìn)樣，考察主成分峰面積的變化情況。結(jié)果表明：對(duì)照品溶液在4 ℃條件下，8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 耐用性

取對(duì)照品溶液及供試品溶液，適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)柱溫、流動(dòng)相A 的pH 及不同色譜柱，考察色譜條件變化后的有關(guān)物質(zhì)結(jié)果情況。結(jié)果表明。通過(guò)考察柱溫（±2 ℃）、流動(dòng)相A 的pH（4.98～5.10）、色譜柱的改變，供試品雜質(zhì)個(gè)數(shù)與雜質(zhì)量均無(wú)明顯差異，本法耐用性良好。

3 結(jié) 論

1）通過(guò)對(duì)不同國(guó)家藥典中阿莫西林膠囊有關(guān)物質(zhì)方法進(jìn)行對(duì)比研究，《中國(guó)藥典》及EP雜質(zhì)F均為負(fù)峰且雜質(zhì)D、雜質(zhì)E 及雜質(zhì)J 均有未檢出情況，USP各雜質(zhì)均能檢出并且能夠有效分離?！吨袊?guó)藥典》及EP的檢測(cè)波長(zhǎng)均為254 nm，該波長(zhǎng)為阿莫西林的最低吸收波長(zhǎng)，不利于有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。故參照USP 阿莫西林原料有關(guān)物質(zhì)方法建立本產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法。

2）通過(guò)對(duì)不同批號(hào)色譜柱的考察，將色譜柱廠家及型號(hào)規(guī)格訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（色譜柱為ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm）。

3）進(jìn)行系統(tǒng)適用性與儀器精密度、濾膜吸附、專屬性、定量限、檢測(cè)限、線性與范圍、準(zhǔn)確度、精密度、溶液穩(wěn)定性、耐用性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均符合要求，表明本研究中建立的方法準(zhǔn)確、真實(shí)，對(duì)本品雜質(zhì)能更有效分離。新建方法每針運(yùn)行時(shí)間為31 min，比ChP2015少24 min，且流動(dòng)相組成中有機(jī)相比例更低，對(duì)阿莫西林膠囊有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法提供借鑒。