聶 倩， 張青青， 白忠臣， 張正平

(1.貴州大學(xué) 大數(shù)據(jù)與信息工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué) 貴州省光電子技術(shù)及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.貴州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

0 引 言

Tau蛋白與微管蛋白(microtuble associated protein,MAP)，相互作用，參與神經(jīng)細(xì)胞骨架的構(gòu)建，在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用[1]。近年來(lái)，在神經(jīng)退行性疾病的研究中，Tau蛋白作為阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)的生物標(biāo)志物之一，在輔助疾病的臨床診斷和干預(yù)治療中具有重要意義[2]。

近年來(lái)，出現(xiàn)了許多生物傳感器的技術(shù)如電化學(xué)方法和光學(xué)方法用于檢測(cè)微量的Tau蛋白[3～10]。光學(xué)生物傳感器是最常見(jiàn)的生物傳感器[8]，目前，表面增強(qiáng)拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)、熒光法和光波干涉法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于其中[9,10]。由于光學(xué)生物傳感器中的SERS傳感器相比電化學(xué)傳感器和壓電傳感器具有更高的檢測(cè)靈敏度和更低的檢測(cè)限，并且能夠直接、實(shí)時(shí)和無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。因此，這里選擇SERS傳感器來(lái)研究和構(gòu)建Tau蛋白生物傳感器。

SERS是利用金屬納米結(jié)構(gòu)表面產(chǎn)生的表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)[11]引起的高強(qiáng)度局域電磁場(chǎng)來(lái)增強(qiáng)待測(cè)分子拉曼信號(hào)的一種高靈敏度技術(shù)。SERS作為一種振動(dòng)光譜技術(shù)，可以提供有關(guān)分子結(jié)構(gòu)的具體信息。利用SERS技術(shù)，能檢測(cè)到濃度極低的有機(jī)物的分子振動(dòng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)生物和化學(xué)分子的無(wú)損和超高的靈敏度的檢測(cè)[12]。通常采用表面粗糙的貴金屬納米結(jié)構(gòu)如金、銀和銅等來(lái)產(chǎn)生電磁熱點(diǎn)以獲得SERS信號(hào)，電磁場(chǎng)的強(qiáng)度可以通過(guò)調(diào)節(jié)納米結(jié)構(gòu)形態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)。因此制備精細(xì)的金屬納米結(jié)構(gòu)基底對(duì)于SERS信號(hào)的強(qiáng)度和靈敏度十分重要。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

聚合度為1 700，醇解度為98 %的聚醋酸乙烯醇(polyvinyl acetate,PVA)粉末(上海阿拉丁試劑有限公司)用作還原劑；三聚氰胺粉末(分析純，上海阿拉丁試劑有限公司)用作薄膜的增強(qiáng)因子(enhancement factors,EFs)測(cè)試；硝酸銀(AgNO3)粉末(分析純，國(guó)藥集團(tuán)有限公司)用于沉積銀島薄膜；甲醇(天津富宇精細(xì)化工有限公司)用于溶解三聚氰胺；Tau441蛋白質(zhì)(ab84700，上海艾博抗有限公司)用作待檢測(cè)蛋白質(zhì)分子；濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(上海索萊寶有限公司)，用于Tau441蛋白質(zhì)的稀釋劑；表面鍍有氧化銦錫薄膜的ITO玻璃(華南湘城科技有限公司)的規(guī)格為20 mm×20 mm×0.55 mm，用作銀島薄膜的支撐基底；在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的水均為去離子水。所有試劑在使用時(shí)均沒(méi)有經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化。

1.2 薄膜基底的制備

1)PVA/AgNO3混合液的制備:a.PVA水溶液的制備:稱取5 g PVA粉末溶解到45 mL去離子水中，并在90 ℃下以500 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌1 h，獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的PVA水溶液;b.AgNO3水溶液的制備：分別稱取AgNO3粉末(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5)g溶解在1 mL去離子水中，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 %，9 %，17 %，23 %，28 %，33 %的AgNO3水溶液;c.PVA/AgNO3混合液的制備:將AgNO3水溶液分別與5 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %PVA水溶液均勻混合，放置在黑暗環(huán)境中1 h，備用。

2)旋涂法制備PVA/AgNO3復(fù)合薄膜:分別量取0.2 mL含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)AgNO3的PVA/AgNO3水溶液均勻滴在ITO玻璃基底上，采用旋涂法制備PVA/AgNO3復(fù)合薄膜。勻膠機(jī)采用三階轉(zhuǎn)速以獲得均勻的薄膜：第一轉(zhuǎn)速500 r/min，10 s；第二轉(zhuǎn)速1 000 r/min，10 s；第三轉(zhuǎn)速4 000 r/min，40 s。

3)復(fù)合薄膜的熱處理:使用自制熱處理系統(tǒng)對(duì)復(fù)合薄膜進(jìn)行熱處理，自制熱處理系統(tǒng)如圖1(a)所示，主要由支撐架、酒精燈、加熱臺(tái)(80 mm×80 mm×3 mm)、溫度傳感器和玻璃罩組成。自制熱處理系統(tǒng)的溫度特性如圖1(b)所示，隨著加熱時(shí)間的增加，加熱臺(tái)表面的溫度逐漸升高，在350 s時(shí)達(dá)到500 ℃并穩(wěn)定在其附件，溫度的均勻性為(500±3)℃。熱處理前，加熱10 min使加熱臺(tái)受熱均勻。隨后，PVA/AgNO3復(fù)合薄膜放置于加熱臺(tái)上，在500 ℃左右下加熱10 min，然后取下薄膜并冷卻至室溫，獲得銀島薄膜基底。

圖1 自制熱處理器及其溫度特性

1.3 薄膜基底的表征

使用材料顯微系統(tǒng)(DM—2700,Leica,Germany)觀察薄膜表面形貌，該顯微系統(tǒng)配備電荷耦合器件(CCD,Du934P,Andor)。使用接觸式臺(tái)階儀(ET 150,Kosaka Lab,Japan)測(cè)量薄膜基底的厚度。使用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡和能量色散X射線光譜儀(SEM-EDS, SU8100,Hitachi,Japan)表征銀島薄膜的形態(tài)和薄膜表面元素組成及元素分布。使用X射線衍射儀(D8 Advance,Bruker,Germany)表征薄膜基底的化學(xué)組成。使用顯微拉曼光譜儀系統(tǒng)(SR—500I—B1,Andor,England)測(cè)量拉曼光譜，激發(fā)光源為532 nm連續(xù)激光器(Torus, Laser Quantum,England)。

1.4 溶液的配置和Tau蛋白生物傳感器構(gòu)建

三聚氰胺溶液的配制：將50 mg三聚氰胺粉末溶解在500 mL甲醇溶液中，并在300 r/min和60 ℃下攪拌10 min制備得到濃度為100 mg/L的三聚氰胺甲醇溶液。

Tau蛋白檢測(cè)液的配制。用移液槍將濃度為0.2 g/L，規(guī)格為250 μL的Tau蛋白原溶液分裝在25管微量離心管中，每管10 μL。取5管用作配制溶液，使用PBS作為稀釋劑分別配制濃度為500,100,85,70,50,30,15,10,1 mg/L的Tau蛋白溶液保存于冰箱4～6 ℃環(huán)境下備用。

Tau蛋白生物傳感器的構(gòu)建示意圖如圖2所示。系統(tǒng)由激光器、浸泡過(guò)Tau蛋白溶液的薄膜基底、光纖、濾光片、CCD、耦合器、動(dòng)鏡、透鏡、衰減器、拉曼光譜儀和電腦組成。

根據(jù)2017年陜西省統(tǒng)計(jì)年鑒，陜西省有11個(gè)地級(jí)市，按區(qū)域分為3個(gè)地區(qū)：陜南（漢中市、安康市、商洛市）、陜北（延安市、榆林市）、關(guān)中（西安市、銅川市、寶雞市、咸陽(yáng)市、渭南市、楊凌示范區(qū)）。本文主要從這3個(gè)區(qū)域的發(fā)展?fàn)顩r為出發(fā)點(diǎn)對(duì)陜西省區(qū)域協(xié)調(diào)發(fā)展進(jìn)行研究。

圖2 Tau蛋白生物傳感器的構(gòu)建簡(jiǎn)圖

2 結(jié)果與討論

2.1 薄膜基底的形貌

AgNO3的含量直接決定了薄膜上納米結(jié)構(gòu)的形態(tài)。當(dāng)AgNO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9 %時(shí)，還原出的銀納米顆粒平均大小為162.6 nm，如圖3(a)所示;當(dāng)AgNO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17 %時(shí)，迷宮結(jié)構(gòu)銀納米線的平均寬度為277.6 nm，如圖3(b)所示;當(dāng)AgNO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到23 %時(shí)，迷宮結(jié)構(gòu)銀納米線相互連接，平均寬度為282.9 nm,如圖3(c)所示;在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28 % AgNO3薄膜表面，均勻的納米骨架結(jié)構(gòu)呈銀島形狀，平均寬度為291.5 nm，如圖3(d)所示；當(dāng)AgNO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到33 %時(shí)，薄膜表面上的納米結(jié)構(gòu)非常不均勻，產(chǎn)生了大量的凹陷和凸起，平均寬度為348.4 nm，如圖3(e)所示。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的AgNO薄膜基底表面SEM圖和銀島尺寸統(tǒng)計(jì)

PVA熱還原銀離子的化學(xué)反應(yīng)式如(1)所示[13]

-(CH2-CH-OH)n-+Ag+→-(CH2-CH-OAg)n-+H+→-(CH2-C=O)n-+Ag0+H+

(1)

在室溫下，AgNO3溶液與PVA溶液混合后，PVA鏈中的羥基與AgNO3配位，形成螯合物，PVA分子鏈中的強(qiáng)氫鍵斷裂，并且PVA中游離羥基上的孤對(duì)電子可以進(jìn)入Ag+的d或f軌道，形成配位結(jié)構(gòu)。熱處理過(guò)程中，PVA/AgNO3的螯合物逐漸分解， PVA中大量羥基被氧化為羰基，從而還原了銀離子，PVA逐漸消耗和降解，銀納米顆粒進(jìn)一步聚合、相連、融合形成銀島薄膜。

2.2 薄膜基底的增強(qiáng)特性

前期研究表明[14]，用制備的薄膜基底檢測(cè)三聚氰胺時(shí)，當(dāng)AgNO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9 %，17 %，23 %時(shí)，拉曼光譜峰逐漸增強(qiáng)，增強(qiáng)因子也在逐漸變大。AgNO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28 %時(shí)，拉曼信號(hào)在特征峰處強(qiáng)度增強(qiáng)超過(guò)20 000個(gè)單位，增強(qiáng)因子達(dá)到1 149。但是當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)28 %時(shí)，拉曼光譜峰值強(qiáng)度有所下降，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33 %時(shí)增強(qiáng)因子下降為976。

薄膜基底表面的銀島納米結(jié)構(gòu)形成等離子體，在532 nm激光激發(fā)下銀的導(dǎo)帶電子集體振蕩引起局部表面等離子體激元共振(localized surface plasmon resonances,LSPR)。LSPR與入射光的耦合導(dǎo)致在等離子體納米結(jié)構(gòu)周?chē)亩坞妶?chǎng)產(chǎn)生等離子體熱點(diǎn)，有效地將電磁場(chǎng)集中在金屬表面/附近(距離<10 nm)并得到極大增強(qiáng)。這種電磁場(chǎng)的極大增強(qiáng)產(chǎn)生了SERS增強(qiáng)效應(yīng)[15]。隨著AgNO3含量增大，其薄膜表面產(chǎn)生的銀納米顆粒增多，并聚集連接融合成銀島結(jié)構(gòu)，銀島間隙變小，形成的等離子體熱點(diǎn)增多，極大地增強(qiáng)了三聚氰胺分子的拉曼信號(hào)。

由圖3(e)可知，AgNO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33 %的薄膜基底表面由于過(guò)量的銀納米顆粒聚集融合擠壓，形成許多凹陷和凸起，骨架中孔的大小和分布很不均勻，形成的等離子體熱點(diǎn)減少，SERS信號(hào)減弱；凹陷和凸起對(duì)儀器的聚焦也產(chǎn)生了很大影響，使得正向散射增強(qiáng)從而降低了SERS信號(hào)。

綜上分析可知，AgNO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28 %的薄膜基底表面均勻性好，SERS增強(qiáng)因子較高，故選用此薄膜基底來(lái)構(gòu)建Tau蛋白生物傳感器。如圖4所示。

圖4 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28 %的AgNO3薄膜基底拉曼光譜圖

2.3 薄膜基底檢測(cè)Tau蛋白的靈敏度和檢測(cè)限

圖5(a)為薄膜基底上Tau蛋白和PBS緩沖劑的拉曼光譜圖，從圖5(a)中可以明顯看到，PBS緩沖液沒(méi)有明顯的拉曼峰，Tau蛋白溶液在640 cm-1處有最強(qiáng)拉曼峰，因此,選擇此處的拉曼光譜峰作為T(mén)au蛋白的特征峰進(jìn)行分析。

將薄膜基底分別放入20 mL濃度為100，70，50，30，10，1 mg/L的Tau蛋白溶液中浸泡8 h后，使得Tau蛋白質(zhì)分子充分吸附在銀島薄膜表面形成蛋白質(zhì)薄膜，它們的拉曼光譜如圖5(b)所示。當(dāng)Tau蛋白檢測(cè)濃度逐漸降低時(shí)，薄膜基底的拉曼峰值強(qiáng)度逐漸降低。當(dāng)檢測(cè)濃度為100 mg/L時(shí)，特征峰處的SERS信號(hào)強(qiáng)度為2 086；低濃度Tau蛋白的特征峰處的拉曼光譜如圖5(c)所示，當(dāng)檢測(cè)濃度為10 mg/L時(shí)，特征峰處SERS信號(hào)強(qiáng)度為475。當(dāng)Tau蛋白濃度低至1 mg/L時(shí)，特征峰處SERS強(qiáng)度為150左右，依然具有很好的識(shí)別性，能很好地與背景峰進(jìn)行區(qū)分。

圖5 檢測(cè)Tau蛋白的拉曼光譜圖

根據(jù)不同濃度Tau蛋白特征峰處的SERS拉曼強(qiáng)度進(jìn)行“量—效”關(guān)系曲線擬合由圖6(a)所示，在10～100 mg/L濃度范圍之間，薄膜基底檢測(cè)Tau蛋白的拉曼特征峰具有良好的線性關(guān)系，擬合方程為y=17.99x+291.3(x=10～100 mg/L)，相關(guān)系數(shù)為R2=0.997。根據(jù)擬合方程可知，方程的斜率為17.99(a.u./(mg/L)。

為驗(yàn)證Tau蛋白生物傳感器的“量—效”關(guān)系穩(wěn)定性和可靠性，將兩片薄膜基底分別放入濃度為15,85 mg/L的Tau蛋白溶液中浸泡8 h后，測(cè)試其拉曼光譜，驗(yàn)證結(jié)果如圖6(b)所示。由圖可知，這兩個(gè)濃度的SERS信號(hào)強(qiáng)度均勻地落在了擬合曲線的邊緣附近。

圖6 Tau蛋白生物傳感器的“量—效”關(guān)系擬合曲線和驗(yàn)證圖

3 結(jié) 論

本文通過(guò)熱誘導(dǎo)還原銀離子制備銀島薄膜基底，并以此構(gòu)建Tau蛋白生物傳感器。該薄膜基底具有均勻的銀島納米結(jié)構(gòu)，其骨架的平均寬度為281.5 nm。以三聚氰胺為分子探針，該基底展現(xiàn)出良好的增強(qiáng)特性，其EFs可以達(dá)到1 149。以該基底和顯微拉曼測(cè)量系統(tǒng)構(gòu)建Tau蛋白生物傳感器，檢測(cè)Tau蛋白的最低檢測(cè)限可以達(dá)到1 mg/L；在10～100 mg/L范圍內(nèi)，傳感器具有較好的線性關(guān)系；最后對(duì)擬合方程進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證，傳感器表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和可靠性。傳感器中的薄膜基底制備方法簡(jiǎn)單、快速、成本低廉，并且具有良好的增強(qiáng)特性，可以為制備低成本的薄膜基底提供一種新的思路；制備的傳感器能對(duì)低濃度Tau蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)，在通過(guò)檢測(cè)Tau蛋白水平來(lái)早期篩查和診斷AD疾病方面具有很大的潛力。