史禎琦，佘冬立①，陳心逸，夏永秋

(1.河海大學農(nóng)業(yè)科學與工程學院，江蘇 南京 210098;2.中國科學院南京土壤研究所/ 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室,江蘇 南京 210008)

海岸灘涂鹽堿地是重要的土地后備資源。1985至2016年，我國東部沿海共圍墾灘涂9 310.6 km2，對保障耕地占補平衡與國家糧食戰(zhàn)略安全起到重要作用[1]。然而，海涂圍墾區(qū)鹽堿地土壤結構差、肥力水平低，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對化肥依賴度高，肥料利用率遠低于非鹽堿地土壤；加之圍墾區(qū)普遍采用大水灌溉洗鹽壓堿，土壤鈉鹽含量季節(jié)與年際變化明顯[2]，隨著鈉鹽含量變化，圍墾區(qū)土壤氮素生物地球化學循環(huán)過程也必然發(fā)生改變。

氨揮發(fā)與反硝化過程是農(nóng)業(yè)土壤氮素消納的重要途徑，其速率在沿海生態(tài)系統(tǒng)和內(nèi)陸生態(tài)系統(tǒng)之間差異明顯。對分布在閩江口道慶州的淡水沼澤濕地和沿海鱔魚灘沼澤濕地進行研究發(fā)現(xiàn)，淡水沼澤濕地反硝化速率〔(32.72±19.15) μmol·m-2·h-1，以N2計〕顯著高于沿海沼澤濕地反硝化速率〔(4.97±2.64) μmol·m-2·h-1，以N2計〕(P<0.05)[3]。影響氨揮發(fā)和反硝化速率變異的因素眾多，目前關于溫度、pH、氧化還原電位(Eh)、有機碳與活化氮有效性等環(huán)境因素的影響已開展較多研究。其中，pH 是影響氨揮發(fā)的重要因素，環(huán)境中銨態(tài)氮濃度和氨揮發(fā)損失量均與pH呈正相關關系[4]。同時，陳巍等[5]對重鹽土脫鹽-返鹽過程的研究表明，鹽分變化對pH有顯著影響。

關于鹽分變化對氮素循環(huán)過程的影響規(guī)律及機制還有待深入研究[6-7]。隨著上覆水或底泥中鹽離子(如Cl-、Na+、SO42-、Mg2+)濃度增大，鹽分含量增高，底泥反硝化速率表現(xiàn)出不同的響應規(guī)律[8]。有研究表明，鹽分含量變化在0～36 g·kg-1范圍的河口地區(qū)，底泥反硝化速率與鹽分含量呈顯著負相關關系[9]；然而FEAR等[10]對美國Eutrophic Neuse河口區(qū)鹽度梯度上反硝化的研究表明，反硝化速率與鹽分含量并未呈現(xiàn)顯著相關關系。李建兵等[11]通過室內(nèi)恒溫培養(yǎng)實驗，發(fā)現(xiàn)鹽分促進NH3揮發(fā)；但也有研究表明，在中度鹽漬化土壤中，施肥后氨揮發(fā)總量主要由施氮深度決定，且施氮情況下，低鹽度對脲酶活性無影響，高鹽度反而促進脲酶活性[12]。

鹽分變化可能成為解釋沿海生態(tài)系統(tǒng)與內(nèi)陸生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)過程速率差異的重要影響因素[8]。筆者研究擬通過培養(yǎng)試驗，測定淹水土壤氨揮發(fā)與反硝化特征，進一步明確鹽分變化對海涂土壤氨揮發(fā)和反硝化的影響規(guī)律，為合理開發(fā)利用海涂資源、提高氮肥利用效率等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試土壤和試驗設計

供試土壤取自江蘇如東掘港鎮(zhèn)六總村(32°12′ N，120°42′ E)，位于如東縣外側黃海灘地，為亞熱帶海洋性季風氣候區(qū)，圍墾年限為60 a，主要為農(nóng)業(yè)用地，作物類型為水稻，灌溉方式為淹灌，所施氮肥以尿素為主。土壤類型為粉砂土，母質為海相淤積物，土壤砂粒(粒徑0.05～2 mm) 、粉粒(粒徑0.002～<0.05 mm)和黏粒(粒徑<0.002 mm) 質量分數(shù)分別為13.7%、81.3%和5.0%，土壤基本理化性質：pH為7.2，含鹽量為0.24 g·kg-1，w(銨態(tài)氮)為0.12 mg·kg-1，w(硝態(tài)氮)為0.08 mg·kg-1，w(總有機氮)為0.21 mg·kg-1，w(有機碳)為3.1 g·kg-1。

研究鹽度對氨揮發(fā)和反硝化的影響，需要進行覆水土壤室內(nèi)培養(yǎng)試驗。根據(jù)土壤特性及研究目的，經(jīng)鹽分淋洗處理后，參考濱海鹽土分級標準〔非鹽化土壤，含鹽量(g·kg-1)≤1；輕度鹽化土壤，>1～2；中度鹽化土壤，>2～4；重度鹽化土壤，>4～6；鹽土，>6〕[13]，設置低鹽度處理<1 (即不做鹽分淋洗處理，CK)、1、2 g·kg-1和高鹽度處理4、10 g·kg-1共5個NaCl鹽分梯度，每個處理重復3次。供試土壤經(jīng)風干、過5 mm孔徑篩后，通過多次噴灑NaCl溶液并混勻進行鹽分處理，將處理后土壤填入培養(yǎng)盆(PVC，厚度為5 mm，內(nèi)部尺寸為340 mm×270 mm×130 mm)中，共計15個樣品，添加足量碳源(每盆1.2 g C6H12O6)和氮源〔每盆0.9 g CO(NH2)2〕，培養(yǎng)7 d后，測定各處理氨揮發(fā)、反硝化速率及水土環(huán)境因子。

1.2 氨揮發(fā)、反硝化速率及水土環(huán)境因子測定

采用通氣法[14]測定氨揮發(fā)速率(連續(xù)7 d)，收集裝置為PVC圓管，內(nèi)徑15 cm，高20 cm，裝有不銹鋼網(wǎng)架以控制海綿放置高度。將圓管垂直插入沉積物，保證水土界面以上部分大于10 cm。將兩塊厚度2 cm、直徑16 cm的海綿的一面用15 mL磷酸甘油溶液浸潤(50 mL磷酸混合40 mL丙三醇后定容至1 000 mL制成磷酸甘油溶液)，將下海綿置于網(wǎng)架上，浸潤一面面向土壤，吸收氨揮發(fā)氣體；將上海綿與管口齊平，浸潤一面面向空氣，使兩塊海綿均與圓管緊密貼合。24 h后，將裝置中的下海綿裝入加有300 mL 2.0 mol·L-1氯化鉀溶液的塑料瓶中，完全浸沒，氣浴振蕩1 h后，采集浸提液50 mL，測定浸提液中銨態(tài)氮含量。氨揮發(fā)速率(RNH3-N，μmol·m-2·h-1，以NH3計)計算公式為

(1)

式(1)中，M為平均每天吸附的氨氣(NH3-N)質量，mg；A為收集裝置橫截面積，m2；D為每次收集的時間，h。

采用膜進樣質譜法測定反硝化速率[15]。利用無擾動沉積物采樣器(PVC，內(nèi)徑8 cm，外徑9 cm，高27 cm)采集各處理上覆水及0～10 cm原狀沉積物，底部用橡膠塞密封。沿玻璃棒緩慢加入與上覆水氮素含量一致的硝酸鉀溶液直至柱體內(nèi)充滿液體，擰好蓋子，調整直至柱體中沒有任何氣泡，將柱體置于模擬原位淹水環(huán)境的培養(yǎng)裝置中，連接進水管和出水管。淹水平衡4～6 h后，分別在0、2、4、6和8 h時取樣，采用膜進樣質譜儀測定c(N2)/c(Ar)比值。水樣N2濃度計算公式為

c(N2)=fc×[c樣品(N2)/c樣品(Ar)] ×c理論值(Ar)。

(2)

式(2)中，fc為校正因子，即c(N2)/c(Ar)的標準水樣理論值與實測值的比值。在密閉培養(yǎng)體系中，反硝化主產(chǎn)物N2濃度隨培養(yǎng)時間延長而增加。將不同培養(yǎng)時間水樣N2濃度和時間進行線性回歸，斜率為沉積物柱上覆水中N2濃度變化速率(圖1)，μmol·L-1·h-1，以N2計；結合沉積物柱樣橫截面積(m2)與上覆水體積(L)，即得反硝化速率，μmol·m-2·h-1，以N2計[15]。

同時測定上覆水及土壤理化性質，采用流動分析儀(TRACCS2000，Skalar Analytical，Breda，the Netherlands)測定無機氮(全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮)濃度；采用便攜式多參數(shù)測試儀(Hach Company，Loveland)測定溶解氧(DO)濃度、pH；采用土壤電導率儀測定土樣浸提液、上覆水電導率(EC)。取表層土樣10 g，提取土樣DNA，采用熒光Q-PCR絕對定量法，使用QIAGEN質粒提取試劑盒提取重組菌質粒，采用NanoDrop測定PCR產(chǎn)物濃度。獲得各處理表層土壤環(huán)境中反硝化相關微生物豐度，將執(zhí)行亞硝酸鹽還原過程的nirK型亞硝酸鹽還原酶基因以及能催化氧化亞氮生成氮氣的nosZ型氧化亞氮還原酶基因作為反硝化微生物的代表基因。

采用Excel軟件整理試驗數(shù)據(jù)，采用SPSS 25.0軟件進行線性回歸分析和不同處理間差異顯著性分析及檢驗，采用Origin 2017軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同鹽度處理氨揮發(fā)和反硝化速率特征

氨揮發(fā)速率隨鹽度升高而遞增(圖2)，其速率(以NH3計)變化范圍為293.92～353.45 μmol·m-2·h-1， CK處理鹽度最小，10 g·kg-1處理最大。當鹽度為1、2、4和10 g·kg-1時，氨揮發(fā)速率分別比對照增加1.9%、3.8%、11.5%和20.3%。由氨揮發(fā)速率增幅可知，低鹽度條件下，鹽度升高對氨揮發(fā)過程促進作用不明顯(P>0.05)；高鹽度條件下，氨揮發(fā)速率增大較為顯著(P<0.05)。

反硝化速率隨鹽度升高而遞減(圖2)，其速率(以N2計)變化范圍為301.91～498.58 μmol·m-2·h-1，CK處理鹽度最大，10 g·kg-1處理最小。當鹽度為1、2、4和10 g·kg-1時，反硝化速率分別比對照降低13.2%、27.9%、34.6%和39.4%。由反硝化速率降幅可知，低鹽度條件下，鹽度升高對反硝化速率限制作用較明顯；高鹽度條件下，反硝化速率降低并不顯著。

2.2 不同鹽度處理水土環(huán)境因子特征

土壤鹽分含量變化導致上覆水及沉積物中環(huán)境因子發(fā)生變化，進而對氨揮發(fā)和反硝化過程產(chǎn)生影響。不同處理間各環(huán)境因子差異顯著性分析結果(表1)表明，上覆水中硝態(tài)氮濃度隨鹽度增大而顯著降低(P<0.05)，上覆水銨態(tài)氮濃度隨鹽度增大而顯著增大(P<0.05)。鹽度對上覆水pH無顯著影響，<1～10 g·kg-1鹽分梯度下上覆水pH變化范圍為7.46～7.67，呈弱堿性。上覆水DO濃度與鹽分梯度呈正相關關系，但未達顯著性水平(P<0.05)。EC隨鹽度提高而顯著增大(P<0.05)，變化范圍為1 016.67～3 780.00 μS·cm-1，當鹽度為1、2、4和10 g·kg-1時，EC分別為對照的1.04、1.33、2.03和3.72倍。

沉積物土壤中硝態(tài)氮濃度隨鹽度增大而增大，土壤銨態(tài)氮濃度隨鹽度增大而降低，兩者濃度變化范圍分別為0.90～0.93和28.69～30.99 mg·kg-1，但土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度隨鹽度變化均未達顯著水平(P>0.05)。表層土壤pH和EC隨著鹽度提高均顯著增大(P<0.05)，與對照相比，各加鹽處理表層土壤pH平均增大4.6%,EC平均增大82.7%。

表1 不同鹽度和水土環(huán)境因子的關系

2.3 不同鹽度處理土壤反硝化微生物特征

將nirK和nosZ基因型反硝化細菌作為代表基因具有典型性。隨著鹽度的提高，nirK和nosZ基因豐度下降，兩者豐度變化范圍分別為123.11～242.93和16.32×103～24.54×103copies·mg-1，10 g·kg-1鹽度處理均最小。與對照相比，鹽度為1、2、4和10 g·kg-1處理nirK基因豐度分別降低9.6%、19.4%、42.8%和49.3%，nosZ基因豐度分別降低21.4%、29.9%、33.0%和33.5%(圖3)。相關性分析結果表明反硝化速率與nirK和nosZ基因豐度均呈顯著正相關關系(圖4)，相關系數(shù)分別為0.71和0.73(P<0.01)，進一步證明反硝化過程是由微生物主導的生化反應。

上述結果與反硝化速率隨鹽度變化而變化的關系相符，其本質是反硝化細菌受鹽分抑制，從而導致反硝化速率降低。低鹽度條件下，反硝化細菌對鹽度增高較為敏感，鹽分水平持續(xù)提高，反硝化優(yōu)勢微生物對鹽分水平的響應程度下降，與反硝化速率變化趨勢一致。

3 討論

土壤鹽分變化對海涂鹽堿土氮素循環(huán)過程具有顯著影響。土壤氨揮發(fā)速率與鹽分水平之間存在顯著正相關關系，隨鹽分水平提高呈顯著增大趨勢，這與徐萬里等[16]和梁飛等[17]的室內(nèi)培養(yǎng)試驗結果一致；AWAD EL-KARIM等[18]也認為一定鹽度范圍內(nèi)土壤鹽漬化加劇氨揮發(fā)的氮素損失，但在低鹽度條件下(1、2 g·kg-1)，鹽分變化對氨揮發(fā)速率的影響不顯著，其原因主要是低鹽度對脲酶活性影響較小[19]。氨化過程首先是在胞外酶的作用下將高相對分子質量可溶性有機氮轉化為低相對分子質量可溶性有機氮，其中，一部分通過微生物生命活動代謝產(chǎn)生氨，另一部分則在環(huán)境中進行脫氨作用產(chǎn)生氨氣[20]。硝化作用對土壤鹽度十分敏感，隨著土壤含鹽量增加，硝化作用受到抑制[16]，但NEJIDAT[21]研究不同鹽度對12種不同土壤硝化過程的影響，結果表明，由于不同環(huán)境下硝化細菌種群不同，故對鹽分的耐受性不同。DANCER等[22]和段爭虎等[23]都認為土壤pH值是影響氨揮發(fā)的重要因素，隨著pH值增加氨揮發(fā)速率增加。筆者試驗中上覆水中硝態(tài)氮濃度隨著鹽度增加而降低，表明硝化作用的確受到一定程度抑制，導致銨態(tài)氮在沉積物界面富集，而上覆水和沉積物銨態(tài)氮濃度與鹽度的關系進一步證明了土壤高鹽度減弱了沉積物土壤對 NH4+的吸附能力，促進 NH4+向水體釋放[24]，同時pH隨著鹽分的增大而增大，總體呈堿性，促進了NH4+向NH3的轉化，氨揮發(fā)速率則顯著增加。因此，氨揮發(fā)速率隨鹽度的增大而增大，實質上是鹽分變化通過影響pH、氮素濃度等環(huán)境因素綜合作用的結果。

鹽分變化引起的土壤反硝化速率差異一方面歸結于鹽離子化學作用改變土壤中NH4+吸附和釋放過程，調節(jié)NH4+可利用性進而影響土壤反硝化速率[25]。高鹽度減弱了土壤對NH4+的吸附能力，導致硝化細菌(amoA)受到可利用NH4+的限制，進而影響反硝化過程[24]。另一方面，更多學者將鹽分對脫氮過程的影響歸因于脫氮微生物對鹽分脅迫的耐受性差異[26]，鹽分通過生理機制直接影響反硝化菌活性，如高鈉鹽環(huán)境易導致細胞發(fā)生質壁分離，從而抑制細胞活性。筆者研究結果表明，nirK和nosZ基因型反硝化細菌豐度與鹽度(即Na+濃度)呈顯著負相關關系，表明高鹽度抑制微生物活性，高鹽度造成的高滲透壓使微生物脫水，進而導致細胞失活，同時抑制微生物代謝酶活性[27]，這與李佳霖[28]對河口區(qū)沉積物反硝化的研究結果一致；但對美國 Eutrophic Neuse河口不同鹽度沉積物反硝化過程的研究結果表明，不同鹽度底泥反硝化速率差異并不顯著[10]，其主要原因是不同反硝化細菌對鹽分的耐受度不同，當鹽度高出一定范圍后，一部分不耐受反硝化菌型持續(xù)死亡，另一部分菌型卻能夠存活并繼續(xù)主導反硝化過程[9]。反硝化過程的兩個關鍵功能基因nirS和nirK表現(xiàn)出對高鹽分環(huán)境具有不同的耐受性，在淡水河流環(huán)境中以nirK基因型反硝化菌為主，而在高鹽分水體環(huán)境中nirS基因型反硝化菌豐度更高[26]。PIAO等[29]對沿海灘涂濕地的調查發(fā)現(xiàn)，nosZ群落α分支耐高鹽度環(huán)境能力顯著高于β和γ分支，鹽度成為影響nosZ群落組成的關鍵性因素。因此，鹽分對反硝化的影響已由簡單的對速率影響研究逐漸發(fā)展到對驅動脫氮過程的微生物群落結構特征及活性影響的相關研究。沿海地區(qū)受海水入侵影響，在降雨入滲和地下水強烈蒸發(fā)等共同作用下，水分運動過程中伴隨有頻繁的“脫鹽”與“返鹽”過程，農(nóng)田土壤水鹽化學環(huán)境動態(tài)變化明顯，勢必成為影響土壤反硝化菌種群結構、豐度和活性的關鍵性因子。因此，“脫鹽”與“返鹽”過程的頻繁交替對反硝化的影響機制探索將成為沿海地區(qū)水文過程驅動下氮素生物地球化學循環(huán)研究的重要突破口之一。

4 結論

土壤鹽分變化對沿海灘涂鹽堿土氮素循環(huán)過程具有顯著影響。鹽度升高減弱了沉積物對 NH4+的吸附能力，同時pH與含鹽量呈正相關，總體呈弱堿性，促進了NH4+向NH3的轉化，最終導致土壤氨揮發(fā)速率隨鹽度升高而顯著增大；鹽度升高抑制反硝化細菌活性，同時又使可利用NH4+(氮源)減少，直接影響反硝化過程，最終導致土壤反硝化速率隨鹽度升高而顯著降低。