魯成昊,張成鑫,郭志祥,葛圣林
冠心病是發(fā)病率、致殘率、死亡率均較高的心血管疾病[1]。冠脈血運(yùn)重建技術(shù)可及時(shí)恢復(fù)患者心肌血流灌注,減輕缺血所致的損傷及壞死。但是心肌缺血再灌注后將導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,引發(fā)心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reper-fusion,MI/R),進(jìn)而導(dǎo)致室性心動(dòng)過(guò)速、心室顫動(dòng)等并發(fā)癥,是導(dǎo)致缺血再灌注期間患者猝死的重要原因[2]。因此,尋找安全、有效地減輕MI/R的治療方式,對(duì)于改善冠心病患者預(yù)后意義重大。曲美他嗪是一種代謝調(diào)節(jié)劑,可降低血管阻力、抗缺血及保護(hù)心肌細(xì)胞,喬銳等[3]認(rèn)為其對(duì)缺血再灌注大鼠離體心臟具有保護(hù)作用。此外,也有國(guó)外學(xué)者將替莫唑胺用于心絞痛的治療,提示其在治療心臟系統(tǒng)疾病方面的作用[4]。然而,目前關(guān)于曲美他嗪對(duì)MI/R的干預(yù)作用研究較少,且機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)建立MI/R大鼠模型,觀察曲美他嗪對(duì)其治療作用,并分析可能機(jī)制,為臨床提供參考。
1.1 材料選取50只SD雄性大鼠,6周齡,體重(200±20)g,購(gòu)自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0002。鹽酸曲美他嗪片購(gòu)自北京萬(wàn)生藥業(yè)有限責(zé)任公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20065167;Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)信號(hào)通路抑制劑AG490購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express公司;Tunel細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海臻諾生物科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司;HE染色試劑盒購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司;兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。儀器AU 5800全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司;Synergy-HD顯微鏡購(gòu)自日本東芝株式會(huì)社;TY-80B電泳儀購(gòu)自南京普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所;WD-9413D型一體式凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.1建立MI/R模型大鼠2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,氣管插管,與呼吸機(jī)連接,左側(cè)第3至4肋間切口,開(kāi)胸暴露心臟,在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間的左心耳根部下行2 mm位置進(jìn)帶線縫合針,結(jié)扎左前降支與少量心肌組織,血管鉗將胸腔夾緊、閉合。缺血30 min,再灌注120 min,建立MI/R模型[5]。建模成功標(biāo)志:心電圖顯示ST段提高,缺血30 min,再灌注120 min恢復(fù)冠脈血流后,抬高的ST段下降>1/2。
1.2.2分組及干預(yù)方式40只大鼠中隨機(jī)抽取10只僅開(kāi)胸后縫合,不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈,為對(duì)照組。其余30只建立MI/R模型,隨機(jī)分為MI/R組、曲美他嗪組、曲美他嗪+AG490組,建模均成功,每組10只。曲美他嗪組在缺血30 min時(shí)尾靜脈注射曲美他嗪葡萄糖溶液,劑量2 mg·kg-1,再灌注120 min;曲美他嗪+AG490組在缺血30 min時(shí)尾靜脈注射曲美他嗪葡萄糖溶液,劑量2 mg·kg-1,并腹腔注射AG490 DMSO溶液,劑量5 mg·kg-1,再灌注120 min;對(duì)照組、MI/R組尾靜脈注射等體積葡萄糖溶液,腹腔注射等體積DMSO溶液[6]。均為一次性給藥。
1.2.3組織取材再灌注120 min后脫頸處死大鼠,分離心臟,等滲鹽水沖洗干凈,去除脂肪及心房組織,將左心室心肌組織分成兩份,一份冷凍保存用于氧化應(yīng)激指標(biāo)及蛋白檢測(cè);一份采用4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、包埋,以病理切片機(jī)制作成5 μm連續(xù)切片,
1.2.4氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)取冷凍心肌組織,充分研磨勻漿后,離心取上清。采用硫代巴比妥法檢測(cè)MDA含量,黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD含量[7]。嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程。
1.2.5Tunel染色法檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡率取心肌組織切片,加入Tunel反應(yīng)混合液,37 ℃濕盒中孵育60 s,PBS沖洗,加入POD轉(zhuǎn)化劑,同條件孵育30 s,PBS沖洗,DAB法顯色,室溫孵育3 s,PBS沖洗,蘇木精復(fù)染,脫水,干燥,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況[8]。細(xì)胞核被染為棕色、棕黑色為陽(yáng)性,凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。每張切片任選5個(gè)不相鄰視野計(jì)數(shù),求均值。
1.2.6HE染色法觀察心肌組織病理學(xué)變化取心肌組織切片,沖洗60 s,蘇木精染液染色5 min,沖洗,滴入1%鹽酸酒精,沖洗2 s,促藍(lán)液反藍(lán),沖洗15 s,1%伊紅染液染色30 s,自來(lái)水略洗,使用梯度乙醇脫水,二甲苯透明2次,每次3 s,中性樹(shù)膠封固,顯微鏡下觀察病理變化[9]。
1.2.7免疫印跡法檢測(cè)心肌組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)量取冷凍保存的心肌組織,RIPA裂解液裂解,離心取上清,BCA試劑盒定量蛋白濃度。取30 μg待測(cè)樣本上樣,沸水浴5 min,恒壓下經(jīng)10% SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)至膜,室溫下封閉液封閉2 h,加入兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3一抗(1 ∶ 500),4 ℃搖床孵育過(guò)夜,洗滌,加入山羊抗兔二抗(1 ∶ 2000),室溫孵育1 h,暗室中光、顯影、定影,凝膠成像系統(tǒng)掃描,目的蛋白表達(dá)量以其條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值表示[10]。
2.1 心肌組織MDA、SOD含量與對(duì)照組、曲美他嗪組比較,MI/R組心肌組織MDA含量升高,SOD含量降低(P<0.05);與曲美他嗪組比較,曲美他嗪+AG490組心肌組織MDA含量升高,SOD含量降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。
表 1 各組大鼠心肌組織MDA、SOD含量比較
2.2心肌組織細(xì)胞凋亡率Tunel染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組、曲美他嗪組心肌組織細(xì)胞凋亡率[(6.87±0.82)%、(12.07±2.30)%]比較,MI/R組[(23.10±4.77)%]明顯升高(P<0.05);與曲美他嗪組比較,曲美他嗪+AG490組心肌組織細(xì)胞凋亡率[(16.61±3.12)%]明顯升高(P<0.05)。
2.3心肌組織病理變化HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組心肌纖維排列整齊、致密,心肌橫紋清晰;MI/R組心肌纖維排列松散、紊亂,心肌細(xì)胞變性、壞死,部分細(xì)胞核溶解、碎裂;心肌纖維斷裂、溶解,間質(zhì)水腫,可觀察到較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn);曲美他嗪組、曲美他嗪+AG490組心肌纖維排列較MI/R組整齊,心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷減輕,部分心肌纖維斷裂、溶解,其中曲美他嗪組對(duì)病理變化的改善效果優(yōu)于曲美他嗪+AG490組。見(jiàn)圖1。
a:對(duì)照組; b:MI/R組; c:曲美他嗪組; d:曲美他嗪+AG490組
2.4心肌組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比較與MI/R組比較,曲美他嗪組心肌組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3明顯升高(P<0.05),對(duì)照組明顯降低(P<0.05);與曲美他嗪組比較,曲美他嗪+AG490組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2,圖2。
表 2 各組大鼠心肌組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比較
1:對(duì)照組; 2:MI/R組; 3:曲美他嗪組; 4:曲美他嗪+AG490組
MI/R發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜,目前認(rèn)為與線粒體損傷與能量耗竭、氧化應(yīng)激、氧自由基、鈣超載、炎癥信號(hào)激活、心肌細(xì)胞凋亡與壞死等有關(guān)[11-12]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已提出缺血后適應(yīng)、遠(yuǎn)程缺血處理、藥物后處理、抗氧化應(yīng)激及緩解鈣離子超載等多種治療MI/R的方式,但尚未成熟,仍需持續(xù)探索安全、有效的干預(yù)方式[13]。
研究表現(xiàn),在MI/R初期將出現(xiàn)強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng),活性氧可直接損傷細(xì)胞膜,并上調(diào)促氧化酶基因表達(dá)上調(diào)并增強(qiáng)其活性,導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡或激活氧化還原信號(hào)途徑導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,并引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用,產(chǎn)生包括MDA在內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化物[14]。本研究結(jié)果顯示,與MI/R組比較,曲美他嗪組心肌組織MDA含量及細(xì)胞凋亡率均降低,SOD含量增加,提示曲美他嗪可減輕心肌氧化應(yīng)激反應(yīng),并減少心肌細(xì)胞凋亡。曲美他嗪可降低3-酮基輔酶A活性,減少游離脂肪酸β氧化,并誘導(dǎo)心肌葡萄糖氧化,減少心肌耗氧量;促進(jìn)冠脈及周?chē)h(huán)血量的增加,減輕心肌缺血所致的細(xì)胞內(nèi)酸中毒,改善線粒體功能,從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。Amini等[15]研究發(fā)現(xiàn),I/R是急性腎衰的主要原因,其可損傷遠(yuǎn)端器官尤其是心臟,而曲美他嗪可發(fā)揮對(duì)心肌損傷的遠(yuǎn)距離保護(hù)作用,與本研究結(jié)果具有一致性,分析原因與曲美他嗪的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物酶和增強(qiáng)抗氧化活性作用有關(guān)。
JAK2/STAT3信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、凋亡、免疫、炎癥等多種生理過(guò)程的關(guān)鍵通路。有研究發(fā)現(xiàn)[16-17],早期再灌注損傷、鈣離子超載將導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放過(guò)度,引發(fā)線粒體腫脹及細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子大量釋放,啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),并通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路保護(hù)心肌組織。AG490是JAK2/STAT3信號(hào)通路的特異性抑制劑,可通過(guò)阻斷位于JAK特異位點(diǎn)上的絲氨酸或酪氨酸磷酸化,抑制下游激酶及其生理、病理效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,MI/R組心肌組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3升高,采用曲美他嗪干預(yù)可進(jìn)一步升高p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3,且曲美他嗪聯(lián)合AG490可減弱曲美他嗪對(duì)MI/R大鼠的治療作用。有學(xué)者報(bào)道顯示,JAK2/STAT3通路在糖尿病大鼠MI/R中活性被抑制,針對(duì)性處理后其心肌梗死面積縮小,且JAK2/STAT3通路活性增強(qiáng)[18],本研究結(jié)果與其結(jié)合提示曲美他嗪對(duì)MI/R的心肌保護(hù)作用可能通過(guò)激活JAK2/STAT3通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。
綜上所述,曲美他嗪可減輕MI/R大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng),減少心肌細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與激活JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。關(guān)于曲美他嗪的心肌保護(hù)作用是否存在其他作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。
醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)2021年11期