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維生素A對呼吸道上皮細(xì)胞線粒體功能的作用機(jī)制

2021-11-26 01:20曹海霞黃登亮張耀剛袁馥梅馬艷艷
關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)線粒體引物

張 軒,侯 靜,曹海霞,黃登亮,張耀剛,袁馥梅,馬艷艷

0 引 言

維生素A(Vitamin A, VA)是一種機(jī)體所必需、能維持細(xì)胞正常代謝且極易被忽視并造成缺乏的脂溶性維生素。在促進(jìn)呼吸道上皮細(xì)胞增殖、分化中起重要的作用[1- 2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)血清VA水平與兒童呼吸道感染關(guān)系密切,機(jī)體VA越低,呼吸道感染的概率越高,感染癥狀越嚴(yán)重[3],這可能與適當(dāng)濃度VA能促進(jìn)免疫細(xì)胞的分化成熟、提高機(jī)體的免疫能力有關(guān)[4]。眾所周知線粒體是細(xì)胞的動力源泉,并且在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞激活、分化過程中也起著重要作用[5],線粒體DNA能夠激活主要的先天免疫信號通路[6]。研究顯示免疫反應(yīng)程度與細(xì)胞代謝狀態(tài)有關(guān),而線粒體作為細(xì)胞代謝的主要細(xì)胞器,對維持和建立免疫應(yīng)答至關(guān)重要[7]。如氨基酸代謝影響T細(xì)胞分化和巨噬細(xì)胞極化;三羧酸循環(huán)部分中間產(chǎn)物,也參與了先天性和獲得性免疫與炎癥反應(yīng)的部分過程[8]。因此,VA可能會通過影響線粒體功能對呼吸道上皮細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。故本研究通過用VA處理人主支氣管上皮細(xì)胞(HNTEC),檢測線粒體相關(guān)指標(biāo)的變化,初步探索VA對呼吸道上皮細(xì)胞線粒體功能的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株人正常主支氣管上皮細(xì)胞(HNTEC)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2試劑與儀器維生素A(Selleck,S5592),二甲基亞砜DMSO(Solarbio,D8370),特級胎牛血清(Biological Industries,04-001-1ACS),0.25%胰酶(Gibco,27250018),1640培養(yǎng)基(Gibco,23400-021),CCK-8試劑盒(TransGen,F(xiàn)C101-04),Taq DNA聚合酶(Invitrogen),質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen),DNA純化試劑盒(Sangon Biotech),Trizol(TaKaRa,9109),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen,AT311-03),F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(Roche,04913914001),細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)(BioTek Cytation5),細(xì)胞能量代謝分析儀(Agilent Seahorse XFe 96),實(shí)時熒光定量PCR儀(LightCycler? 480),超微量核酸蛋白濃度測定儀(Nanodrop 2000C)

1.2方法

1.2.1VA處理濃度的篩選將HNTEC細(xì)胞以100 μL,1×104個/孔接入96孔板,分為對照組、VA-0.1 mg/L組、VA-0.5 mg/L組、VA-2 mg/L組、VA-4 mg/L組、VA-8 mg/L組、VA-16 mg/L組、VA-32mg/L組,每組5個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后加入10 μL CCK8溶液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h,450 nm波長檢測吸光值,根據(jù)吸光值計(jì)算細(xì)胞存活率[9]。最終確定VA的給藥量為0.1、0.5、2 mg/L。

1.2.2細(xì)胞樣本的制備本實(shí)驗(yàn)均采用復(fù)蘇后傳至同一代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,用含有10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及數(shù)量,每1~2天進(jìn)行傳代。取對數(shù)生長期的HNTEC細(xì)胞,棄掉舊培養(yǎng)基,2 mL 1×PBS洗1遍,1 mL 0.1%胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液,以1.3×106個/皿的細(xì)胞密度接種90 mm培養(yǎng)皿,隨機(jī)分為對照組、VA-0.1 mg/L組、VA-0.5 mg/L組、VA-2mg/L組加入相應(yīng)濃度的VA,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h,收集細(xì)胞后存入-80 ℃冰箱備用。

1.2.3細(xì)胞線粒體能量代謝分析將HNTEC細(xì)胞以80 μL,7×103個/孔接種于Seahorse XFe 96孔檢測板,接種細(xì)胞時同時加入不同濃度VA,每組3個復(fù)孔,將接種好的細(xì)胞靜置20 min后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng);24 h后,以同樣方式接種細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,用Seahorse XFe線粒體壓力檢測試劑盒檢測上述各組細(xì)胞的線粒體功能狀態(tài)。在Seahorse XFe細(xì)胞代謝分析時依次用寡霉素、FCCP、魚藤酮/抗霉素A干預(yù)線粒體電子傳遞及氧化磷酸化,并實(shí)時監(jiān)測記錄細(xì)胞耗氧率;通過專用分析軟件Wave處理所測數(shù)據(jù),得到線粒體代謝相關(guān)的參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中使用寡霉素、FCCP、魚藤酮/抗霉素A濃度分別為2、1.5、0.5 μmol/L。

1.2.4線粒體DNA拷貝數(shù)分析線粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備[10]:用Platinum? Taq DNA聚合酶對MT-CYB基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,膠回收純化,克隆至pEASY-T1載體(3829 bp)中,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞并克隆至大腸埃希菌擴(kuò)增后,篩選鑒定含有插入片段的陽性菌株并提取質(zhì)粒,提取的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)分析:使用酚-氯仿法提取細(xì)胞樣本的DNA,測定DNA濃度。以無菌去離子水10倍梯度稀釋MT-CYB重組質(zhì)粒,制備濃度為103~108拷貝/μL的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線模板;將待測樣品稀釋為5 ng/μL??偡磻?yīng)體系為15 μL,DNA 2 μL、2×SYBR Green 7.5 μL 、上下游引物(10 μmol/L)共3 μL、ddH2O 2.5 μL,使用實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品MT-CYB基因定量PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸34 s,共40個循環(huán)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品中線粒體DNA拷貝數(shù)。

1.2.5線粒體自噬相關(guān)基因P62的表達(dá)Trizol法提取待測樣品中的總RNA,測定濃度,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行待測樣品擴(kuò)增,總反應(yīng)體系為15 μL,cDNA 2 μL、2×SYBR Green 7.5 μL、上下游引物共3 μL、ddH2O 2.5 μL,擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火、延伸34 s,共40個循環(huán)。P62基因上游引物:5'-TGTGTAGCGTCTGCGAGGGAAA-3',下游引物:5'-AGTGTCCGTGTTTCACCTTCCG-3';GAPDH基因上游引物:5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC -3',下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3';CYB上游引物:5'- ATGACCCCAATACGCAAAACTAAC-3',下游引物:5'-GGCCCATTTGAGTATTTTGTTTTCA-3'。P62基因的表達(dá)采用-ΔΔCT法分析,GAPDH為內(nèi)參基因。

2 結(jié) 果

2.1 VA提高人主支氣管上皮細(xì)胞線粒體有氧代謝功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VA處理HNTEC細(xì)胞24 h后線粒體耗氧量相較于對照組增高,處理濃度為0.5 mg/L時細(xì)胞線粒體耗氧量最高、ATP生成最多、最大呼吸潛能最高、質(zhì)子漏增加;處理48 h,0.1、0.5 mg/L處理組的結(jié)果與24 h一致,VA為2 mg/L時結(jié)果相較于對照組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

a、d:分別為24、48 h ATP產(chǎn)生; b、e:分別為24、48 h最大呼吸潛能; c、f:分別為24、48 h質(zhì)子漏

2.2VA增加人主支氣管上皮細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)與對照組和VA-0.1 mg/L組比較,VA-0.5 mg/L組、VA-2 mg/L組24 h線粒體拷貝數(shù)明顯升高(P<0.01);VA-2 mg/L組、VA-0.5 mg/L組24 h線粒體拷貝數(shù)較VA-0.1 mg/L組明顯升高(P<0.01);VA-2 mg/L組24 h線粒體拷貝數(shù)較VA-0.5 mg/L組明顯升高(P<0.05)。與對照組比較,VA-0.1 mg/L組48 h線粒體拷貝數(shù)明顯升高(P<0.01);VA-2 mg/L組、VA-0.5 mg/L組48 h線粒體拷貝數(shù)較VA-0.1 mg/L組明顯降低(P<0.01);VA-2 mg/L組48 h線粒體拷貝數(shù)較VA-0.5 mg/L組明顯降低(P<0.01)。見表1。

表 1 VA處理后HNTEC細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的變化

2.3VA抑制人主支氣管上皮細(xì)胞線粒體自噬結(jié)果表明在VA處理24、48 h后,P62基因的表達(dá)較對照組明顯升高,且隨著VA濃度的增加而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但在48 h,干預(yù)濃度為2 mg/L較0.5 mg/LP62基因表達(dá)稍降低(P<0.05)。見表2。

表 2 VA處理后HNTEC細(xì)胞P62基因的變化

3 討 論

VA 缺乏是一個世界性的營養(yǎng)問題,尤其是在處于生長發(fā)育階段的兒童,其維生素缺乏情況遠(yuǎn)較成人嚴(yán)重[11]。在發(fā)達(dá)國家,普通膳食VA的供給量也處于不足水平的邊緣,我國屬于中度缺乏國家,且VA缺乏地區(qū)分布不平衡,邊遠(yuǎn)地區(qū)缺乏尤為嚴(yán)重,有調(diào)查顯示撫順地區(qū)2018年亞臨床VA缺乏為10.5%,可疑亞臨床VA缺乏達(dá)45.3%[12]。既往研究顯示VA是有效的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子[13-14],在影響Th細(xì)胞分化維持免疫平衡[15]、保持上皮細(xì)胞完整性有關(guān)鍵作用[16],但關(guān)于VA對呼吸道上皮細(xì)胞的作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道。因此,明確VA的作用機(jī)制對預(yù)防反復(fù)呼吸道感染的發(fā)病有較為重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)VA代謝中間產(chǎn)物9-順式維甲酸、全反式維甲酸可通過RIP140/PGC-1α軸誘導(dǎo)人神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)和功能成熟[17]。增加膳食VA的攝入水平可以上調(diào)控制線粒體DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子TFAM水平,顯著增加線粒體生物發(fā)生和耗氧量[18]。同時維甲酸(Retinoic acid ,RA)促進(jìn)了與線粒體生物發(fā)生有關(guān)的PGC-1α基因表達(dá)水平,增加了線粒體含量標(biāo)志物SDHA-1水平,還可以影響骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞線粒體功能[19-20]。由此推測VA可能會通過調(diào)節(jié)呼吸道上皮細(xì)胞線粒體功能影響機(jī)體狀態(tài)。故本研究首先通過細(xì)胞能量代謝儀分析不同濃度VA處理HNTEC細(xì)胞的線粒體代謝水平,檢測指標(biāo)包含基礎(chǔ)氧耗、ATP生成量、線粒體最大耗氧能力、細(xì)胞呼吸潛力等。結(jié)果顯示0.1、0.5 mg/L VA處理組較對照組線粒體ATP生成、最大呼吸能力增加,而高劑量的VA反而會降低ATP生成。提示適量VA可以增強(qiáng)線粒體功能。線粒體自噬是線粒體質(zhì)量控制的重要機(jī)制[21],因此通過檢測線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體自噬相關(guān)基因P62的水平來探索VA影響線粒體功能的可能機(jī)制。

線粒體DNA拷貝數(shù)代表了每個細(xì)胞的線粒體數(shù)目及線粒體基因組數(shù)目,是衡量線粒體功能的指標(biāo)之一[22]。線粒體DNA拷貝數(shù)的減少可能直接引起線粒體數(shù)量下降、損害線粒體呼吸功能甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡[23]。p62作為多種泛素化底物選擇性自噬受體的載體,是線粒體自噬信號通路中的重要連接蛋白,通過與LC3結(jié)合來將泛素化蛋白、受損的線粒體轉(zhuǎn)移到自噬小體中將其降解。自噬過程被抑制會導(dǎo)致p62積聚,因此其含量與自噬水平成反比[24]。本研究結(jié)果提示短時間內(nèi)隨著VA濃度的增加,細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)、P62基因的表達(dá)水平增高;而長時間高劑量的VA處理后細(xì)胞線粒體DNA拷貝、P62基因的表達(dá)則降低。表明適當(dāng)?shù)腣A補(bǔ)充能增加線粒體數(shù)量及線粒體代謝狀態(tài),促進(jìn)細(xì)胞代謝;但長時間大量給予VA反而會影響線粒體功能,可對細(xì)胞造成代謝負(fù)擔(dān)。這驗(yàn)證了RA的水平必須受到嚴(yán)格控制,缺乏或過量都會導(dǎo)致機(jī)體代謝及各器官發(fā)育異常的報(bào)道[25],同時也提示適量補(bǔ)充VA可以促進(jìn)呼吸道上皮細(xì)胞生長代謝。

綜上所述,本研究提示VA可以通過降低線粒體自噬及增加線粒體DNA拷貝數(shù)增強(qiáng)正常呼吸道上皮細(xì)胞線粒體功能,但對炎癥呼吸道上皮細(xì)胞是否有同樣作用,有待進(jìn)一步研究。同時VA是否通過RA信號通路調(diào)節(jié)人主支氣管上皮細(xì)胞線粒體功能也是后續(xù)重點(diǎn)研究方向,以期為臨床VA適量補(bǔ)充提供更多的理論支撐。

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