楊光勇，涂小華，游豐鋒，何亞敏，喻良錦，田維毅，何光志*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025;3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是腸道免疫穩(wěn)態(tài)被打破而導(dǎo)致的腸道炎癥，病變主要限于結(jié)腸的黏膜，主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液便及膿血便，會(huì)引起中毒性腸擴(kuò)張、腸狹窄、腸穿孔、結(jié)腸癌等，這些癥狀嚴(yán)重影響患者正常生活和工作[1]。UC的病因與機(jī)制尚未明確，但腸道免疫紊亂是其發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。腸道微生態(tài)系統(tǒng)是機(jī)體龐大、重要的微生態(tài)系統(tǒng)。腸道菌群按照對(duì)宿主的作用分為共生生理性細(xì)菌、共棲條件致病菌和病原菌，其中共生生理性細(xì)菌為專性厭氧菌,是腸道優(yōu)勢(shì)菌群，占腸道菌群總量的99%，而98%的厭氧菌分布于盲腸與結(jié)腸[2]，嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila,A.muciniphila)就是其中之一。A.muciniphila的代謝產(chǎn)物丙酸對(duì)機(jī)體有明確的免疫調(diào)節(jié)作用，在糖尿病、肥胖癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸癌等多種疾病中具有重要的作用[3]。

黃連清熱燥濕，瀉火解毒，是諸多治療潰瘍性結(jié)腸炎的方劑中的主要成分，黃連中的鹽酸小檗堿和黃連堿[4]等多種成分通過改善受損的腸黏膜屏障和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，在治療潰瘍性結(jié)腸炎中起到較強(qiáng)的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯對(duì)大鼠腸道內(nèi)的A.muciniphila菌有促進(jìn)作用[5]，為進(jìn)一步研究黃連對(duì)其在UC小鼠中的影響，本研究通過與傳統(tǒng)藥物美沙拉嗪進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative Real-Time PCR, qPCR)對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行絕對(duì)定量分析，從腸道特定共生菌群A.muciniphila細(xì)菌的角度出發(fā)，探究黃連對(duì)該菌的作用在UC疾病中的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6周齡KM小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014。小鼠以小組單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，環(huán)境：濕度60%、溫度25 ℃、12 h/12 h的光照/黑暗周期。所有實(shí)驗(yàn)操作符合3R原則(減少、替代、優(yōu)化)給予人道關(guān)懷。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS，Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)：H02J9B62777)；中草藥黃連(北京同仁堂)；美沙拉嗪(莎爾福公司，批號(hào)：17G27518L)；糞便基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司，批號(hào)：S8114)；2×RealStar Green Fast Mixture(GeneStar 公司,批號(hào)：9AG01)；96-Well PCR Plate HC96101-01，(GeneStar 公司,批號(hào)：9BC01)；PCR Sealing Film HC96551-01，(GeneStar公司,批號(hào)：9BB01)。

1.3 主要儀器

CFX96TM實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀(BIO-RAD,美國(guó))，核酸濃度檢測(cè)儀(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥物制備及給藥方法

按人與小鼠體表面積折算計(jì)算給藥劑量，配制成6.5 mg/mL的美沙拉嗪藥液，按0.1 mL/10 g體積對(duì)小鼠灌胃給藥，每天3次；從北京同仁堂購(gòu)入黃連，制備水煎藥。參考李國(guó)輝[6-7]等實(shí)驗(yàn)研究，為避免對(duì)小鼠產(chǎn)生抑菌效果和腦神經(jīng)損傷，最終將給藥劑量定為0.3 g/kg。取3 g黃連，用100 mL去離子水泡20 min，水煎30 min左右，再補(bǔ)足去離子水至100 mL即為3×10-2g/mL濃度。給藥劑量0.3 g/kg即是3×10-3g/10 g，則一只體質(zhì)量20 g的小鼠給藥量為6×10-3g，即按3×10-2g/mL劑量取0.2 mL，每天1次灌胃給藥。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及UC模型制備

小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組，模型組，美沙拉嗪組(65 mg/kg)，黃連組(0.3g/kg)，每組10只?？瞻讓?duì)照組給予蒸餾水，參考李望[8]、吳昊[9]和胡仁偉[10]等探討總結(jié)的誘發(fā)小鼠較理想的UC模型的方法，用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)制備UC小鼠模型，各組采用3% DSS溶液連續(xù)灌胃7 d，誘導(dǎo)UC模型，第8天開始全部換成蒸餾水。造模成功后第1天開始灌胃給藥，除空白對(duì)照組與模型組給予蒸餾水外，其余各組按上述劑量給予相應(yīng)的藥物，連續(xù)給藥10 d。

1.4.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)秦倩倩[11]等的研究，合成A.muciniphila細(xì)菌基因特異性引物，上游引物：5′-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3′，下游引物：5′-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3′，基因全長(zhǎng)：329 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.4 各組樣品基因組模板制備

DNA實(shí)驗(yàn)第18天，收集小鼠新鮮糞便，用糞便基因組DNA試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作，提取基因組DNA，用核酸濃度檢測(cè)儀測(cè)定提取的DNA模板的純度及濃度，確保DNA純度A260/A280比值在1.8左右，濃度在200 ng/μL左右，均置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 qPCR標(biāo)準(zhǔn)品目的DNA的制備

用空白對(duì)照組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物提取后送上海生物工程有限公司合成進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示與Gene-Bank公布序列(NR_042817.1)一致，抽提克隆菌質(zhì)粒保證其質(zhì)量在4 μg以上。選用在20 μL體系終濃度0.5 ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)品目的DNA的拷貝數(shù)為：copies/μL=(9.12×1011)×(0.5 ng/μL)/(1 865+329 bp)≈2.0×108copies/μL。

1.4.6 qPCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件

參考秦倩倩[11]等研究的方法用標(biāo)準(zhǔn)品目的基因質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和調(diào)整。取上述20 μL體系終濃度0.5 ng/μL的克隆基因質(zhì)粒再稀釋10倍作為模板。反應(yīng)采用20 μL體系：5 ng/μL模板2 μL，10 μmoL/L上下游引物各0.3 μL，2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL，去離子水補(bǔ)充體系至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，39個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)采集設(shè)在72 ℃。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)65～95 ℃的溶解曲線，溫度以0.5 ℃/5 s遞增。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光信號(hào)是否呈指數(shù)增長(zhǎng)、定量循環(huán)數(shù)(quantification cycle,Cq)值及溶解曲線來綜合判斷結(jié)果。

1.4.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

將上述已制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋(2.0×108copies/μL)～(2.0×103copies/μL)每個(gè)梯度各設(shè)3個(gè)平行進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，設(shè)置無模板對(duì)照(no template control,NTC)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢驗(yàn)方法的靈敏度。

1.4.8 特異性實(shí)驗(yàn)

提取本實(shí)驗(yàn)室的基因組DNA，包括大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、金黃色葡萄糖球菌、腸球菌、擬桿菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，A.muciniphila菌為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用絕對(duì)定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)方法靈敏度和特異性，統(tǒng)計(jì)方法用CFX96TM實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀進(jìn)行ΔCt分析，計(jì)算每組基因拷貝數(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差值，以空白對(duì)照組(control group)作為對(duì)照參考，每組8個(gè)樣本，各設(shè)置3個(gè)平行。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及方法靈敏度

(2.0×108copies/μL)～(2.0×103copies/μL)6個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)平行進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)的A.muciniphila基因qPCR擴(kuò)增結(jié)果呈指數(shù)增長(zhǎng)期的曲線平行擴(kuò)增(圖1)，熔解曲線均出現(xiàn)特異性單峰(圖2)顯示峰值在87.5 ℃，NTC結(jié)果顯示個(gè)別有雜峰，Cq值在31左右，與2.0×103copies/μL的Cq值27左右相差值約3.32，基本符合BIO-RAD公司提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn),即MIQE指南的10倍梯度稀釋，MIQE指南即發(fā)表實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)所須提供的最低信息量(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)，故推斷方法的靈敏度為2.0×102copies/μL。R2=0.998，斜率為-3.512符合MIQE中要求的3.3～3.8之間標(biāo)準(zhǔn)，截距為39.033，擴(kuò)增效率92.6%符合MIQE 90%～105%的標(biāo)準(zhǔn)。因標(biāo)準(zhǔn)曲線以10倍濃度稀釋，根據(jù)以上信息，以DNA拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Cq值為縱坐標(biāo)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，線性關(guān)系為Cq=-3.512×lgX+39.093，即X=10^[(Cq-39.033)/-3.512]，其中X為qPCR結(jié)果對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)copies/μL，線性良好，可用于定量分析。

注:①～⑥：2.0×108，2.0×107，2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103copies/μL；⑦：NTC。圖1 A.muciniphila菌qPCR靈敏度實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線

圖2 A.muciniphila菌qPCR靈敏度實(shí)驗(yàn)熔解曲線

圖3 A.muciniphila菌qPCR靈敏度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法特異性

除A.muciniphila菌為陽(yáng)性對(duì)照樣本具有特異性擴(kuò)增外，其余陰性樣本均出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象(圖4)，說明該方法特異性良好，可結(jié)合熔解曲線(圖5)綜合判定結(jié)果。

圖4 A.muciniphila菌qPCR特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線

圖5 A.muciniphila菌qPCR特異性實(shí)驗(yàn)熔解曲線

2.3 qPCR對(duì)各組A.muciniphila菌的定量

各組糞便中A.muciniphila菌的絕對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果顯示呈指數(shù)增長(zhǎng)期的曲線平行擴(kuò)增(圖6)，熔解曲線均出現(xiàn)特異性單峰(圖7)顯示峰值在87.5 ℃，NTC結(jié)果無擴(kuò)增；表1ΔCt分析情況顯示，以空白對(duì)照組為組間參照時(shí)黃連組的相對(duì)值明顯升高，美沙拉嗪組稍有降低，模型組有一定升高；如表1所示，各組A.muciniphila細(xì)菌基因拷貝數(shù)分別為空白組(1 233.11±96.03)μL，模型組(2 019.62±194.02)μL，黃連組(268 501.74±54 703.05)μL，美莎拉嗪組(871.86±73.41)μL。各組與模型組比較，空白對(duì)照組基因拷貝數(shù)約為其2倍，黃連組約為133倍，美沙拉嗪組約為0.43倍。各組樣本Cq值箱線圖顯示空白對(duì)照組內(nèi)差異最小，模型組和美沙拉嗪組各自組內(nèi)差異不大 ，黃連組組內(nèi)差異較大，但不超過0.5，符合MIQE指南，可以進(jìn)行相關(guān)分析。

圖6 A.muciniphila菌qPCR各組實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線

圖7 A.muciniphila菌qPCR各組實(shí)驗(yàn)熔解曲線

圖8 各組樣本Cq值箱線圖

表1 各組樣本中A.muciniphila菌qPCR檢測(cè)結(jié)果ΔCt分析情況

3 討論

A.muciniphila的生存與增殖僅用腸道黏蛋白作為唯一碳源和氮源，過多種機(jī)制維持腸道穩(wěn)態(tài)。黏蛋白增多癥與肥胖、糖尿病、心臟代謝疾病和輕度炎癥呈負(fù)相關(guān)[12]，其分解黏蛋白并刺激杯狀細(xì)胞合成黏蛋白達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡的特性使其成為維持腸道黏膜屏障的關(guān)鍵微生物[13]。A.muciniphila菌的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸主要為丙酸，存在于靠近腸上皮細(xì)胞的黏液層，丙酸通過 G 蛋白偶聯(lián)受體43作用于腸道組織對(duì)機(jī)體有明確的免疫調(diào)節(jié)作用[14]。A.muciniphila菌鞭毛中的膜型毛樣蛋白Amuc_1100是Toll樣受體2的激活劑，可調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答和腸道屏障功能[14]，維持體內(nèi)代謝平衡，在糖尿病、肥胖癥[15]、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸癌等多種疾病[16]中具有重要的作用，膳食對(duì)它的調(diào)控尤其顯著。高豐富度的A.muciniphila似乎有利于糞便菌群移植治療難治性慢性活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎[16]。

研究顯示，二甲雙胍及一些寡聚果糖[17]、石榴鞣單寧[18]和膳食纖維[3]等可以增加腸道內(nèi)A.muciniphila細(xì)菌，而相關(guān)中藥對(duì)其卻少有報(bào)道。黃連清熱燥濕，瀉火解毒，是諸多治療潰瘍性結(jié)腸炎的方劑中的主要成分，其中鹽酸小檗堿、黃連堿等多種成分在治療潰瘍性結(jié)腸炎中也具有重要作用[4]。

本研究用qPCR技術(shù)分析黃連對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型結(jié)腸段A.muciniphila細(xì)菌的定殖數(shù)量變化，探討黃連對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜屏障和機(jī)體炎癥反應(yīng)的影響，可為黃連調(diào)控A.muciniphila細(xì)菌的定殖以改善治療潰瘍性結(jié)腸炎提供科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果表明，A.muciniphila細(xì)菌在模型組小鼠腸道中有一定增殖情況，這與黏蛋白在結(jié)腸炎腸道中增加有關(guān)。美沙拉嗪可輕微抑制A.muciniphila菌，可能跟其主要成分5-氨基水楊酸可用于治療結(jié)核病的抗菌藥的抗菌效果有關(guān)，也可能是因?yàn)槠渥饔糜谘装Y黏膜，抑制引起炎癥的前列腺素合成和炎癥介質(zhì)白三烯的形成，對(duì)腸壁炎癥有顯著的消炎作用的炎癥治療效果，從而導(dǎo)致引起炎癥的腸道黏蛋白分泌減少，進(jìn)一步導(dǎo)致僅將腸道黏蛋白作為唯一碳源和氮源的A.muciniphila菌群數(shù)量減少。黃連對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠腸道中的A.muciniphila細(xì)菌有明顯促進(jìn)增殖的作用，因黃連本身與美沙拉嗪相似，都具有抑菌作用和抗炎效果，但可能抑制的菌群種類和數(shù)量不同，其具體促進(jìn)A.muciniphila細(xì)菌增殖機(jī)制還需進(jìn)一步研究。